פרוטוקול זה מתאר שיטה ליצירת כמויות גדולות של מיקרו-נבלות decafluorobutane משומנים באמצעות sonication קצה בדיקה ולאחר מכן עיבוי אותם לתוך nanodroplets פאזה שינוי באמצעות שחול בלחץ גבוה סינון מכני.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור של ננו-טיפות דקפלואורובוטן מסוננות פאמברנה ממיקרו-טבלים מעוצבים מראש
במאמר זה
סיכום
תקציר
ישנן שיטות רבות שניתן להשתמש בהן לייצור טיפות פאזה-shift הניתנות להדמיה וטיפול. כל שיטה משתמשת בטכניקות שונות ומשתנה במחיר, בחומרים ובמטרה. רבות משיטות הייצור הללו גורמות לאוכלוסיות רב-ממדיספרס עם סף הפעלה לא אחיד. בנוסף, שליטה בגדלי הטיפות בדרך כלל דורשת נוזלים יציבים perfluorocarbon עם סף הפעלה גבוה שאינם מעשיים vivo. הפקת גדלי טיפה אחידים באמצעות גזים בנקודת רתיחה נמוכה תועיל לניסויים בהדמיה וטיפול ב- vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה וחסכונית להיווצרות ננו-טיפות הזזת פאזה מיוצבות-שומנים עם נקודת רתיחה נמוכה decafluorobutane (DFB). שיטה נפוצה ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים מתוארת, בנוסף לשיטה חדשנית של עיבוי אותם עם שחול בלחץ גבוה בשלב אחד. שיטה זו נועדה לחסוך זמן, למקסם את היעילות ולייצר כמויות גדולות יותר של פתרונות microbubble וננו-טיפות למגוון רחב של יישומים באמצעות ציוד מעבדה משותף שנמצא במעבדות ביולוגיות רבות.
מבוא
סוכני ניגודיות אולטראסאונד (UCAs) גדלים במהירות בפופולריות עבור יישומי הדמיה וטיפול. Microbubbles, UCAs המקורי, הם כיום סוכני המיינסטרים המשמשים ביישומי אבחון קליניים. Microbubbles הם כדורים מלאים בגז, בדרך כלל 1-10 מיקרומטר קוטר, מוקף שומנים, חלבון, או קליפות פולימר1. עם זאת, גודלם ויציבותם יכולים להגביל את הפונקציונליות שלהם ביישומים רבים. ננו-טיפות פאזה, המכילות ליבה נוזלית מחוממת במיוחד, יכולות להתגבר על חלק מהמגבלות הללו בשל גודלן הקטן יותר ושיפור מחזור החיים2. כאשר הם נחשפים לחום או לאנרגיה אקוסטית, הליבה הנוזלית החמה מתאדה ויוצרת מיקרו-bble גז2,3,4,5.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ביצוע סרטי שומנים בדם
- הכן סרטי שומנים לדור microbubble באמצעות 90% DSPC ו 10% DSPE-PEG2K על ידי ערבוב השומנים ביחס הנכון באמצעות הכיוונים הבאים:
- הפוך שומנים מלאי של DSPC ו DSPE-PEG2K בכלורופורם. שקול 50 מ"ג של כל אבקת שומנים בבקבוקונים נפרדים. הוסף 1 מ"ל של כלורופורם לכל בקבוקון באמצעות מזרק זכוכית 1 מ"ל.
- הוסף 287 μL של מלאי DSPC ו 113 μL של מלאי DSPE-PEG2K (שניהם 50 מ"ג / מ"ל) לתוך בקבוקון נוצץ 20 מ"ל באמצעות מזרק זכוכית.
- יבש את השומנים המעורבים כדי להסיר כלורופורם באמצעות חנקן. באמצעות אורך מתאים של צינורות המחוברים לחנקן הבית, זרימה קלות גז חנקן מעל מרחב הראש של ה- Vial תוך ערבוב. המשך עד שלא נצפה כלורופורם, וסרט השומנים ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאות מייצגות של התפלגות הגודל כלולות באמצעות פיזור אור דינמי (DLS) וניתוח חישת פעימות התנגדותית (TRSP). איור 5 מציג את התפלגות הגודל של פתרונות בועות מרוכזים עם ובלי שחול. ללא שחול, הפרוטוקול מסתיים בשלב 5.3. הבועות המצונן מרוכזות על ידי אוורור המדגם ללחץ אטמוספרי בזמן הקור. המדגם היחיד מרוכז יש הפצה רחבה הרבה יותר מרוכזת ליד 400 ננומטר. המדגם המובלט כולל התפלגות צרה יותר המרוכזת ב- 200 ננומטר. שתי הדגימות כוללות גם ליפוזומים וגם טיפות, שאינן ניתנות להבחנה באמצעות DLS.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
גוף ספרות מקיף זמין הדן בניסוח, בפיזיקה וביישומים פוטנציאליים של מיקרו-יבלות וטיפות פאזה-הסטה להדמיה וטיפול ב- vivo. דיון זה נוגע במפורש ליצירת מיקרו-חלוקי שומנים ולהמרתם לטירות משנה-מיקרון של העברת פאזה באמצעות גז DFB של נקודת רתיחה נמוכה ושחול בלחץ גבוה. השיטה המתוארת כאן נועדה לספק שיטה פשוטה יחסית של ייצור כמויות גדולות של microbubbles שומנים טיפות פאזה DFB על ידי שילוב שיטות עיבוי microbubble קודמות עם שחול טיפה בשלב אחד. שיטה זו יש את היתרון של יצירת ריכוזים גבוהים של בועות המשמשות ליצירת טיפות DFB עם התפלגות גודל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לדומיניק ג'יימס במעבדתו של ד"ר קן הויט על שסיפק ניתוח TRSP של ננו-טיפות פאזה-הסטה בלתי ניתנות לערפדיות
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות צנטריפוגה 15 מ"ל | Falcon | 352095 | איסוף וצנטריפוגה |
| טיפות 200 ננומטר מסנן פוליקרבונט | Whatman | 110606 | מסנני מכבש |
| 2-מתילבוטן | פישר כימיקל | 03551-4 | קירור מוקדם מהיר של תמיסת מיקרו-בועות לפני שחול |
| מהדקים 3 שיניים X2 | Fisher | 02-217-002 | החזקת בקבוקוני ניצוץ במקום לסוניקציה של קצה בדיקה |
| 400W סוניקטור קצה בדיקה אנלוגי עם קרן | ברנסון | 101-063-198R | משמש ליצירת מיקרו-בועות שומנים מתמיסת שומנים |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | משמש לסיוע בפירוק ליפוזומים לשלפוחיות חד-כילמלאריות |
| כלורופורם | פישר ביוריאגנטים | C298-4 | משמש לייצור סרט שומנים להכנת מיקרו-בועות |
| דקפלואורובוטן (פרפלואורובוטן) גז | פלואורומד L.P. | 1 ק"ג | יצירת מיקרו-בועות באמצעות סוניקציה של קצה בדיקה |
| קרח יבש | - | קירור מוקדם מהיר של תמיסת מיקרו-בועות לפני שחול | |
| אבקת שומנים DSPC NOF | America | COATSOME MC-8080 | רכיב של סרט שומנים |
| DSPE-PEG-2K אבקת ליפידים | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | רכיב של סרט שומנים |
| מדחום כללי | - | - | משמש למדידת טמפרטורת אמבט קרח וטמפרטורת 2-מתילבוטן (צריך להתאים לטמפרטורות של -20C) |
| מזרקי זכוכית | המילטון | 81139 | משמש לערבוב שומנים בכלורופורם |
| גליצרול | פישר ביוריאגנטים | BP229-1 | מפחית את טמפרטורת ההקפאה של תמיסת PBS |
| בלוק חימום | VWR מוצרים | חימום סרטי שומנים וטיפות אידוי | |
| ליפקס 10 mL Extruder | Evonik | מערכת שחול מסחרית בלחץ גבוה | |
| מיני מערבולת מיקסר | פישר מותג | 14-955-151 | משמש להסרת עודפי כלורופורם מסרטי שומנים |
| מיכל חנקן | - | משמש להפעלת מכבש | |
| מאגר פוספט מלוח | פישר מדעי | הידראט סרטי ליפידים וטיפות | |
| כביסה דיסק | ניקוז פוליאסטרWhatman | 230600 | מספק תמיכה במסנן פוליקרבונט |
| מכסי פוליפרופילן | פישר 298417 מדעי | המשמש לאחסון תמיסות | |
| פרופילן גליקול | פישר כימי | P355-1 | מפחית את טמפרטורת ההקפאה של תמיסת PBS |
| בקבוקוני נצנוץ | DWK מדעי החיים וויטון | 986532 | משמש לסרטי שומנים ויצירת מיקרו-בועות |
| קטן פטיש | - | משמש | לפירוק קרח יבש לקירור מתילבוטן |
| סוניקטור מיקרוטיפ מצורף | ברנסון | 101148070 | משמש ליצירת מיקרו-בועות מתמיסת שומנים |
| מיכל פלדה | Medegen | 79310 | קירור מוקדם מהיר של תמיסת מיקרו-בועות לפני שחול (כל מיכל מדורג ל-20C יעבוד) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | מסיר עודפי כלורופורם מסרטי שומנים |
| 2 מ"ל צינור צנטריפוגה | פישר | 02682004 | משמש לריכוז ננו-טיפות |
מקורות
- Sirsi, S., Borden, M. Microbubble compositions, properties and biomedical applications. Bubble Science Engineering and Technology. 1 (1-2), 3-17 (2009).
- Sheeran, P. S., Dayton, P. A. Phase-change contrast agents for imaging and therapy. Current ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
