כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס.
תאי אפיתל המצפים את רירית המעי יוצרים מחסום פיזי המפריד בין תכולת הלומינל לבין האינטרסטיציום. פגיעה במחסום האפיתל נקשרה להתפתחות פתולוגיות שונות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD). ברירית המודלקת, שחיקות שטחיות או מיקרו-שחיקה המשחיתות את שכבות האפיתל תואמות לאתרים בעלי חדירות גבוהה. מספר מנגנונים היו מעורבים בהיווצרות מיקרו-שחיקה, כולל שפיכת תאים ואפופטוזיס. מיקרו-שחיקה זו מייצגת לעתים קרובות פערי אפיתל מיקרוסקופיים המפוזרים באופן אקראי במעי הגס. הדמיה וכימות של פערי האפיתל הללו התגלו ככלי חשוב לחקירת תפקוד מחסום האפיתל במעי. כאן, אנו מתארים שיטה חדשה להמחשת המיקום הספציפי שבו החדירות הטרנס-תאית והפרא-תאית מוגברת ברירית המעי הגס המודלקת. בבדיקה זו, אנו מיישמים צבע פלואורסצנטי של 10 kDa מצומד לדקסטרן הניתן לתיקון ליזין כדי לדמיין אזורי חדירות גבוהה (HPR) ברירית המעי הגס. שימוש נוסף בסמני מוות תאים גילה כי HPR מקיף מוקדים אפופטוטיים שבהם מתרחשת שחול/נשירה של אפיתל. הפרוטוקול המתואר כאן מספק גישה פשוטה אך יעילה להמחשה וכימות של מיקרו-שחיקה במעי, שהיא כלי שימושי מאוד במודלים של מחלות, שבהם מחסום האפיתל של המעי נפגע.
רירית מערכת העיכול (GI) יוצרת מחסום פיזי המפריד בין הסביבה החוץ-תאית לסביבה המארחת הפנימית, ומעורבת בספיגת חומרים מזינים, מים ואלקטרוליטים. מחסום המעי מקיף שכבת ריר המורכבת מגליקופרוטאינים, שכבה אחת של תאי אפיתל, והלמינה פרופריה הבסיסית הם תאי חיסון וסטרומה. תאי אפיתל המעי היוצרים את המחסום הפיזי מקושרים זה לזה על ידי קומפלקסים חלבונים שונים, הכוללים את צומת הדבקים (AJ), הצומת ההדוק (TJ) והדסמוזומים (DMs). ליקוי בתפקוד מחסום האפיתל מגביר את חדירות המעיים ומאפשר העברה של חומרים מזיקים ופתוגנים מהלומן לאינטרסטיציום1. יש מספר הולך וגדל של מחלות שבהן מחסום האפיתל נפגע, כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) כמו מחלת קרוהן (C....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הנהלים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (CICUAL).
1. הכנת חומרים וריאגנטים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ברירית המודלקת, שחיקה שטחית או מיקרו-שחיקה פוגעת בשלמות חד-שכבת תא האפיתל ומייצגת אתרים בעלי חדירות גבוהה 7,8. כדי להעריך אפשרויות כאלה, ניתחנו את החדירות הפסיבית ברירית המעי הגס המודלקת במודל עכברי קוליטיס נתרן גופרתי דקסטרן. בקצרה, במשך 5 ימים, עכברי C57BL/6J קיבלו 2.5% DSS (w/v, 40-50 kDa) מומס במי שתייה. מודל זה מאופיין בגרימת נזק לתאי אפיתל ותפקוד לקוי של מחסום האפיתל במעי הגס, מה שבתורו מאפשר כניסה של אנטיגנים לומינליים ללמינה פרופריה. תהליך כזה מביא לגירוי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הומאוסטזיס אפיתל הנובע מאיזון התפשטות התאים ואפופטוזיס אפיתל שומר על מחסום מעיים תקין ותפקודי. הפרעות קליניות רבות, כגון IBD, מלוות או מאופיינות בשינויים בחדירות המעי, דלקת ברירית והפרעה בהומאוסטזיס האפיתל1. יחסי הגומלין בין התהליכים הללו עדיין שנויים במחלוקת. לכן, פיתוח גישות מחקר חדשות לחקירה נכונה של תהליכים אלה הוא נושא חשוב בתחום. ישנם מספר פרוטוקולים שפורסמו זמינים למחקר עקיף של חדירות המעיים במהלך דלקת, כגון מדידת ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתליאלית בחד-שכבות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין מה לחשוף.
המחקר נתמך בחלקו על ידי מענק SEP-Conacyt (מס' 179 ל-NV/PND) ונתמך על ידי המימון המגזרי למחקר וחינוך באמצעות מענק למדע בסיסי מ-Conacyt (מס' A1-S-20887 ל-PND). אנו רוצים להביע את תודתנו לנורמה טרחו, M.V.Z. ראול קסטרו לונה, M.C. לאונל מרטינז, פליפה קרוז מרטינז, ויקטור מנואל גרסיה גומז ו-M.V.Z. ריקרדו גקסיולה סנטנו על עזרתם ועזרתם הטכנית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן Caspase-3 פעיל (1:1000) | איתות תאים | 9664 | קספאז-3 שסוע (Asp175)(5AE1) ארנב mAb |
| Alexa Fluor 488 אנטי ארנב (1:1000) | Invitrogen | A21206 | |
| Alexa Fluor 594 אנטי חולדה (1:1000) | Invitrogen | A21209 | |
| מיקרוסקופ קונפוקלי (Leica TCS SP8x) | Leica | HyD ולייזר אור לבן | |
| נוגדן E-Cadherin (1:750) | Sigma | MABT26 | Rat חד-שבטי Delma-1 נוגדן |
| אתנול 70% | גנרי | ||
| קבוע-Dextran | Invitrogen | D22914 | Dextran, Alexa Fluor, 10,000 MW, אניוני, ניתן לתיקון |
| FITC Dextran | Sigma | 46944 | פלואורסצאין איזותיוציאנט– dextran M. Wt. 4 kDa |
| Hartmann's Solution | PiSA | HT PiSA Incubator | |
| (AutoFlow NU-8500) | Nuaire | ||
| Microplate reader (Tecan Infinite 200 PRO) | Tecan | ||
| Nunc F96 MicroWell שחור ולבן פלטת פוליסטירן | ThermoFisher Scientific | ||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| פלואידין (1:1000) | Invitrogen | A12380 | Alexa Fluor 568 Phalloidin |
| RITC Dextran | Sigma | R8881-100MG | Rhodamine B Isothiocyanate-Dextran. M. Wt. 10 kDa |
| נוגדנים משניים (1:10000) | מעבדות Jackson ImmunoResearch נוגדנים | משניים מצומדים HRP | |
| חוטי תפרים | גנרי | ופוליאסטר קלוע עדיפים תפרים כירורגיים. | |
| ZO-1 (1:1000) | Invitrogen | 40-2200 | Rb anti-ZO-1 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב