Method Article

הערכה וכימות של פערים מיקרו-אפיתל ברירית המעי הגס באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית

DOI:

10.3791/62204

⸱

June 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Departamento de Fisiología, Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 2Departamento de Biomedicina Molecular, del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados (CINVESTAV), 3Unidad de Investigación Epidemiológica en Endocrinología, y Nutrición (UIEEN), Hospital Infantil de México Federico Gomez, 4Laboratorio de Investigación en Inmunología y Proteómica, Hospital Infantil de México Federico Gómez

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי אפיתל המצפים את רירית המעי יוצרים מחסום פיזי המפריד בין תכולת הלומינל לבין האינטרסטיציום. פגיעה במחסום האפיתל נקשרה להתפתחות פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD). ברירית המודלקת, שחיקות שטחיות או מיקרו-שחיקה המשחיתות את שכבות האפיתל תואמות לאתרים בעלי חדירות גבוהה. מספר מנגנונים היו מעורבים בהיווצרות מיקרו-שחיקה, כולל שפיכת תאים ואפופטוזיס. מיקרו-שחיקה זו מייצגת לעתים קרובות פערי אפיתל מיקרוסקופיים המפוזרים באופן אקראי במעי הגס. הדמיה וכימות של פערי האפיתל הללו התגלו ככלי חשוב לחקירת תפקוד מחסום האפיתל במעי. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס. שימוש נוסף בסמני מוות תאים גילה כי HPR מקיף מוקדים אפופטוטיים שבהם מתרחשת שחול/נשירה של אפיתל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה פשוטה אך יעילה להמחשה וכימות של מיקרו-שחיקה במעי, שהיא כלי שימושי מאוד במודלים של מחלות, שבהם מחסום האפיתל של המעי נפגע.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רירית מערכת העיכול (GI) יוצרת מחסום פיזי המפריד בין הסביבה החוץ-תאית לסביבה המארחת הפנימית, ומעורבת בספיגת חומרים מזינים, מים ואלקטרוליטים. מחסום המעי מקיף שכבת ריר המורכבת מגליקופרוטאינים, שכבה אחת של תאי אפיתל, והלמינה פרופריה הבסיסית הם תאי חיסון וסטרומה. תאי אפיתל המעי היוצרים את המחסום הפיזי מקושרים זה לזה על ידי קומפלקסים חלבונים שונים, הכוללים את צומת הדבקים (AJ), הצומת ההדוק (TJ) והדסמוזומים (DMs). ליקוי בתפקוד מחסום האפיתל מגביר את חדירות המעיים ומאפשר העברה של חומרים מזיקים ופתוגנים מהלומן לאינטרסטיציום1. יש מספר הולך וגדל של מחלות שבהן מחסום האפיתל נפגע, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) כמו מחלת קרוהן (C....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (CICUAL).

1. הכנת חומרים וריאגנטים

  1. יש לחמם מראש את תמיסת הרטמן (130 מ"מ NaCl, 28 מ"מ לקטט, 4 מ"מ KCl, 1.5 מ"מ CaCl2) ל-37 מעלות צלזיוס תוך בעבוע עם 95% O2/5% CO2. שמור על pH פיזיולוגי (7.4) לתמיסה.
  2. לניתוח החדירות הפרה-תאית הפסיבית, הכינו פתרון עבודה על ידי המסה של 1 מ"ג/מ"ל של FITC-Dextran (4 kDa) ו-1 מ"ג/מ"ל של RITC-Dextran (10 kDa) בתמיסת הרטמן שחוממה מראש.
  3. הכן תמיסה של 4 מיקרוגרם/מ"ל של Alexa Fluor647 Fixable-Dextran (10 kDa) בתמיסה של הרטמן. אחסן פתרונות עבודה בצינור חר....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברירית המודלקת, שחיקה שטחית או מיקרו-שחיקה פוגעת בשלמות חד-שכבת תא האפיתל ומייצגת אתרים בעלי חדירות גבוהה 7,8. כדי להעריך אפשרויות כאלה, ניתחנו את החדירות הפסיבית ברירית המעי הגס המודלקת במודל עכברי קוליטיס נתרן גופרתי דקסטרן. בקצרה, במשך 5 ימים, עכברי C57BL/6J קיבלו 2.5% DSS (w/v, 40-50 kDa) מומס במי שתייה. מודל זה מאופיין בגרימת נזק לתאי אפיתל ותפקוד לקוי של מחסום האפיתל במעי הגס, מה שבתורו מאפשר כניסה של אנטיגנים לומינליים ללמינה פרופריה. תהליך כזה מביא לגירוי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הומאוסטזיס אפיתל הנובע מאיזון התפשטות התאים ואפופטוזיס אפיתל שומר על מחסום מעיים תקין ותפקודי. הפרעות קליניות רבות, כגון IBD, מלוות או מאופיינות בשינויים בחדירות המעי, דלקת ברירית והפרעה בהומאוסטזיס האפיתל1. יחסי הגומלין בין התהליכים הללו עדיין שנויים במחלוקת. לכן, פיתוח גישות מחקר חדשות לחקירה נכונה של תהליכים אלה הוא נושא חשוב בתחום. ישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו זמינים למחקר עקיף של חדירות המעיים במהלך דלקת, כגון מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית בחד-שכבות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר נתמך בחלקו על ידי מענק SEP-Conacyt (מס' 179 ל-NV/PND) ונתמך על ידי המימון המגזרי למחקר וחינוך באמצעות מענק למדע בסיסי מ-Conacyt (מס' A1-S-20887 ל-PND). אנו רוצים להביע את תודתנו לנורמה טרחו, M.V.Z. ראול קסטרו לונה, M.C. לאונל מרטינז, פליפה קרוז מרטינז, ויקטור מנואל גרסיה גומז ו-M.V.Z. ריקרדו גקסיולה סנטנו על עזרתם ועזרתם הטכנית.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נוגדן Caspase-3 פעיל (1:1000)איתות תאים9664קספאז-3 שסוע (Asp175)(5AE1) ארנב mAb
Alexa Fluor 488  אנטי ארנב (1:1000)InvitrogenA21206
Alexa Fluor 594 אנטי חולדה (1:1000)InvitrogenA21209
מיקרוסקופ קונפוקלי (Leica TCS SP8x)LeicaHyD  ולייזר אור לבן
נוגדן E-Cadherin (1:750)SigmaMABT26Rat חד-שבטי Delma-1 נוגדן
אתנול 70%גנרי
קבוע-DextranInvitrogenD22914Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, אניוני, ניתן לתיקון
FITC DextranSigma46944פלואורסצאין איזותיוציאנט– dextran M. Wt. 4 kDa
Hartmann's SolutionPiSAHT PiSA Incubator
(AutoFlow NU-8500)Nuaire
Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO)Tecan
Nunc F96 MicroWell שחור ולבן פלטת פוליסטירןThermoFisher Scientific
ParaformaldehydeSigmaP6148
פלואידין (1:1000)InvitrogenA12380Alexa Fluor 568 Phalloidin
RITC DextranSigmaR8881-100MGRhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa
נוגדנים משניים (1:10000)מעבדות Jackson ImmunoResearch נוגדניםמשניים מצומדים HRP
חוטי תפריםגנריופוליאסטר קלוע עדיפים תפרים כירורגיים.
ZO-1 (1:1000)Invitrogen40-2200Rb anti-ZO-1
גלאי משי קלוע

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. König, J., et al. Human Intestinal Barrier Function in Health and Disease. Clinical and Translational Gastroenterology. 7 (10), 196(2016).
  2. Gassler, N., et al. Inflammatory bowel d....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial GapsColonic MucosaImmunofluorescence StainingEpithelial BarrierMicro ErosionsIntestinal PermeabilityCell SheddingApoptotic FociFluorescent DyeBarrier Function
Video Coming Soon

Related Articles