מאמר שיטה

הערכה וכימות של פערים מיקרו-אפיתל ברירית המעי הגס באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

DOI:

10.3791/62204

⸱

11 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אפיתל המצפים את רירית המעי יוצרים מחסום פיזי המפריד בין תכולת הלומינל לבין האינטרסטיציום. פגיעה במחסום האפיתל נקשרה להתפתחות פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD). ברירית המודלקת, שחיקות שטחיות או מיקרו-שחיקה המשחיתות את שכבות האפיתל תואמות לאתרים בעלי חדירות גבוהה. מספר מנגנונים היו מעורבים בהיווצרות מיקרו-שחיקה, כולל שפיכת תאים ואפופטוזיס. מיקרו-שחיקה זו מייצגת לעתים קרובות פערי אפיתל מיקרוסקופיים המפוזרים באופן אקראי במעי הגס. הדמיה וכימות של פערי האפיתל הללו התגלו ככלי חשוב לחקירת תפקוד מחסום האפיתל במעי. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס. שימוש נוסף בסמני מוות תאים גילה כי HPR מקיף מוקדים אפופטוטיים שבהם מתרחשת שחול/נשירה של אפיתל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה פשוטה אך יעילה להמחשה וכימות של מיקרו-שחיקה במעי, שהיא כלי שימושי מאוד במודלים של מחלות, שבהם מחסום האפיתל של המעי נפגע.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רירית מערכת העיכול (GI) יוצרת מחסום פיזי המפריד בין הסביבה החוץ-תאית לסביבה המארחת הפנימית, ומעורבת בספיגת חומרים מזינים, מים ואלקטרוליטים. מחסום המעי מקיף שכבת ריר המורכבת מגליקופרוטאינים, שכבה אחת של תאי אפיתל, והלמינה פרופריה הבסיסית הם תאי חיסון וסטרומה. תאי אפיתל המעי היוצרים את המחסום הפיזי מקושרים זה לזה על ידי קומפלקסים חלבונים שונים, הכוללים את צומת הדבקים (AJ), הצומת ההדוק (TJ) והדסמוזומים (DMs). ליקוי בתפקוד מחסום האפיתל מגביר את חדירות המעיים ומאפשר העברה של חומרים מזיקים ופתוגנים מהלומן לאינטרסטיציום1. יש מספר הולך וגדל של מחלות שבהן מחסום האפיתל נפגע, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) כמו מחלת קרוהן (CD), קוליטיס כיבית (UC) וקוליטיס לא מוגדרת (IC). שכיחות IBD עולה ברחבי העולם, עם שכיחות המתקרבת ל-0.5% במערב. למרות שהגורמים ל-IBD אינם ברורים, התגובה החיסונית/דלקתית המוגזמת המופעלת בדופן המעי תורמת ישירות לשיבוש מחסום האפיתל על ידי הגבלת ההקמה מחדש של הומאוסטזיס אפיתל במעי 2,3,4. בנוסף, חולים עם דלקת מעי גס ממושכת נמצאים בסיכון גבוה לפתח סרטן המעי הגס (CRC)5. פתולוגיות אחרות הקשורות להפרעה במחסום האפיתל במעי הן תסמונת המעי הרגיז, השמנת יתר, מחלת צליאק, רגישות לגלוטן שאינה צליאק ואלרגיות למזון6. מסיבות אלה, יש צורך דחוף בפיתוח גישות ניסיוניות המאפשרות ניתוח של שלמות מחסום האפיתל במעי במודלים של בעלי חיים המחקים את הפתוגנזה המתרחשת בבני אדם.

כאן, הערכנו את החדירות הפרה-תאית הפסיבית במערכת העיכול ואת החדירות הטרנס-תאית הקשורה לתהליך דלקתי באפיתל המעי הגס באמצעות טכניקה פשוטה. כדי לחקור את הזרימה הטרנסמורלית של מקרומולקולות, מדדנו את הדיפוזיה הפסיבית של FITC-dextan (4 kDa) ו-RITC-dextan (10 kDa) בשקי המעי הגס ex vivo. יתר על כן, על ידי הזרקת דקסטרן פלואורסצנטי של 10 kDa הניתן לתיקון ליזין ללומן של שקי המעי, זיהינו באופן ספציפי את האזורים עם חדירות גבוהה ברירית המודלקת. השימוש בסמני אפופטוזיס ונוגדנים כנגד חלבוני AJ איפשר לנו להוכיח שאזורים בעלי חדירות גבוהה ברירית המודלקת תואמים לאזורים ספציפיים שבהם תאי אפיתל עוברים אפופטוזיס וצמתים בין תאים מופרעים. ניתן להשתמש בטכניקה חדשה זו כדי להעריך את שלמות האפיתל בכל מודל שבו מחסום האפיתל של המעי נפגע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (CICUAL).

1. הכנת חומרים וריאגנטים

  1. יש לחמם מראש את תמיסת הרטמן (130 מ"מ NaCl, 28 מ"מ לקטט, 4 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ CaCl2) ל-37 מעלות צלזיוס תוך בעבוע עם 95% O2/5% CO2. שמור על pH פיזיולוגי (7.4) לתמיסה.
  2. לניתוח החדירות הפרה-תאית הפסיבית, הכינו פתרון עבודה על ידי המסה של 1 מ"ג/מ"ל של FITC-Dextran (4 kDa) ו-1 מ"ג/מ"ל של RITC-Dextran (10 kDa) בתמיסת הרטמן שחוממה מראש.
  3. הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם/מ"ל של Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) בתמיסה של הרטמן. אחסן פתרונות עבודה בצינור חרוטי של 15 מ"ל והגן מפני האור עד לשימוש.
    הערה: יהיה צורך ב-300 מיקרוליטר של תמיסת עבודה לכל מעי גס.
  4. הכן תפר כירורגי על ידי חיתוך שני חלקים של 5 ס"מ לכל מעי גס. לולאה את התפרים לקשר לא סגור.

2. דיסקציה והכנה של הטראק במערכת העיכול

  1. יש למנוע מזון מוצק למשך 6 שעות לפני המתת חסד של העכברים. ספק מי שתייה אד ליביטום.
    הערה: במידת האפשר, יש להניח את העכברים על תוספי ג'ל תזונתיים (מים מטוהרים, דבשה, דלעת, סירופ תירס, זרעי חמניות, חלבון חיטה, שמן צמחי, חומצת מזון, הידרוקולואידים, אלקטרוליטים, סיבי תירס, תערובת מינרלים NIH-31M, תערובת ויטמינים NIH-31M).
  2. המתת חסד של עכברים בתא CO2 ואחריו פריקת צוואר הרחם בהתאם לפרוטוקולי האתיקה המוסדיים.
  3. עקר את הבטן ובית החזה עם 70% אתנול.
  4. בעזרת מספריים מבצעים חתך באמצע הבטן וחושפים את חלל הצפק.
  5. למטרות התמצאות, הפרד ונתח את המעי הגס על ידי חיתוך בקצה המעי הדק (החלק הסופי של האילאום) ממש לפני הצקום ולאחר מכן בקצה פי הטבעת. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי להסיר בעדינות את המזנטריה ולהניח את המעי הגס בתמיסה של הרטמן.
  6. חשוב לציין, על מנת לשמור על עקביות בין בעלי חיים, זהה קטעים דומים והשתמש בהם כדי להעריך חדירות. מומלץ מאוד להשתמש באזורים הקרובים ל-cecum.
  7. השתמש במזרק אינסולין המצויד בצינורית פלסטיק קהה כדי לשטוף בעדינות את תכולת הלומינל הקיימת במעי הגס. אם הצואה יציבה, דחף בזהירות בעזרת מלקחיים קהים. לאחר הסרת הצואה יש לשטוף 3 פעמים עם 400 מיקרוליטר מתמיסת הרטמן.
  8. קושרים את האזור הפרוקסימלי (הקרוב ביותר לצקום) ומניחים לולאת תפר קשורה מראש באזור הדיסטלי של המעי הגס. בעזרת מזרק המצויד בצינורית פלסטיק קהה, מלאו את שק המעי בתמיסה המכילה את בדיקת התשוקה. הסר בזהירות את צינורית הפלסטיק וקשר את הלולאה באזור הדיסטלי.
  9. הנח את שק המעי בצינור חרוטי של 15 מ"ל עם 6 מ"ל של תמיסת הרטמן ודגר למשך שעה אחת כדי להעריך את הזרימה הפרה-תאית הפסיבית של FITC/RITC-Dextran או 30 דקות כדי לנתח את הזרימה של Alexa Fluor Fixable-Dextran.
    1. שמור על הצינורות החרוטיים המכילים את שקי המעיים ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 והגן מפני אור.
  10. למדוד את החדירות הפסיבית באמצעות FITC/RITC-Dextran. ב-0 ו-60 דקות, קח דגימה של 100 מיקרוליטר מהצינור החרוטי והעביר לצלחת של 96 בארות. הוסף בחזרה 100 מיקרוליטר של מדיה טרייה כדי להחליף את אמצעי האחסון שאבד.
  11. מדידת דגימות ותקנים עבור FITC/RITC בקורא לוחות פלואורסצנטיים (עירור/פליטה של FITC: 495 ננומטר/519 ננומטר; עירור/פליטה של RITC: 570/595 ננומטר).
  12. כדי למדוד את החדירות הפסיבית באמצעות Alexa Fluor 647 Fixable-Dextran, הסר את המעיים, חתוך קרוב לקשר הקשירה הכירורגי וחתוך את המעי כדי לחשוף את הלומן כדי להסיר את התמיסה עם הבדיקה. שוטפים את לומן המעי פעמיים בתמיסת הרטמן קרה.
  13. הנח את הרקמה בתבנית רקמה שמולאה בעבר בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (O.C.T). כוון את הרקמה אנכית או אופקית בהתאם לצד שיש לחתך. אחסן את הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית

  1. תקן חלקים קפואים של 20 מיקרומטר עם 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן שטוף 3 פעמים עם מי מלח חוצץ פוספט קר (PBS; 37 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4 ו-1.8 מ"מ KH2 PO4).
    הערה: חלקים אנכיים מהמעיים נוטים לרדת אם השטיפות חזקות מאוד.
  2. יש לחלחל עם 0.2% TX-100/PBS למשך 12 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS קר.
  3. יש לחסום עם 0.2% BSA/PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  4. יש לדלל את הנוגדן העיקרי בתמיסת החסימה ולדגור למשך שעה בטמפרטורת החדר. שוטפים 3 פעמים עם PBS קר.
  5. דגירה למשך שעה אחת עם נוגדנים משניים בתמיסת חסימה. שוטפים 3 פעמים עם PBS קר.
  6. מרחו מדיום הרכבה על החתכים ואטמו בעזרת כיסוי. ניתן לאחסן את השקופיות עד 3 חודשים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברירית המודלקת, שחיקה שטחית או מיקרו-שחיקה פוגעת בשלמות חד-שכבת תא האפיתל ומייצגת אתרים בעלי חדירות גבוהה 7,8. כדי להעריך אפשרויות כאלה, ניתחנו את החדירות הפסיבית ברירית המעי הגס המודלקת במודל עכברי קוליטיס נתרן גופרתי דקסטרן. בקצרה, במשך 5 ימים, עכברי C57BL/6J קיבלו 2.5% DSS (w/v, 40-50 kDa) מומס במי שתייה. מודל זה מאופיין בגרימת נזק לתאי אפיתל ותפקוד לקוי של מחסום האפיתל במעי הגס, מה שבתורו מאפשר כניסה של אנטיגנים לומינליים ללמינה פרופריה. תהליך כזה מביא לגירוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הומאוסטזיס אפיתל הנובע מאיזון התפשטות התאים ואפופטוזיס אפיתל שומר על מחסום מעיים תקין ותפקודי. הפרעות קליניות רבות, כגון IBD, מלוות או מאופיינות בשינויים בחדירות המעי, דלקת ברירית והפרעה בהומאוסטזיס האפיתל1. יחסי הגומלין בין התהליכים הללו עדיין שנויים במחלוקת. לכן, פיתוח גישות מחקר חדשות לחקירה נכונה של תהליכים אלה הוא נושא חשוב בתחום. ישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו זמינים למחקר עקיף של חדירות המעיים במהלך דלקת, כגון מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית בחד-שכבות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך בחלקו על ידי מענק SEP-Conacyt (מס' 179 ל-NV/PND) ונתמך על ידי המימון המגזרי למחקר וחינוך באמצעות מענק למדע בסיסי מ-Conacyt (מס' A1-S-20887 ל-PND). אנו רוצים להביע את תודתנו לנורמה טרחו, M.V.Z. ראול קסטרו לונה, M.C. לאונל מרטינז, פליפה קרוז מרטינז, ויקטור מנואל גרסיה גומז ו-M.V.Z. ריקרדו גקסיולה סנטנו על עזרתם ועזרתם הטכנית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
נוגדן Caspase-3 פעיל (1:1000)איתות תאים9664קספאז-3 שסוע (Asp175)(5AE1) ארנב mAb
Alexa Fluor 488  אנטי ארנב (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 אנטי חולדה (1:1000)InvitrogenA21209
מיקרוסקופ קונפוקלי (Leica TCS SP8x)LeicaHyD  ולייזר אור לבן
נוגדן E-Cadherin (1:750)SigmaMABT26Rat חד-שבטי Delma-1 נוגדן
אתנול 70%גנרי
קבוע-DextranInvitrogenD22914Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, אניוני, ניתן לתיקון
FITC DextranSigma46944פלואורסצאין איזותיוציאנט– dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's SolutionPiSAHT PiSA Incubator
(AutoFlow NU-8500)Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell שחור ולבן פלטת פוליסטירןThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
פלואידין (1:1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC DextranSigmaR8881-100MGRhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
נוגדנים משניים (1:10000)מעבדות Jackson ImmunoResearch נוגדניםמשניים מצומדים HRP
חוטי תפריםגנריופוליאסטר קלוע עדיפים תפרים כירורגיים.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb anti-ZO-1
גלאי משי קלוע

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 281 (1), 216-228 (2001).
  3. Negroni, A., Cucchiara, S., Stronati, L. Apoptosis, Necrosis, and Necroptosis in the Gut and Intestinal Homeostasis. Mediators of Inflammation. 2015, 250762(2015).
  4. Nava, P., et al. Interferon-γ regulates intestinal epithelial homeostasis through converging β-catenin signaling pathways. Immunity. 32 (3), 392-402 (2010).
  5. Choi, C. -H. R., Bakir, I. A., Hart, A. L., Graham, T. A. Clonal evolution of colorectal cancer in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (4), 218-229 (2017).
  6. González-González, M., Díaz-Zepeda, C., Eyzaguirre-Velásquez, J., González-Arancibia, C., Bravo, J. A., Julio-Pieper, M. Investigating Gut Permeability in Animal Models of Disease. Frontiers in Physiology. 9, (2019).
  7. Poulsen, S. S., Pedersen, N. T., Jarnum, S. "Microerosions" in rectal biopsies in Crohn's disease. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 19 (5), 607-612 (1984).
  8. Neumann, H., et al. Assessment of Crohn's disease activity by confocal laser endomicroscopy. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (12), 2261-2269 (2012).
  9. Laroui, H., et al. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  10. John, L. J., Fromm, M., Schulzke, J. -D. Epithelial barriers in intestinal inflammation. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1255-1270 (2011).
  11. Su, L., et al. TNFR2 activates MLCK-dependent tight junction dysregulation to cause apoptosis-mediated barrier loss and experimental colitis. Gastroenterology. 145 (2), 407-415 (2013).
  12. Mateer, S. W., Cardona, J., Marks, E., Goggin, B. J., Hua, S., Keely, S. Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53250(2016).
  13. Devraj, K., Guérit, S., Macas, J., Reiss, Y. An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e57038(2018).
  14. Stamatovic, S. M., Johnson, A. M., Sladojevic, N., Keep, R. F., Andjelkovic, A. V. Endocytosis of tight junction proteins and the regulation of degradation and recycling. Annals of the New York Academy of Sciences. 1397 (1), 54-65 (2017).
  15. Srinivasan, B., et al. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  16. Pearce, S. C., et al. Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types. BMC Biology. 16 (1), 19(2018).
  17. Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים