Method Article

התבוננות בתפקוד אי ואינטראקציות תא חיסוני איון בפרוסות רקמת הלבלב חי

DOI:

10.3791/62207

⸱

April 12th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Immunology, and Laboratory Medicine, University of Florida, 2Paul Langerhans Institute Dresden (PLID) of the Helmholtz Zentrum München at the University Clinic Carl Gustav Carus of Technische Universität Dresden, 3Institute of Physiology, Faculty of Medicine, Technische Universität Dresden, 4German Center for Diabetes Research (DZD), 5J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, University of Florida

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מציג את היישום של פרוסות רקמת לבלב חי לחקר פיזיולוגיה של איון ואינטראקציות תא חיסוני איון.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוסות רקמת לבלב חיות מאפשרות לחקור פיזיולוגיה ותפקוד של איון בהקשר של מיקרו-סביבה שלמה של אי. פרוסות מוכנות מרקמת לבלב אנושית ועכבר חיה המוטבעת באגרוז וחותכת באמצעות ויברטום. שיטה זו מאפשרת לרקמה לשמור על כדאיות ותפקוד בנוסף לשימור פתולוגיות הבסיסיות כגון סוג 1 (T1D) וסוכרת מסוג 2 (T2D). שיטת הפרוסה מאפשרת כיוונים חדשים בחקר הלבלב באמצעות תחזוקת המבנים המורכבים ואינטראקציות בין-תאיות שונות המרכיבות את הרקמות האנדוקריניות והאקסוקריניות של הלבלב. פרוטוקול זה מדגים כיצד לבצע כתמים ומיקרוסקופיה בזמן לשגות של תאי מערכת החיסון אנדוגני חיים בתוך פרוסות הלבלב יחד עם הערכות של פיזיולוגיה של אי. יתר על כן, גישה זו יכולה להיות מעודנת כדי להבחין אוכלוסיות תאי החיסון ספציפיים עבור אנטיגנים תאי אי באמצעות ריאגנטים מורכבים-multimer היסטו-תאימות גדולה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעורבות הלבלב היא פתוגנומית למחלות כגון דלקת הלבלב, T1D ו- T2D1,2,3. חקר התפקוד באיים מבודדים כרוך בדרך כלל בהסרת האיים מסביבתם4. שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה פותחה כדי לאפשר את חקר רקמת הלבלב תוך שמירה על מיקרו-סביבה שלמה של איונים והימנעות משימוש בהליכי בידוד איים מלחיצים5,6,7. פרוסות רקמת הלבלב מרקמת התורם האנושי שימשו בהצלחה לחקר T1D והפגינו תהליכים של אובדן תאי ביתא וחוסר תפקוד בנוסף לחדירה לתאי החיסון8,9,10,11,12,13. ניתן ליישם את שיטת פרוסת רקמת הלבלב החיה הן על העכבר והן על רקמת הלבלב האנושית5,6,8. פרוסות רקמת הלבלב האנושית מרקמות תורמי איברים מתקבלות באמצעות שיתוף פעולה עם הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD). פרוסות עכבר ניתן ליצור ממגוון של זני עכבר שונים.

פרוטוקול זה יתמקד ללא השמנת יתר סוכרת-רקומבינציה הפעלת גן-1-null (NOD. ראג1-/-) וקולטן תא T מהונדס (AI4) (הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β) זני עכבר. הנהון. עכברי Rag1-/- אינם מסוגלים לפתח תאי T ו- B עקב הפרעה בגן מפעיל רקומבינציה 1 (Rag1)14. הנהון. ראג1-/-. עכברי AI4 α/β משמשים כמודל לסוכרת מסוג 1 מואצת מכיוון שהם מייצרים שיבוט תא T יחיד המכוון לאפיטופ של אינסולין, וכתוצאה מכך חדירת איים עקבית והתפתחות מחלה מהירה15. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר נהלים למחקרים פונקציונליים ואימונולוגיים באמצעות פרוסות לבלב אנושיות ועכבר חיות באמצעות יישום של גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית. הטכניקות המתוארות כאן כוללות הערכות כדאיות, זיהוי איון ומיקום, הקלטות Ca2+ ציטוטוסוליות, כמו גם כתמים וזיהוי של אוכלוסיות תאי החיסון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערות: כל הפרוטוקולים הניסיוניים באמצעות עכברים אושרו על ידי אוניברסיטת פלורידה טיפול ושימוש בסמים הוועדה (201808642). מקטעי לבלב אנושיים מתורמי רקמות משני המינים הושגו באמצעות הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD) בנק רקמה, אוניברסיטת פלורידה. הלבלב האנושי נקצר מתורמי איברים קדוואריים על ידי ארגוני רכש איברים מוסמכים השותפים ל- nPOD בהתאם לחוקים ולתקנות לתרומת איברים וסיווגו כ"נושאים לא אנושיים " על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פלורידה (IRB) (IRB מס '392-2008), תוך ויתור על הצורך בהסכמה. רקמות nPOD המשמשות במיוחד עבור פרויקט זה אושרו כלא אנושיות על ידי אוניברסיטת פלורידה IRB (IRB20140093). המטרות של סעיפים 1-3 של פרוטוקול זה הן להסביר כיצד לנתח בהצלחה עכבר, להכין ולעבד את הלבלב, וליצור פרוסות רקמת לבלב חי. יש להכין את הפתרונות מראש, ואת המתכונים ניתן למצוא בטבלה משלימה 1. הזמן הוא הגורם הקריטי ביותר במהלך שלבי פרוטוקול אלה. ברגע שהעכבר הוקרב, הכדאיות של הרקמות תתחיל לרדת. יש להשלים את כל שלושת החלקים של פרוטוקול זה במהירות האפשרית עד ליצירת כל הפרוסות הדרושות.

1. הכנה ליצירת פרוסות לבלב עכבר

  1. מהדקים את הלהב על מחזיק להב הוויברטום, אך עדיין לא מחברים אותו לויברטום.
  2. ממיסים 100 מ"ל של 1.25% w/v אגרוז נקודת התכה נמוכה במיקרוגל. להפעיל את המיקרוגל במרווחים של דקה אחת, ולעצור את המיקרוגל במשך 10 שניות אם תמיסת אגרוז מתחילה לרתיחה. חזור על תהליך זה עד שהאגרוז נמס, ומיוצר פתרון הומוגני. מניחים את הבקבוק באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ריכוז האגרוז הנמוך הוא להסביר את הצפיפות הנמוכה יותר של לבלב העכבר.
  3. מלא מזרק מנעול Luer 10 מ"ל עם 3 מ"ל של אגרוז חם. התאימו מחט 27 G 25 מ"מ על המזרק. שמור את המזרק עם המחט המצורפת capped באמבט מים 37 °C עד הפתרון הוא להיות מוזרק.
    הערה: מחט 27 G הוא המועדף כפי שהוא מתאים בבטחה לתוך צינור המרה המשותף של עכברים בין 10-25 גרם במשקל הגוף ומאפשר את זרימת פתרון אגרוז צמיג מאוד. בעוד מחטים משעמם גדול יותר ניתן לבחור לשימוש, מחטים קטנות יותר (מד גדול יותר) אינם מומלצים כמו אלה עשויים להיות סתומים בקלות רבה יותר עם פתרון agarose.
  4. הוסיפו 20 מ"ל של תמיסה חוץ-תאית צוננת (ECS) לצלחת פטרי 10 ס"מ.
    הערה: ECS לא צריך להיות מבעבע בכל שלב.
  5. מלא שתי מנות פטרי לא מטופלות בגודל 10 ס"מ עם 15 מ"ל של חיץ ביקרבונט קרבס-רינגר (KRBH) המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ומעכב טריפסין סויה בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל למנה.
    הערה: לאורך פרוטוקול זה, חיוני כי כל הפתרונות המשמשים לשמירה על פרוסות מכילים מעכב טריפסין סויה כדי למנוע נזק לרקמות הנגרמות על ידי פרוטאזים העיכול הלבלב.

2. כריתת לבלב עכבר ועיבוד רקמות

הערה: הפרוטוקול לחתוך את הלבלב, עיבוד הרקמה, ויצירת פרוסות משתנה מ Marciniak et al5. כדי להבטיח כדאיות רקמות, למזער את משך הזמן בין הסרת הלבלב ויצירת פרוסות. כל הציוד הדרוש צריך להיות מוכן מראש ומכוון באופן שיאפשר התקדמות מהירה דרך השלבים הבאים. צינור המרה canulation והזרקה, כמו גם כריתת הלבלב מבוצעים בצורה הטובה ביותר תחת סטריאוסקופ.

  1. העכבר הוא מרדים עמוק עם איזופלוראן ומוקרב על ידי נקע צוואר הרחם.
    הערה: איזופלוריין היא שיטת ההשפלה המועדפת. ריכוז של 5% איזופלוראן יש להשתמש. לדוגמה, יש להשתמש ב- 0.26 מ"ל עם תא 1 ליטר16. ירידה בכדאיות רקמת הלבלב נצפתה כאשר נעשה שימוש בפחמן דו חמצני .
  2. לרסס את העכבר עם 70% v / v אתנול בנדיבות כדי להפחית זיהום רקמות עם פרווה במהלך הניתור והניתור. הנח את העכבר בחלק גבי כלפי מטה, כיוון גחוני כלפי מעלה עם הצד השמאלי משמאל.
  3. באמצעות מספריים, לפתוח את הצפק ולהסיר את כלוב הצלעות, דואג לא לנקב את הלב או כלי השיט הסמוכים. השתמש במלקחיים כדי להפוך את הכבד לתוך חלל החזה, ולהזיז את המעיים מתוך חלל הגוף כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. השתמש מהדק בולדוג ג'ונס הופקינס כדי לאכל את האמפולה של ואטר.
  4. יש לאחזר מזרק מנעול Luer 10 מ"ל טעון מראש עם 3 מ"ל של פתרון אגרוז חם מן אמבט מים 37 °C .C.
    הערה: לאחר המזרק עם agarose מוסר מאמבט המים, הזרקת הלבלב צריך להתבצע במהירות לפני agarose מתקרר ומגדיר את המזרק.
  5. מחזיק את המלקחיים ביד שמאל, להשתמש בהם כדי לתמוך בעדינות לייצב את צינור המרה עבור הזריקה.
  6. החזק את המזרק ביד ימין, הכנס את הצד המכופע של המחט לצינור המרה. לאט ובהתמדה להזריק את הלבלב. ברגע שהזריקה מתחילה, לא ניתן לעצור את הזרימה ללא התקשות אגרוז במזרק ובלבלב.
    הערה: אמצעי האחסון בו נעשה שימוש יהיה תלוי במשקל העכבר. בהתבסס על ניסיון, מומלץ כי 1 מ"ל של פתרון agarose לשמש לכל 10 גרם של משקל גוף העכבר עם נפח מרבי של 2 מ"ל. הלבלב צריך להיראות מעט מנופח עם מבנה מוחלט יותר, אבל לא מוגזם. הזרקת יתר גורמת לאיים המופרדים מהרקמה האקסוקרינית ויש להם מראה "מפוצץ" בפרוסות.
  7. מוציאים את הלבלב מלא אגרוז מהעכבר. באמצעות מלקחיים ומספריים, לחתוך את הלבלב משם, החל בבטן, נע למעיים, ומסתיים בטחול. לאחר חיתוך, בעדינות להסיר את הלבלב המוזרק עם מלקחיים, ומניחים בצלחת פטרי 10 ס"מ מלא ECS צונן.
  8. השתמש במספריים כדי להסיר את השומן, רקמת החיבור, הרקמה הסיבוטית וחלקים מהלבלב שאינם מוזרקים לאגרוז.
    הערה: חלקים של הרקמה שיש להסיר לא יהיו מבנים מבוססים מאוד ייראה קצת gelatinous.
  9. לאחר חיתוך הרקמה, השתמש במספריים כדי לחתוך אותו לחלקים קטנים יותר שקוטרם כ -5 מ"מ תוך השארתו שקועה תחת ECS. לחתוך את הרקמה בזהירות, דואג לא לדחוף את האגורז מתוך הרקמה.
  10. הסר את חתיכות הרקמה מן ECS, ומניחים אותם על מגב שני רובדים (ראה את טבלת החומרים). מגלגלים אותם בעדינות על המגב באמצעות מלקחיים להסרת נוזלים עודפים.
  11. באמצעות מלקחיים, מניחים בזהירות את חתיכות הרקמה בצלחת פטרי 35 מ"מ עם לא יותר מ 4 חתיכות לכל צלחת. מניחים את הצד השטוח ביותר של בלוק הרקמה עם הפנים כלפי מטה. לחץ בעדינות על הרקמה באמצעות מלקחיים.
    הערה: ודא שיש מקום, לפחות כמה מילימטרים, בין חתיכות הרקמה, וכי הם לא נוגעים בקצה הצלחת.
  12. לאט לשפוך את 37 °C agarose לתוך המנה, דואג לא לשפוך אותו ישירות על הרקמה. יוצקים מספיק כך חתיכות הרקמה מכוסים לחלוטין. ודא שיש שכבה של אגרוז מעל חתיכות הרקמה כמו חלק זה יהיה מודבק למחזיק הדגימה.
  13. מעבירים בזהירות את המנה עם חתיכות הרקמה למקרר כדי לאפשר לאגורוז להקים. ודא חתיכות הרקמה לא לזוז או להתחיל צף. אם כן, תסתגלו מחדש במהירות באמצעות מלקחיים.
    הערה: הגדרת האגורוז אמורה להימשך מספר דקות בלבד.
  14. לאחר agarose יש להגדיר, להשתמש באזמל לחתוך סביב הרקמה בקווים ישרים כדי להפוך בלוקים agarose כאילו עושה רשת בין חתיכות הרקמה. הקפד להשאיר כמה מילימטרים של אגרוז סביב כל הצדדים של הרקמה.
    הערה: לא צריך להיות כל רקמה בולטת מן האגורוז. כל בלוק צריך להיות קובייה של כ 5 מ"מ x 5 מ"מ x נפח 5 מ"מ.
  15. השתמש באזמל כדי להפוך את החלקים הריקים של אגרוז שנחתכו סביב קצוות הצלחת. הסר את הבלוקים עם הרקמה מן המנה על ידי הרמת אותם בזהירות עם מלקחיים.

3. יצירת פרוסות לבלב עכבר

  1. באמצעות מלקחיים, מסדרים את הבלוקים על מחזיק הדגימה; מניחים אותם לצדדים, תוך התחשבות בכך שהם יופכו על דבק העל. סדר את הבלוקים כך שהם לא ישתרעו רחוק יותר מרוחב הלהב. כאשר הוויברטום נע לאט, סדר את הבלוקים כך שהלהב צריך לנוע קדימה המרחק הכי פחות אפשרי.
    הערה: שתי שורות של שלושה או ארבעה בלוקים כל אחת עם כמה מילימטרים בין השורות עובד טוב. הבלוקים באותה שורה יכולים לגעת זה בזה, אך כאשר שתי השורות נוגעות זו בזו, קשה לאחזר פרוסות כאשר הן יורדות מהבלוקים.
  2. יש למרוח קו של דבק-על על מחזיק הדגימה, ולהשתמש בקצה מתקן הדבק כדי לפזר את הדבק לשכבה דקה. הפוך את בלוקי הרקמה על הדבק כך שהצד הקרוב ביותר לרקמה פונה כלפי מעלה. דוחפים בעדינות כלפי מטה על הבלוקים, ומניחים לדבק להתייבש במשך שלוש דקות.
  3. חבר את מחזיק הלהב ואת הצלחת לויברטום, בדרך כלל עם בורג או מגנט, בהתאם לדגם הוויברטום. התאם את גובה הלהב ואת המרחק נסע כך הלהב נע על פני אורך הבלוקים ורק בקושי מעליהם.
    הערה: מלקחיים יכולים להיות מועילים בעת התאמת גובה הלהב. הם יכולים להיות ממוקמים על גבי בלוק הרקמה כדי לעזור למקם את הלהב קרוב ככל האפשר לראש הבלוק מבלי לגעת בבלוק.
  4. ודא שהדבק התייבש על ידי דחיקת בלוקים בעדינות במלקחיים, ומלא את מגש הוויברטום ב- ECS צונן עד שהלהב מכוסה. הגדר את הוויברטום כדי להפוך פרוסות בעובי 120 מיקרומטר במהירות של 0.175 מ"מ / s, תדירות של 70 הרץ, ומשרעת של 1 מ"מ.
    הערה: ניתן להתאים את מהירות הוויברטום בהתאם לקלות חיתוך הרקמה.
  5. התחל את הוויברטום, ושים לב מתי פרוסות מתחילות לרדת מבלוני הרקמה. השתמש 10 ס"מ מלקחיים גראפה או מברשת צבע מס '4 קטן כדי להסיר בזהירות את הפרוסות ברגע שהם צפים את הבלוק, ומניחים אותם לוחות 10 ס"מ עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז מעכב טריפסין. מרימים את הפרוסות על ידי הנחת מברשת צבע או מלקחיים מתחתם והרמת הפרוסות בעדינות. אין לדגור יותר מ-15 פרוסות יחד בצלחת אחת.
    הערה: זה נורמלי עבור רטט יש כמה עובר מעל הבלוקים שבו אין פרוסות נעשות, אבל אלה צריכים להיות ממוזערים לזמן. יש מספריים מוכנים במקרה הפרוסות לא נפרדים לחלוטין בלוקים רקמה. במקרה כזה, פינה או קצה של הפרוסה יהיו תקועים לבלוק לאחר שהלהב הוויברטום יעבור. אין לשלוף את הפרוסה או החסימה בעת הסרת הפרוסה התקועה.
  6. מניחים את הצלחות עם הפרוסות על נדנדה בטמפרטורת החדר וב-25 סל"ד. תן לפרוסות לנוח בטמפרטורת החדר במשך שעה. אם הם הולכים להישאר יותר זמן, למקם את הפרוסות 15 מ"ל של פרוסה תרבות בינונית (ראה טבלה משלימה 1) באינקובטור. פרוסות דגירה שהוכנו ללימודים באותו יום ב 37 °C (50 °F), ופרוסות תרבות כי הם מתורבתים לילה ב 24 °C (77 °F), העברתם ל 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעות לפני ניסויים.
    הערה: בטווח הארוך, הפרוסות יש כדאיות טובה יותר כאשר תרבית ב 24 °C (50 °F), אם כי 37 °C (37 °F) קרוב יותר לסביבה הפיזיולוגית הטבעית שלהם, כנראה בשל הפעילות הנמוכה יותר של אנזימי פרוטאז מופרש בטמפרטורה נמוכה יותר. פרוסות עכבר ורקמת לבלב אנושית הן בתרבית באותה טמפרטורה ועם מקסימום של 15 פרוסות למנה. עם זאת, מתכוני המדיה שונים עבור פרוסות אדם ועכבר. שני הניסוחים מפורטים בטבלה משלימה 1. בנוסף, ההליך זהה ליצירת פרוסות עכבר ואדם למעט לבלב העכבר הדורש הזרקה עם אגרוז לייצוב. פרוסות אנושיות נרכשות באמצעות תוכנית פרוסת הלבלב nPOD. גם עכבר וגם פרוסות אנושיות הם בעובי 120 מיקרומטר. מגוון ניסויים ניתן לבצע על הפרוסות; בחרו לוחות כתמים הפועלים בצורה הטובה ביותר לניסויים מתוכננים.

4. פרוסת הכנה להליכי הכתמים

  1. תרבות הפרוסות ב 37 °C (50 °F) לפחות 1 שעה לפני הניסויים המתוכננים. KRBH חם המכיל 3 mM D-גלוקוז באמבט מים 37 °C.C. מעבירים 2 מ"ל של KRBH המכיל 3m D-גלוקוז בצלחת 35 מ"מ, ולהשתמש במכחול כדי למקם בעדינות את הפרוסה בצלחת.
  2. אם הפרוסה מועברת מבינונית, יש לשטוף אותה פעמיים עם KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות פיפטה העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה. שמור את הפרוסה בצלחת עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז בזמן לוחות הכתמים מוכנים.

5. כתמי Dithizone

הערה: למרות dithizone יכול לשמש כדי להכתים את האיים אדום, זה יהרוג את הפרוסה כפי שהוא נמצא להיות ציטוטוקסי לאיים17.

  1. למדוד 12.5 מ ג של dithizone, להוסיף אותו 1.25 מ"ל של דימתילסולפוקס, ולקחת את התערובת הזאת במזרק 50 מ"ל. מלאו את המזרק לנפח של 25 מ"ל באמצעות תמיסת מלח מאוזנת של Hanks, וצרפו מסנן לסוף המזרק. Aliquot 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז, ולהוסיף 2 טיפות של פתרון dithizone מסונן מן המזרק 50 מ"ל לתוך צלחת 35 מ"מ.
  2. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ. דמיין את הפרוסה עם האיים המצוינים על ידי כתמי dithizone אדומים באמצעות סטריאומיקוסקופ.

6. מכתים את הכדאיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להעריך את הכדאיות של פרוסה באמצעות calcein-AM וכחול SYTOX כחול-פלואורסצנטי (ראה טבלת החומרים). Calcein-AM צריך לשמש בריכוז של 4 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר.

  1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, ולהוסיף 2 μL של צבע calcein-AM ו SYTOX כחול כדי להפריד aliquots. מערבולת התערובות עבור 5 s.
  2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3 מ"מ של גלוקוז D וצבע קלצ'ין-AM לכל באר של משקפת עם 8 תאים טובים.
    הערה: ניתן להשתמש בלוחות חלופיים ו/או בתאי הדמיה שאינם משקפת עם 8 בארות.
  3. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של הצלחת, ומעבירים את הצלחת עם הפרוסות לחממה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי 35 מ"מ בתחתית תחתית המכילה 2 מ"ל של KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז ו 2 μL של כחול SYTOX בריכוז של 1 μL לכל 1 מ"ל של פתרון. מכסים את הפרוסה בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. זה קריטי תמיד לשמור על הפרוסות בפתרונות המכילים מעכב פרוטאז, גם במהלך טעינת צבע. כתמי הכדאיות המשמשים יכולים להיות מותאמים לניסוי ספציפי או להגדרת מיקרוסקופ.

7. כתמי מחוון פרוסה Ca2+

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים פרוסות עבור הקלטות Ca2+ באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו- SYTOX כחול בפרוסות עכבר (ראה טבלת החומרים). אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM צריך לשמש בריכוז של 5.6 מיקרומטר ו SYTOX כחול ב 1 מיקרומטר. בפרוסות אנושיות, פלואו-4-AM צריך לשמש בריכוז של 6.4 מיקרומטר.

  1. Aliquot 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 7 μL של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ומערבולת התערובת עבור 5 s.
    הערה: לפרוסות רקמה אנושית, השתמש פלו-4-AM במקום אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. פלו-4-AM עדיף כי הוא בהיר יותר כאשר ריכוז Ca2 + תאיים עולה; עם זאת, זה לא לטעון היטב ברקמת הלבלב העכבר. הפרוטוקול זהה למתואר לעיל עבור Fluo-4-AM למעט כי פלואו-4-AM רק צריך להיות דגירה במשך 30 דקות.
  2. הוסיפו 200 מיקרו-אל של KRBH המכילים 3mM D-גלוקוז וצבע לכל באר של 6 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בכל באר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסות לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  3. לשטוף את הפרוסות פעמיים עם KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים פרוסה בצלחת הדמיה או בתא עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז ו- SYTOX Blue בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומבטיחים שהנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: בפרוטוקול זה, צלחת 35 מ"מ מלא 2 מ"ל של KRBH המכיל 3 mM D גלוקוז ו 2 μL של SYTOX כחול שימש. אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה.

8. פרוסת עכבר Ca2+ הקלטות

הערות: החלק הבא מתאר כיצד לבצע Ca2 + הקלטות על פרוסות רקמת הלבלב העכבר באמצעות אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM ו SYTOX כחול. ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים). הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור כחול SYTOX, 488 ננומטר עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM, ו 638 ננומטר עבור רפלקציה. גלאי HyD שימש עבור אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM. גלאי שפופרת פוטומולטיפלייר (PMT) שימשו להשתקפויות ולכחול SYTOX. פרוטוקול ההדמיה Ca2+ זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית, למעט העובדה ש- Fluo-4-AM שימש כאינדיקטור. יש להתאים את רמות הכוח, הרווח וגודל חור הסיכה של הלייזר בהתבסס על המדגם ועל האי המסוים. בדרך כלל, חור סיכה של 1.5 יחידות אוורירית וכוח לייזר של 1% הם נקודות התחלה טובות.

  1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה על הבמה או בסגנון הכלוב ל-37 מעלות צלזיוס. מניחים את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה לאחר הסרת המכסה. התמקד על-ידי הגדרת המיקרוסקופ למטרה 10x ולמצב Brightfield. אתר איים באמצעות brightfield על ידי חיפוש אליפסות כתומות-חומות בתוך הפרוסה.
  2. לאחר איתור אי סביר, החלף את המיקרוסקופ למצב הדמיה קונפוקלית. כדי לאשר איונים על ידי רפלקטיביות, להפעיל את לייזר 638 ננומטר, להגדיר את כוח הלייזר בין 1% ו 2%, ולכבות את מסנן חריץ 638 ננומטר כי בדרך כלל להסיר אור backscattered. הגדר את מגבלות הזיהוי בגלאי PMT לרוחב פס של כ-20 ננומטר המרוכז סביב 638 ננומטר.
    הערה: היזהר מכיוון שהפעלת המיקרוסקופ במצב רפלקטיביות עלולה להזיק לגלאי. בשל הגרגריות הגבוהה של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול לשמש כעת כדי לאתר איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים פרטניים בעלי תותים בערוץ רפלקטיביות זה.
  3. כדי להציג את SYTOX Blue, הדליקו את גלאי הלייזר וה-PMT של 405 ננומטר והגדירו את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. ברגע שאי עניין ממוקם ומאושר על ידי backscatter, עבור למטרה 20x, להתקרב כך האי תופס את רוב המסגרת.
  4. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלק האופטי הטוב ביותר של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וטעון היטב עם אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM או Fluo-4-AM.
    הערה: אין זה יוצא דופן לראות תאים עמוסים בכמות גדולה של צבע והם בהירים מאוד. אלה עשויים להיות תאי לבלב גוסס שבו Ca2 + אחסון ברטיקולום אנדופלסמי עשוי להשתחרר, וכתוצאה מכך רמות גבוהות של טעינה; אלה אינם תאים אידיאליים להקלדת. חפשו תאים שטענו בבירור את הצבע, אך אינם רוויים יתר על המידה את הגלאי כך שניתן לראות עלייה בבהירות המתרחשת כאשר רמות Ca2+ ציטוטוסוליות משתנות. טעינת צבע של איונים בתוך פרוסות משתנה; עם זאת, הצבע בדרך כלל נטען היטב דרך ~ 10-15 מיקרומטר של האי. עם זאת, טעינת צבע יכול להיות קשה לדמיין אם התאים עמוק ברקמה.
  5. כדי למנוע דהייה של צבע במהלך ההקלטה, ודא כי כוח הלייזר בערוץ 488 ננומטר אינו עולה על 2%. הגדל את חור הסיכה ל-2 יחידות אוורירית כדי לאסוף יותר אות עם כוח עירור נמוך יותר.
  6. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להפחית את קצב הפריימים ל-2 s או פחות לכל מסגרת.
    הערה: התאמות הגדרות שניתן לבצע כדי לסייע בהקטנת קצב הפריימים כוללות הפעלת סריקה דו-כיוונית, הקטנה או כיבוי של ממוצע הקו והגברת מהירות הסריקה.
  7. לאחר מיטוב ההגדרות, הקלט מספר דקות של פעילות בזלית.
    הערה: אינדיקטור טוב נוסף של הכדאיות רקמה הוא אם התאים נראים פעילים והם מהבהבים בעליל במהלך הקלטה זו של פעילות בזאלית.
  8. הוסף 100 μL של גלוקוז מרוכז 20x ו KCl ב KRBH לצלחת באמצעות 200 מיקרופיפט μL בנקודות הזמן נתון כדי להשיג ריכוז סופי של גלוקוז 16.7 mM או 30 mM KCl.
    הערות: הוסף את הפתרונות בקפידה, תוך הקפדה לא להפריע לפרוסה במהלך ההקלטה. הקפד לא להקפיץ את הצלחת עם micropipette. זה אופייני לראות את הרקמה מתכווצת בתגובה לגירויים אלה. הקלטות שטף Ca2+ עובדו וכומתו ב- ImageJ18. באמצעות תוכנת ImageJ, עוצמת הכתמים של אורגון ירוק 488 BAPTA-1, AM נמדד בתאים על ידי בחירה ידנית של אזורים של עניין (ROIs). עוצמת הפלואורסצנטיות של ROIs אלה חושבה על ידי חלוקת ערכי הפלואורסצנטיות בנקודות זמן מאוחרות יותר על ידי ערכי הפלואורסצנטיות הראשוניים של התאים (F/F0). ניתן להשתמש במערכת זלוף יחד עם תא הדמיה מיוחד כדי לנהל את הפתרונות לפרוסות באופן דינמי לעומת הוספתן באופן ידני. מערכת זלוף והמלצות לתא הדמיה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

9. הכתמת תאי עכבר T בפרוסות לבלב חיות

הערה: סעיף זה בפרוטוקול מתאר כיצד להכתים תאי מערכת החיסון בתוך פרוסות עכבר. זן העכבר המשמש הוא הנהון. ראג1-/-. AI4 α/β כמו מודל זה מפתחת באופן עקבי מחלה עם אינסוליטיס משמעותית. תאי CD8+ T בעכבר זה כולם מכוונים לאפיטופ של אינסולין, המאפשר שימוש ב- phycoerythrin (PE) שכותרתו טטרמר אינסולין-Db15. יש להשתמש בנוגדן CD8 בריכוז של 1: 20 וטטרמר האינסולין בשעה 1: 50.

  1. Aliquot 100 μL של KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז, להוסיף 2 μL של טטרמר אינסולין PE ו 5 μL של נוגדן CD8 אלופיקוציאנין (APC), ומערבולת התערובת עבור 5 s.
  2. הוסיפו 100 מיקרו-אל של KRBH המכיל 3 מ"מ של גלוקוז D ואת הטטרמר והנוגדן לבאר של 8 משקפת עם תאים טובים. בעזרת מברשת צבע, מניחים בזהירות פרוסה בבאר של שעון הכיסוי התאי. מעבירים את שעון הכיסוי עם הפרוסה לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  3. לשטוף את הפרוסה פעמיים עם 2 מ"ל KRBH המכיל 3 mM D-גלוקוז. בזהירות לשאוף KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז באמצעות העברה או פיפטה פסטר, דואג לא להפריע לפרוסה.
  4. מניחים את הפרוסה בצלחת פטרי באורך 35 מ"מ עם תחתית 35 מ"מ המכילה KRBH עם 3 מ"מ D-גלוקוז וכחול SYTOX בריכוז של 1 μL ל-1 מ"ל, ומכסים בעוגן פרוסה, ומניחים את הצד עם הנבל פונה כלפי מטה. צלם תמונות של הפרוסה.
    הערה: אם עוגן הפרוסה ממשיך לצוף, הרטיבו אותו משני הצדדים עם KRBH המכיל 3 מ"מ D-גלוקוז כדי להטביע אותו בתמיסה. ניתן לעשות שימוש חוזר בנוגדן ובטטמר מדולל פעם אחת. לאחר הכתמת שתי פרוסות, יש לבצע תערובת נוגדנים טרייה.

10. הקלטה של תאי מערכת החיסון של העכבר

הערה: הסעיף הבא מתאר כיצד לבצע הקלטות של תאי מערכת החיסון על פרוסות רקמת הלבלב של העכבר באמצעות נוגדן CD8, טטרמר אינסולין PE, וכחול SYTOX. כיוונון ההדמיה הוא כמתואר בסעיף 8. ההקלטות נעשו ברזולוציה של 800 × 800 פיקסלים. הלייזרים ששימשו היו 405 ננומטר עבור SYTOX כחול, 488 ננומטר עבור טטרמר אינסולין, ו 638 ננומטר עבור נוגדן CD8 רפלקטיביות. גלאי HyD שימשו לנוגדן CD8 וטטרמר אינסולין PE. גלאי PMT שימשו עבור רפלקציה וכחול SYTOX. פרוטוקול הדמיית תאי החיסון זהה לפרוסות רקמת הלבלב האנושית למעט שימוש בנוגדנים שונים ומולטי-מולטימרים HLA מורכבים אנטיגן לרקמה אנושית. הן עבור כתמי טטרמר אינסולין ברקמת העכבר והן עבור כתמים HLA-multimer ברקמה האנושית, יש להשתמש בכתם משותף של תאי מערכת החיסון כדי לאמת את נוכחותם של תאי T אנטיגן ספציפיים תגובתי. כאן נעשה שימוש בנוגדן נגד CD8. נוגדנים, כגון אנטי-CD3 או אנטי-CD4, יכולים לשמש גם בהתאם לאוכלוסיית תאי היעד.

  1. לפחות שעה אחת לפני ההקלטה, הפעילו את המיקרוסקופ ושוו את החממה העליונה ל-37 מעלות צלזיוס. אבטחו את צלחת הפטרי עם תחתית 35 מ"מ המכילה את הפרוסה על הבמה. מקד את המיקרוסקופ על-ידי הגדרת המטרה 10x במצב Brightfield. אתר את האיים באמצעות מצב Brightfield על-ידי חיפוש אליפסות בצבע חום כתום בתוך הפרוסה.
  2. החלף את המיקרוסקופ להדמיה קונפוקלית על-ידי לחיצה על לחצן CS בבקר מסך המגע של המיקרוסקופ. כדי להציג איונים לפי רפלקטיביות, הפעל את גלאי הלייזר וה-PMT 638, הגדר את עוצמת הלייזר בין 1% ל-2%, וכבה את מסנני החרוזים.
    הערה: בשל הגרגריות המוגברת של הרקמה האנדוקרינית, אור משתקף יכול כעת לשמש לאיתור איים. האיים יופיעו כקבוצות של תאים גרגירים בהירים בערוץ זה.
  3. כדי לצפות ב- SYTOX Blue, נוגדן CD8 וטטרמר אינסולין, בדוק שכוח הלייזר הוא בין 1% ל-2%. השתמש בהגדרות הבאות כדי להציג כל אחת מהשלושה: עבור SYTOX Blue, הפעל את לייזר 405 ננומטר וגלאי PMT; עבור נוגדן CD8, הפעל את גלאי HyD; ולצפייה בטטרמר האינסולין, הפעל את הלייזר 488 ננומטר וגלאי HyD.
  4. מרכז את האי העניין בשדה הראייה באמצעות ידיות X ו- Y של בקר הבמה. לאחר איתור אי עניין, עבור למטרה 20x והגדל את התצוגה כך שהאי תופס את רוב המסגרת. קח z-מחסנית של האי עם גודל z-step של 1.5 מיקרומטר. מצא את החלקים האופטיים הטובים ביותר (סדרה של בין 5 ל -10 חלקים) של האי שבו רוב התאים חיים (שלילי עבור כחול SYTOX) וכל תאי החיסון שמסביב נמצאים בפוקוס.
    הערה: נסו למצוא מסגרות שבהן יש מספר תאים חיוביים ל-CD8 ואינסולין הסובבים או חודרים לאי.
  5. הגדר את המיקרוסקופ להקליטה במצב XYZT. מטב את ההגדרות כדי להקליט ערימת Z של השלבים שנבחרו כל 20 דקות על-פני תקופה של מספר שעות.
    הערה: אם אפשר, עדיף לעשות הקלטות אלה בתא הדמיה שבו ניתן לשלוט בטמפרטורה וברמות CO2 , במיוחד בעת הקלטה במשך יותר מארבע שעות. במקרה של הקלטה בן לילה, נוגדן עודף ניתן להוסיף לתקשורת כדי לפצות על רכיבה על אופניים קולטן תא T ודעכת צבע. בנוסף, פלואורופורים שונים יכולים לשמש נוגדני תאי T. בהתבסס על ניסיון, נוגדנים בטווח האדום הרחוק פועלים בצורה הטובה ביותר עבור תאי T.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה יניב פרוסות רקמת לבלב חיות המתאימות הן למחקרי פונקציונליות והן להקלטות תאי מערכת החיסון. מראה פרוסה הן בבהירות והן באור משתקף מוצג באיור 1A,B. כפי שנדון, איונים ניתן למצוא בפרוסות באמצעות אור משתקף בשל הגרגריות המוגברת שלהם המתרחשת בגלל תוכן האינסולין שלהם (איור 1C) והם נצפים בבירור בהשוואה לרקמת הרקע כאשר נעשה שימוש באור משתקף. יש להעריך את הכדאיות לאחר יצירת הפרוסה, ואין לרשום איונים אם יותר מ-20% מהאי אינו בר קיימא. אי בעל כדאיות ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר את הדור של פרוסות הלבלב ואת ההליכים הדרושים כדי להעסיק את הפרוסות במחקרים פונקציונליים ואימוניולוגיים. ישנם יתרונות רבים לשימוש בפרוסות לבלב חיות. עם זאת, ישנם מספר צעדים קריטיים החיוניים עבור הרקמה להישאר קיימא ושימושי במהלך פרוטוקולי הניסוי המתוארים. זה הכרחי לעבוד במהירות. יש למזער את משך הזמן בין הזרקת הלבלב לבין יצירת הפרוסות על הוויברטום כדי לשמור על כדאיות הרקמה. הכדאיות משופרת גם על ידי שמירה על הלבלב ב- ECS קר לפני חיתוך בניגוד לטמפרטורת החדר ECS. חשוב לציין, פרוסות לא צריך להיות בינו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 ו P01 AI042288. מחקר זה בוצע בתמיכת הרשת לתורמי איברי לבלב עם סוכרת (nPOD; RRID:SCR_014641), פרויקט מחקר סוכרת מסוג 1 משותף בחסות JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R), וקרן הצדקה של לאונה M. והארי ב. הלמסלי (גרנט #2018PG-T1D053). התוכן והשקפות המובעים הם באחריות המחברים ואינם משקפים בהכרח את ההשקפה הרשמית של nPOD. ארגונים לרכש איברים (OPO) משתפים פעולה עם nPOD כדי לספק משאבי מחקר רשומים ב- http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. תודה לד"ר קווין אוטו, אוניברסיטת פלורידה, על שסיפקת את הוויברטום ששימש ליצירת פרוסות עכבר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#3 סטייל אזמל ידיתפישרברנד12-000-163
1 מ' HEPESFisher ScientificBP299-100HEPES Buffer, תמיסה
1M 10 ס"מ קורנינג צלחת תרבית לא מטופלת430591
10 מ"ל מזרק Luer-Lok BD301029מזרק BD עם קצות Luer-Lok
27 גרם מחטBD BD 305109BD שימוש כללי ודיוקGlide מחטים היפודרמיות
35 מ"מ כיסוי צלחת פטרי תחתונהזכוכית Ibidi81156µ-צלחת 35 מ"מ, מזרק גבוה
50 מ"לBD309653
8 בארות כיסוי זכוכיתIbidi80826µ-Slide 8 Well
APC נגד עכבר CD8a נוגדןBiolegend100712
BSAFisher Scientific199898
סידן כלוריסיגמאC5670CaCl2
סידן כלוריד דיהידראטSigmaC7902CaCl2 (דיהידרט)
נדנדה דיגיטלית קומפקטיתתרמו פישר 88880020
מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקליLeicaSP8חור סיכה = 1.5-2 יחידות אווריריות; נרכש עם צמצם מספרי של 10x/0.40 HC PL APO CS2 יבש ו-20x/0.75 צמצם מספרי HC PL APO CS2 יעדים יבשים ב-512  וזמנים;   רזולוציה של 512 פיקסלים
D-(+)-גלוקוזסיגמאG7021C6H12O6
ddiH2O
DithizoneSigma-AldrichD5130-10G
DMSOInvitrogenD12345דימתיל סולפוקסיד
אתנולDecon Laboratories2805
פלקון 35 מ"מ צלחת תרבית רקמותקורנינג353001פלקון קל לאחיזה כלי תרבית רקמות
FBSGibco10082147
נוצה מס' 10 להב כירורגיאלקטרונים מיקרוסקופיה מדעי7204410
fluo-4-AMInvitrogenF14201חדיר לתאים Ca2+ מחוון
ג'ל סופר דבקLoctite45198
Graefe מלקחייםכלים מדעיים עדינים11049-10
מספריים עדינים מוקשיםכלי מדע עדינים14090-09
HBSSGibco14025092Hanks תמיסת מלח מאוזנת
HEPESSigmaH4034C8H18N2O4S
דלי קרחפישרברנד03-395-150
איזופלורןפטרסון וטרינריNDC 14043-704-05
ג'ונס הופקינס בולדוג מהדקרובוז חנות כירורגיתRS-7440  ישר; לחץ של 500-900 גרם; אורך 1.5 אינץ'
KimwipesKimberly-Clark Professional34705Kimtech Science™ קימוויפס וסחר; מגבי משימות עדינים, ערכת 2 שכבות
LIVE/DEAD כדאיות/ציטוטוקסיותInvitrogenL3224ערכה זו מכילה את צבע התאים החיים Calcein-AM.
גלוקוז נמוך DMEMCorning10-014-CV
מגנזיום כלוריד הקסהידרטSigmaM9272MgCl2 (hexahydrate)
מגנזיום סולפט heptahydrateSigmaM2773MgSO4 (heptahydrate)
פלטפורמה מחוממת מגנטית פלטפורמתWarner InstrumentsPM-1לתא הדמיה לגירוי דינמי הקלטות
מיקרוגלGEJES1460DSWW
Nalgene מסנן מזרקתרמו פישר סיינטיפיק726-2520
מס' 4 מכחולמייקלס10269140
תא הדמיה פתוח לאמבט יהלוםוורנר אינסטרומנטסRC-26תא הדמיה להקלטות גירוי דינמי
אורגון ירוק 488 BAPTA-1-AMInvitrogenמחוון O6807חדיר לתאים Ca2+
תא הדמיה לילהOkolabH201-LG
PBS Thermo Fisher Scientific20012050להכנת אגרוז לדור פרוסות
אינסולין טטרמר PE עם תוויתEmory מחקר רצף ליבתYAIENYLEL
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140122
אשלגן כלוריSigmaP5405KCl
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigmaP5655KH2PO4
Razor Blades ElectronMicroscopy Sciences71998לוויברטום; פלדת אל חלד כפולה, RPMI
1640Gibco11875093
SeaPlaque נקודת התכה נמוכהLonza50101להכנת אגרוז ליצירת פרוסות
עוגן פרוסהWarner Instruments64-1421
עוגן פרוסה (הדמיה דינמית)Warner Instruments640253עוגן פרוסה לתא
הדמיה דינמינתרן ביקרבונטסיגמאS5761NaHCO<תת>3
נתרן כלוריסיגמאS5886NaCl
נתרן פוספט מונוהידרטסיגמאS9638NaH<תת>2PO<תת>4 (מונוהידרט)
מעכב טריפסין פולי סויהסיגמאT6522-1Gמעכב טריפסין משלב גליצין מקס (פולי סויה)
מתאםWarner InstrumentsSA-20MW-ALכדי להתאים תא הדמיה להקלטות גירוי דינמי על במת המיקרוסקופ
חממה על הבמהOkolabH201
סטריאוסקופLeicaIC90 E MSV266
SYTOX כחול כתם תא מתInvitrogenS34857כתם חומצת גרעין כחול-פלואורסצנטי
העברתPipet Falcon357575Falcon™ פלסטיק חד פעמי העברה צנרת
מערכת בקרת שסתוםוורנר אינסטרומנטסVCS-8מערכת להקלטות גירוי דינמי
Vibratome VT1000 SLeicaVT1000 S
אמבט מיםפישר סיינטיפיקFSGPD02Fisherbrand Isotemp לשימוש כללי דלוקס אמבט מים GPD 02
כיסוי בקרת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Uc, A., Fishman, D. S. Pancreatic disorders. Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).
  2. Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes. Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).
  3. Taylor, R. Type 2 diabetes: etiology and reversibility. Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).
  4. Meier, R. P., et al. Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases. Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).
  5. Marciniak, A., et al. Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology. Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).
  6. Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology. Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).
  7. Speier, S., Rupnik, M. A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells. Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).
  8. Panzer, J. K., et al. Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis. JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).
  9. Dolai, S., et al. Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis. Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).
  10. Dolai, S., et al. Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes. Autophagy. , 1-14 (2020).
  11. Qadir, M. M. F., et al. Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration. Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).
  12. Cohrs, C. M., et al. Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis. Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).
  13. Liang, T., et al. Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology. Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).
  14. Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. Humanized mice in translational biomedical research. Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).
  15. Lamont, D., et al. Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses. Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).
  16. Anesthesia and analgesia in laboratory animals. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).
  17. Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets. Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices. Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).
  20. Gál, E., et al. A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice. Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).
  21. Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices. PloS One. 8 (1), 54638(2013).
  22. Stožer, A., et al. Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices. PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).
  23. Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization. Endocrinology. 162 (1), 136(2021).
  24. Satin, L. S. New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion. Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).
  25. Ren, J., et al. Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).
  26. Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ. PLoS One. 8 (11), 78706(2013).
  27. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pancreatic Tissue SlicesIslet FunctionIslet Immune InteractionsConfocal MicroscopyTime Lapse MicroscopyImmune Cell StainingVibratome SlicingType 1 DiabetesInsulin Tetramer StainingCD8 Antibody Detection

Related Articles