כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים ראשוניים שגדלו באותו מין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן. כמו כן, הוא יכול לכלול את הנוגדן השלישי ממארח אחר בפרוטוקול זה. גישה זו יכולה להתבצע בכל סוג תא ופתוגנים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תיוג כפול immunofluorescence באמצעות נוגדנים מאותו המין כדי לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
כיום, ניתן למצוא מגוון רחב של כלים מולקולריים הזמינים לחקר אינטראקציות תא טפיל-מארח. עם זאת, קיימות מגבלות מסוימות כדי להשיג נוגדנים חד שבטיים או פוליקלונליים מסחריים המזהים מבני תאים וחלבונים ספציפיים בטפילים. חוץ מזה, יש כמה נוגדנים מסחריים זמינים לתייג טריפנוסומטידים. בדרך כלל, נוגדנים פוליקלונליים נגד טפילים מוכנים בתוך הבית ויכולים להיות מאתגרים יותר לשימוש בשילוב עם נוגדנים אחרים המיוצרים באותו מין. כאן, הפרוטוקול מדגים כיצד להשתמש בנוגדנים פוליקלונליים ומונו-שבטיים שגדלו באותו מין כדי לבצע תיוג כפול immunofluorescence לחקור אינטראקציות תא מארח ופתוגן. כדי להשיג את התיוג הכפול immunofluorescence, זה חיוני כדי לדגור תחילה את הנוגדן הפוליקלונלי עכבר ולאחר מכן בצע את הדגירה עם העכבר המשני IgG נוגדן מצומד לכל פלואורוכרום. לאחר מכן, יש צורך בצעד חסימה נוסף כדי למנוע כל זכר לנוגדן העיקרי להיות מוכר על ידי הנוגדן המשני הבא. לאחר מכן, נוגדן מונוקלונלי של עכבר ונוגדן המשני הספציפי של IgG התת-מחלקה שלו מצומדים לפלורוכרום שונה מתווספים לדגימה בזמנים המתאימים. בנוסף, ניתן לבצע תיוג משולש immunofluorescence באמצעות נוגדן שלישי שגדל במין אחר. כמו כן, מבנים כגון גרעינים ו actin יכול להיות מוכתם לאחר מכן עם תרכובות ספציפיות שלהם או תוויות. לכן, גישות אלה המוצגות כאן ניתן להתאים עבור כל תא שמקורות הנוגדנים העיקריים שלו מוגבלים.
מבוא
כדי לחקור את האינטראקציה של הפתוגן עם התא המארח ברמה התאית מספק מידע חיוני על הגורמים הבסיסיים של המחלה מאז קבוצות שונות, כגון וירוסים, חיידקים, פרוטוזואה, יכול להדביק את רוב סוגי התא המארח1,2,3,4. זה יכול גם לעזור לפתח ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות שיכולות להאט או לעכב את הצמיחה של הפתוגן. בתנאים חיים, הנוגדנים המיוצרים אחראים לזיהוי רכיבים עצמיים, אנטיגנים מווירוסים, רכיבים או מוצרים חיידקיים, פטריות, טפילים ואחרים5.
לשם כך, נוגדנים הם כלים בשימוש נרחב, בעיקר להבנת המיקום והתפקוד של מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרביות תאים וטפילים
- לגדל LLC-MK2 (רזוס קוף אפיתל הכליות) תאים מאוסף תרבית סוג אמריקאי (CCL-7) בבקבוק תרבית תאים 25 cm2 cm2 המכיל במדיום RPMI בתוספת 10% FBS מושבת בחום (סרום בקר עוברי) ואנטיביוטיקה (100 U / mL פניצילין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין) ב 37 °C ב 5% CO2 17.
- להדביק תאי LLC-MK2 עם טריפנוסומה קרוזי (זן Y) על פי פרוטוקול קודם 18.
- לאסוף את supernatant של LLC-MK2 תאים נגועים (5 מ"ל) בצינור צנטריפוגה צנטריפוגה חרוטית תרבית תא 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 10 דקות ו 22 °C (5 °F) כדי להוריד את פסולת התא. שמור את הצינור במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאן, אנו מראים כיצד לחקור אינטראקציות מארח-טפיל על ידי immunofluorescence כאשר מקור הנוגדנים מוגבל בשל חוסר זמינות של נוגדנים מסחריים המזהים מבנים וחלבונים ספציפיים טריפנוסומטידים.
בין טריפאנוסומטידים, T. cruzi יש אחד ממחזורי החיים המורכבים ביותר מעורבים שלבי התפתחות שונים בין בעלי חוליות ומארחים חסרי חוליות 19. במהלך מחזור החיים T. cruzi, בשלב מוקדם של זיהום יונקים, טריפומפסטיגוטים מטציקלים פולשים לתאים בתהליך הכולל מגוון רחב של מולקולות הנמצאות בטפיל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע חיסונים כפולים בתאים נגועים טריפנוסומה קרוזי באמצעות שני נוגדנים שונים מאותו מין מארח. כדי ללמוד, בפירוט רב יותר, את ההשלכות של הזיהום, מבנים בתא המארח כגון הגרעין או אברונים ציטוטוסוליים ניתן לתייג באמצעות פרוטוקול זה. כמו כן, ניתן להשתמש בו בשיטת התוויות החיסונית של החלק הדק שלאחר ההטבעה. גישה זו מסייעת להתגבר על המכשול שיש מעט נוגדנים זמינים ללמוד trypanosomatids וטפילים אחרים.
בנוסף, הפרוטוקול שלנו הראה טפיל תאי מסומן יחד עם התא המארח, שני eukaryote.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים או פיננסיים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) to MMAB, by Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA to MMAB and by Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) - קוד פיננסי 001. CG-C קיבל מלגת תואר שני ודוקטורט מ- CAPES ו- LAMT-S קיבל מלגת דוקטורט מ- CNPq. אנו מודים לאליזבטה ר. מילאני על הסיוע במיקרוסקופיה קונפוקלית וד"ר דריו זמבוני על אספקת תאי LLC-MK2 (בית הספר לרפואה ריבייראו פרטו, USP).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 - נוגדן IgG2b | טכנולוגיות חיים, ארה"ב | A21141 | עיזים נגד עכבר |
| AffiniPure Rabbit אנטי-עכבר IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, ארה"ב | 315-005-003 | נוגדן נגד עכבר |
| Alexa Fluor 488 - נוגדן IgG F (ab')2 (H+L) טכנולוגיות | חיים, ארה"ב | A11017 | עיזים נגד עכבר |
| Alexa Fluor 594 IgG1 נוגדן | Life, ארה"ב | A21125 | נוגדן עיזים נגד עכבר |
| Alexa Fluor 647 - נוגדן IgG F (ab')2 (H+L) | טכנולוגיות חיים, ארה"ב | A21237 | נוגדן עיזים נגד עכבר |
| אנטי-hnRNPA1 IgG2b | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | R4528 | נוגדן לעכבר |
| נגד TcFAZ (חלבון T. cruzi FAZ) נוגדן | המעבדה שלנו | נוגדן עכבר | בבית |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | A2153-10G | חלבון אלבומין |
| Igepal CA-630 | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | I3021 | חומר ניקוי לא יוני |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, ארה"ב | 12657-029 | סרום |
| פניצילין סטרפטומיצין | Gibco, תרמו פישר מדעי, ארה"ב | 15140-122 | אנטיביוטיקה |
| פלואידין Alexa Fluor 594 | Life technologies, ארה"ב | A12381 | סמן אקטין |
| ProLong זהב נוגד דהייה עם טכנולוגיות DAPI | Life, ארה"ב | P36935 | מגיב מדיה הרכבה |
| RPMI 1640 1X עם L-גלוטמין | קורנינג, ארה"ב | 10-040-CV | מדיה לתרבית תאים |
| תמיסת טריפסין-EDTA | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | T4049-100ML | Bioreagent |
מקורות
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalis....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
