Method Article

ניתוח מרובב של ביטוי גנים ברשתית ונגישות כרומטין באמצעות scRNA-Seq ו- scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, המחברים מציגים את התועלת של MULTI-seq עבור פנוטיפ והצמד הבא scRNA-seq ו- scATAC-seq באפיון פרופילי הנגישות של תעתיק וכרומטין ברשתית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות ריצוף עוצמתיות של הדור הבא מציעות ניתוח חזק ומקיף כדי לחקור כיצד רשתות ויסות גנים ברשתית מתפקדות במהלך ההתפתחות ובמצבי המחלה. ריצוף RNA חד-תאי מאפשר לנו ליצור פרופיל מקיף של שינויים בביטוי גנים שנצפו בהתפתחות הרשתית ובמחלות ברמה התאית, בעוד ש-ATAC-Seq חד-תאי מאפשר ניתוח של נגישות כרומטין וקשירת גורמי שעתוק ברזולוציה דומה. כאן מתואר השימוש בטכניקות אלה ברשתית המתפתחת, ומדגים MULTI-Seq, שבו דגימות בודדות מסומנות בקומפלקס אוליגונוקלאוטיד-ליפידים שונה, מה שמאפשר לחוקרים להגדיל את היקף הניסויים הבודדים ולהפחית באופן משמעותי את העלויות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבנת האופן שבו גנים יכולים להשפיע על גורל התאים ממלאת תפקיד מפתח בחקירת תהליכים כמו מחלות והתקדמות עוברית. ניתן לקבץ את היחסים המורכבים בין גורמי שעתוק לבין גני המטרה שלהם ברשתות ויסות גנים. עדויות הולכות וגוברות מציבות את הרשתות הרגולטוריות של הגנים הללו במרכזן של מחלות והתפתחות על פני שושלות אבולוציוניות1. בעוד שטכניקות קודמות כגון qRT-PCR התמקדו בגן יחיד או בקבוצת גנים אחת, היישום של טכנולוגיית ריצוף בתפוקה גבוהה מאפשר פרופיל של תעתיקים תאיים שלמים.

RNA-seq מציע הצצה לתעתיק בקנה מידה גדול 2,3. ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) מעניק לחוקרים את היכולת לא רק ליצור פרופילים של תעתיקים אלא גם לקשר בין סוגי תאים ספציפיים לפרופילי ביטוי גנים4. זה מושג באופן ביואינפורמטי על ידי הזנת פרופילי תאים בודדים לאלגוריתמים של מיון באמצעות סמני גנים ידועים5. ריבוב באמצעות ריצוף מדדים המתויגים בשומנים (MULTI-seq) מציע גיוון חסר תקדים במספר פרופילי scRNA-Seq שניתן לאסוף6. טכניקה זו המבוססת על שומנים שונה מטכניקות אחרות של אינדקס דגימות כגון גיבוב תאים המסתמכות על נוכחות של אנטיגנים על פני השטח ונוגדנים בעלי זיקה גבוהה במקום שילוב קרום פלזמה7. לא רק שכיום ניתן ליצור פרופילים של ביטוי גנים לסוגי תאים, אלא שניתן לשלב ניסויים שונים בספריית ריצוף אחת, מה שמוריד באופן דרמטי את העלות של ניסוי scRNA-seq6 בודד. העלות של scRNA-seq עשויה להיראות בלתי אפשרית לשימוש בניסויי פנוטיפ שבהם מנותחים גנוטיפים, מצבים או דגימות מטופלים רבים ושונים, אך ריבוב מאפשר שילוב של עד 96 דגימות בספריה אחת6.

יצירת פרופיל של ביטוי גנים באמצעות scRNA-seq לא הייתה הטכניקה היחידה המבוססת על ריצוף בתפוקה גבוהה שחוללה מהפכה בהבנה הנוכחית של האופן שבו מנגנונים מולקולריים מכתיבים את גורל התא. בעוד שהבנת תעתיקי הגנים הקיימים בתא מאפשרת זיהוי של סוג התא, חשובה לא פחות היא הבנת האופן שבו ארגון גנומי מווסת את ההתפתחות ואת התקדמות המחלה. מחקרים מוקדמים הסתמכו על גילוי ביקוע בתיווך DNase של רצפים שאינם קשורים להיסטונים, ולאחר מכן ריצוף של מקטעי הדנ"א שהתקבלו כדי לזהות אזורים של כרומטין פתוח. לעומת זאת, בדיקה של תא יחיד לריצוף כרומטין נגיש לטרנספוזון (scATAC-seq) מאפשרת לחוקרים לחקור דנ"א עם טרנספוזון מבוית כדי ליצור פרופיל קל של כרומטין פתוח ברמת נוקלאוטיד יחידה8. זה עבר שינוי קנה מידה דומה ל-scRNA-seq וכעת חוקרים יכולים לזהות סוגי תאים בודדים ולתאר פנוטיפים על פני אלפי גנומים בודדים8.

הזיווג של scRNA-seq ו-scATAC-seq אפשר לחוקרים את היכולת ליצור פרופיל של אלפי תאים כדי לקבוע אוכלוסיות תאים, ארגון גנומי ורשתות ויסות גנים במודלים של מחלות ובתהליכים התפתחותיים 9,10,11,12. כאן המחברים מתארים כיצד להשתמש תחילה ב-MULTI-seq כדי לדחוס פנוטיפ של מספר עצום של מודלים של בעלי חיים ולהשתמש בזוגות scRNA-seq ו-scATAC-seq כדי להבין טוב יותר את נוף הכרומטין ואת הרשתות הרגולטוריות במודלים אלה של בעלי חיים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השימוש בבעלי חיים למחקרים אלה נערך באמצעות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של ג'ונס הופקינס, בהתאם להנחיות ARRIVE, ובוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות.

1. רב-סק

  1. הכנת מדיה
    1. הכן ושיווי משקל מעכב אובומוקואיד, 10 מ"ג של מעכב אובומוקואידי ו-10 מ"ג אלבומין למ"ל של תמיסת המלח המאוזנת של ארל (EBSS), במשך 30 דקות לפני השימושב-13. שיווי משקל עם 95% O2:5% CO2 באינקובטור.
      1. הכינו תמיסת דיסוציאציה של פפאין, 20 יחידות/מ"ל פפאין ו-0.005% DNase ב-EBSS, במהלך שלב הדגירה הזה13.
        הערה: בקבוקון אחד של תמיסת DNase יספיק ל-5 דגימות. ייתכן שיהיה צורך לשחזר בקבוקונים נוספים אם מבצעים MULTI-seq על יותר מ-5 דגימות.
    2. הכינו תמיסות אוליגו ברקוד שעברו שינוי שומנים.
      1. בצע דילול ברקוד ייחודי עבור כל דגימה על ידי שילוב של 0.5 μL של תמיסת מלאי ברקוד של 100 μM עם 4.5 μL של תמיסת מלח מחוצץ פוספט (PBS).
      2. כדי להכין תמיסת עוגן:ברקוד ביחס טוחנת של 1:1, שלבו 4.4 μL של דילול ברקוד של 10 μM, 0.9 μL של תמיסת עוגן של 50 μM ו-16.7 μL של PBS והניחו על קרח. הריכוז הסופי הן עבור גדילי הברקוד והן עבור גדילי העוגן צריך להיות 2 μM.
      3. כדי להכין תמיסת עוגן משותף, שלבו 0.88 μL של תמיסת עוגן משותף של 50 μM ו-21.12 μL של PBS והניחו על קרח. הריכוז הסופי של העוגן המשותף צריך להיות 2 μM. הכפל את הנפחים בשלב זה פי 1.1 ממספר הדגימות.
    3. כדי לייצר 1% BSA ב-PBS, ממיסים 0.1 גרם אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-10 מ"ל של PBS ומניחים על קרח.
    4. כדי לייצר PBS עם מעכב RNase, שלבו 2.5 μL של 40 מעכבי U/μL RNase עם 197.5 μL של PBS ואחסנו על קרח. הכפל את הכרכים בשלב זה פי 1.1 ממספר הדגימות.
  2. דיסוציאציה לדוגמה
    1. המתת חסד בעלי חיים באמצעות נקע צוואר הרחם ו/או חנק CO2 בהתאם לדרישות IACUC המוסדיות. השיטה להמתת חסד תהיה תלויה בדרישות המוסדיות ובאורגניזם המודל שבו נעשה שימוש.
    2. נתחו את הרשתית משתי העיניים ב-PBS קר תחת מיקרוסקופ דיסקציה והעבירו לצינור מיקרו-צנטריפוג' סטרילי של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטת העברה.
    3. העברת 500 μL של תמיסת הפפאין לצינור 1.5 מ"ל עבור כל דגימה.
    4. מניחים דגימות בתמיסת הפפאין ומיד מכסים את הצינורות.
    5. דגירה של הצינורות המכילים את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות. הפוך את הבקבוקונים 3 פעמים כל 10 דקות. הדגימות צריכות להתנתק בהדרגה עם כל סיבוב של היפוכים.
    6. החזירו את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר ותשלשו כל דגימה 3-4 פעמים עם פיפטה של 1 מ"ל שנקבעה ל-300 מיקרול'.
    7. אפשרו לכל פיסות הרקמה שנותרו ללא הבחנה לאחר הטריטורציה להתיישב.
    8. הסר את תרחיף התא המעונן תוך הימנעות מחתיכות של רקמה לא מוסתרת והנח את תרחיף התא של כל דגימה בצינור סטרילי חדש עם מכסה בורג של 15 מ"ל.
    9. צנטריפוגה מתלי התא ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. במהלך שלב הצנטריפוגה, הכינו את מדיית ההחייאה של התא.
      1. יש לערבב 857 μL של EBSS (בקבוקון 1) עם 95 μL של תמיסת מעכב אלבומין-אובומוקואידית משוחזרת בצינור סטרילי עם מכסה בורג של 1.5 מ"ל. הוסף 48 μL של תמיסת DNase שנשמרה מ- 1.1.1. הכפל את הכרכים בשלב זה פי 1.1 ממספר הדגימות.
    11. יש להשליך את הסופרנטנט, להקפיד לשמור על כדורי התא, ומיד להחיות את כדורי התא בתמיסת החייאה של 1 מ"ל שהתא הוכן בשלב 1.2.10.
    12. הכן שיפוע צפיפות לא רציף.
      1. עבור כל דגימה, הוסיפו 1.6 מ"ל של תמיסת מעכבי אובומוקואידים לצינור חדש עם מכסה בורג סטרילי של 15 מ"ל והניחו בזהירות את תרחיף התא על גביו. הממשק בין שתי השכבות של מעבר הצבע אמור להיות גלוי, אך ערבוב מסוים אינו משפיע על התוצאות.
    13. צנטריפוגה את שיפועי הצפיפות הבלתי פוסקים ב 70 x g במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר. התאים המנותקים צריכים לכדור בתחתית הצינורות בעוד שברי הממברנה נשארים בממשק.
    14. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 200 μL של PBS כדי לשטוף את התאים המכוסים. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    15. יש להשליך את הסופרנטנט ולהחיות את התאים ב-180 μL של PBS עם מעכב RNase. מעבירים את התאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור מיקרו-סנטריפוג' סטרילי של 1.5 מ"ל.
  3. ברקוד תאים
    1. הוסיפו 20 μL של תמיסת עוגן:ברקוד לכל דגימה ופיפטה בעדינות לערבוב. ודא שכל דגימה מקבלת עוגן ייחודי: תמיסת ברקוד ודגירה על קרח למשך 5 דקות.
      1. הכינו את החומרים הדרושים ליצירת חרוזי ג'ל בתחליב (GEM) וברקוד במהלך דגירה זו14.
    2. הוסיפו 20 μL של תמיסת עוגן משותפת לכל דגימה ופיפט בעדינות לערבוב. דגירה על קרח במשך 5 דקות.
    3. הוסף 1 מ"ל של BSA קר כקרח 1% ב- PBS לכל דגימה וצנטריפוגה על התאים ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    4. הסר את ה-supernatant מבלי להפריע לכדור התא והוסף 400 μL קר כקרח 1% BSA ב-PBS. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
      1. חזור על שלב 1.3.4 בסך הכל 2 שטיפות. הסר את הסופרנטנט ואת ההחייאה ב- 400 μL קר כקרח 1% BSA ב- PBS.
    5. קבע את ריכוז התאים עבור כל דגימה באמצעות המוציטומטר.
      1. קבע את המספר הכולל של התאים לטעינה עבור כל דגימה. בדרך כלל, זהו המספר הכולל של התאים הרצויים חלקי מספר הדגימות. עם זאת, אם אבד שכפול ביולוגי למצב אחד, ניתן לפצל את חלקו בין השכפולים הביולוגיים האחרים ממצב זה.
      2. חלקו את מספר התאים הרצויים לכל דגימה בריכוז התאים של אותה דגימה המחושבת בשלב 3.5 כדי לקבוע את הנפח הנדרש לטעינת מספר התאים הרצוי.
    6. שלב את הנפחים המחושבים בשלב 3.5.2 מכל דגימה בצינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 1.5 מ"ל. זה נבון להכפיל את הנפח שנלקח מכל דגימה במקרה של כישלון של יצירת GEM.
      1. קבעו את ריכוז התאים ה"סופי" של הדגימות המשולבות באמצעות המוציטומטר.
  4. יצירת GEM וברקוד
    1. השתמש בדוגמאות משולבות כדי ליצור וברקוד GEMs14.
  5. לאחר ניקוי GEM-RT והגברת cDNA
    1. הכן חומרים לניקוי תעתיק הפוך לאחר GEM והגברת cDNA בהתאם להוראות היצרן עם השינויים הבאים14. בצע ניקוי לאחר GEM-RT על ידי בחירת גודל14.
      1. הגדל נפח של 80% אתנול מוכן על ידי 2 מ"ל.
      2. הכן תערובת הגברה cDNA על קרח14. הוסף 1 μL של 2.5 μM MULTI-seq פריימר לתערובת הגברה cDNA. מערבולת ל-5 שניות וצנטריפוגה ל-5 שניות בצנטריפוגת מיני ספסל.
    2. בצע הגברת cDNA14. ניתן לאחסן את ה- cDNA ב- 4 ° C למשך עד 72 שעות בשלב זה.
    3. בצע ניקוי cDNA לפי בחירת גודל14. ניתן לאחסן את ה-cDNA של התמליל האנדוגני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 72 שעות או בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות בשלב זה.
      1. אין להשליך את הסופרנטנט מהסיבוב הראשון של בחירת הגודל . חלק זה מכיל את הברקודים לדוגמה. מעבירים את ה-supernatant לצינור מיקרו-צנטריפוג' סטרילי חדש במינון 1.5 מ"ל.
      2. אחסנו את ה-supernatant על הקרח.
    4. מערבולת כדי להחיות ריאגנט בחירת גודל פאראמגנטי מבוסס חרוזים ולהוסיף 260 μL ריאגנט פאראמגנטי מבוסס גודל חרוזים (3.2x סופי) ו 180 μL של 100% איזופרופנול (1.8x) לסופרנט. פיפט את התערובת 10 פעמים ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    5. הניחו את הצינור על מדף מגנטי והמתינו שהתמיסה תתנקה. לאחר מכן להסיר ולהשליך את supernatant.
    6. מוסיפים 500 μL של 80% אתנול לחרוזים ומניחים לעמוד על 30 שניות. הסר והשליכו את ה-supernatant.
      1. חזרו על הפעולה במשך 2 שטיפות בסך הכל.
    7. צנטריפוגה קצרה של החרוזים וחזרה למדף המגנטי. הפעל טיימר למשך 2 דקות.
    8. הסר את האתנול הנותר עם פיפטה P10 ויבש באוויר את החרוזים על המדף המגנטי למשך שארית 2 הדקות. אין לחרוג מ-2 דקות.
    9. הסר את החרוזים מהמדף המגנטי ובצע החייאה במאגר 100 μL elution (EB). פיפט ביסודיות להחייאה.
    10. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    11. חזור אל המדף המגנטי והמתן עד שהפתרון יתנקה.
    12. העבירו את ה-supernatant לצינור מיקרו-צנטריפוג' טרי בגודל 1.5 מ"ל.
    13. חזור על שלבים 1.5.4 עד 1.5.12. צמצם בחצי את נפח ה- Buffer EB המשמש בשלב 1.5.9.
    14. קבע את ריכוז הדנ"א של הברקוד ואת התפלגות הגודל באמצעות ערכת בדיקת רגישות גבוהה של dsDNA ופלואורומטר ומנתח שברים15,16. ניתן לאחסן את ה-cDNA של הברקוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 72 שעות או בטמפרטורה של עד 20 מעלות צלזיוס למשך עד 4 שבועות בשלב זה.
  6. בניית ספריית ברקודים
    1. הכן 1 מ"ל של 80% אתנול.
    2. הכן ספריית ברקוד PCR תערובת מאסטר בצינור רצועת PCR סטרילי: שלב 26.25 μL של 2x תערובת מוכנה PCR להתחלה חמה, 2.5 μL של פריימר אוניברסלי i5 של 10 μM, 2.5 μL של 10 μM RPI פריימר, 3.5 ננוגרם של cDNA ברקוד (נפח שנקבע על ידי ריכוז משלב 5.14), ומספיק מים ללא נוקלאז כדי להביא את הנפח הסופי ל-50 μL.
      1. השתמש בפריימר RPI ייחודי עבור כל ספריית ברקוד אם מספר ספריות MULTI-seq מרוצפות יחד.
    3. נושא את תערובת המאסטר של ספריית הברקוד להכנת ספרייה PCR: 95 °C (85 °F) למשך 5 דקות; 10 מחזורים של 98 מעלות צלזיוס עבור 15 שניות, 60 מעלות צלזיוס עבור 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס עבור 30 שניות; 72 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת; ולאחר מכן להחזיק בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. מערבולת כדי להחיות את ריאגנט בחירת הגודל המבוסס על חרוזים פאראמגנטיים.
    5. הסר את מוצר ה- PCR מהתרמוצילר והוסף 80 μL (1.6x) של מגיב בחירת גודל מבוסס חרוזים פאראמגנטיים. פיפט ביסודיות.
    6. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. מניחים על מפריד המגנטים במיקום הגבוה ומחכים שהפתרון יתבהר.
    7. הסר והשליכו את ה-supernatant.
    8. הוסיפו 200 μL של 80% אתנול לחרוזים ואפשרו לעמוד על 30 שניות. הסר והשליכו את ה-supernatant.
      1. חזור על שלב 1.6.8 בסך הכל 2 שטיפות.
    9. צנטריפוגה קצרה של הצינור והנחתה על המפריד המגנטי במיקום הנמוך. הפעל טיימר למשך 2 דקות.
    10. הסר את האתנול הנותר עם פיפטה P20 ויבש באוויר את החרוזים על המפריד המגנטי למשך שארית 2 הדקות. אין לחרוג מ-2 דקות.
    11. הסר את הצינור מהמפריד המגנטי והחזיר את החרוזים ב-25 μL של EB חיץ. פיפט מערבבת ביסודיות כדי להחיות את החרוזים.
    12. דגירה למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    13. חזור למפריד המגנטי במיקום הנמוך והמתן עד שהפתרון יתבהר. העבר את ה-supernatant לצינור רצועת PCR חדש.
    14. כימות ספריית ביטויים וריכוז ספריית ברקוד והפצת גודל שברים באמצעות ערכת בדיקת רגישות גבוהה של adsDNA ופלואורומטר ומנתח שברים.
  7. 3' בניית ספריית ביטוי גנים
    1. בצע בניית ספריית ביטוי גנים 3' בהתאם להוראות היצרן14.
  8. רצף
    1. בנוסף לספריית cDNA האנדוגנית המוגברת בשלב 7, שלח את ספריית הברקוד המוגברת בשלב 6. למען הפשטות, הגש ספריות אלה בנפרד, או כאמצעי חסכוני לכלול aliquot של חומר ברקוד לדוגמה עם ספריית cDNA אנדוגנית. יעד בין 20,000-50,000 cDNA ו-3,000-5,000 קריאות ברקוד לתא.
    2. המר את קבצי הריצוף bcl המתקבלים לקבצי fastq על-ידי mkfastq של cellranger וספירת מטריצות שנוצרו מהם על-ידי ספירת תאים.
    3. דגימות Deconvolute לאחר ניתוח Cellranger באמצעות חבילת deMULTIplex r הזמינה במאגר MULTI-seq GitHub (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. סקרנ"א-סק זוגי וסקאטאק-סק

  1. רקמת הקפאת הבזק עבור scATAC-seq וקיבוע מתנול של תאי רשתית עבור scRNA-seq
    1. הכנת מדיה
      1. כדי להכין את הפתרונות לדיסוציאציה ברשתית, חזור על שלבים 1.1.1 ו- 1.1.4.
      2. הכינו אמבט קרח יבש אתנול בדלי קרח קטן.
      3. הכינו 15 מ"ל של 70% אתנול על ידי הוספת 10.5 מ"ל של אתנול ל-4.5 מ"ל של מים נטולי נוקלאז.
      4. הוסיפו מספיק קרח יבש לדלי הקרח (רצוי בצורת גלולה) כדי ש-15 מ"ל של נוזל יעלו רק כדי לכסות את הקרח. הוסף את 15 מ"ל של אתנול.
      5. הניחו PBS על קרח ו-1 מ"ל אליקוטים של 100% מתנול במקפיא נוח של 20 מעלות צלזיוס.
    2. הכנה לדוגמה
      1. בצע את השלבים 1.2.1 ו- 1.2.2 כדי לבודד רשתיות; עם זאת, הפעם למקם כל רשתית לתוך צינור microcentrifuge נפרד.
      2. עבור הדגימות המיועדות ל-scATAC-seq, הסירו כל נוזל מצינור המיקרו-סנטריפוג' באמצעות פיפטה P200 ומיד כיסו והניחו את הצינור באמבט קרח יבש באתנול כדי להקפיא את הדגימה.
      3. עבור הדגימות המיועדות ל- scRNA-seq, כדי לנתק את התאים, חזור על שלבים 1.2.3 עד 1.2.15 על הרשתית המנותקת.
      4. צנטריפוגה על התאים ב 300 x g במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא.
      6. מוסיפים 1 מ"ל של PBS מצונן ומערבבים בעדינות פיפטה 10 פעמים או עד שהתאים מושעים לחלוטין.
      7. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
        1. חזור על שלבים 2.1.2.5 עד 2.1.2.7 ובסך הכל 2 שטיפות.
      8. הסר את חומר העל מבלי להפריע לכדור התא.
      9. הוסיפו 100 μL של PBS צונן וערבבו בעדינות פי 10 או עד שהתאים מושעים לחלוטין.
      10. התחל לסובב את הצינור בהגדרת המהירות הנמוכה ביותר. הוסיפו 900 μL מתנול צונן (-20 מעלות צלזיוס) טיפה אחר טיפה תוך המשך מערבולת עדינה של הצינור כדי למנוע מהתאים להתגושם.
      11. דגירה של התאים על קרח למשך 15 דקות.
      12. קבע את ריכוז התאים הקבועים באמצעות המוציטומטר.
      13. הערך את היעילות של שלב הקיבוע באמצעות טריפאן כחול. חלק גבוה של תאים בני קיימא מצביע על כך שנדרש זמן קיבוע רב יותר.
      14. אחסנו את הרקמה הקפואה והתאים הקבועים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. בידוד גרעינים מרקמה קפואה הבזק עבור scATAC-seq
    1. הכנת מדיה
      1. הכן את מאגר דילול התזה על ידי שילוב של 9.77 מ"ל של מים נטולי נוקלאז, 100 μL של 1 M Tris-HCl (pH 7.4), 100 μL של 1 M NaCl, 30 μL של 1 M MgCl2 ו-0.1 גרם של BSA.
      2. הכינו את מאגר דילול הליזיס מראש, כגון יום קודם לכן, ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. ביום הפרוטוקול, מניחים על הקרח.
      3. שיווי משקל של 20x חיץ גרעינים המסופק על ידי היצרן של ערכת scATAC -20 °C לטמפרטורת החדר. מערבולת וצנטריפוגה בקצרה.
      4. הכינו את מאגר הליזיס 1x על ידי דגירה של תמיסת Digitonin של 5% באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס עד להמסת המזרז. לאחר מכן שלבו 2 מ"ל של מאגר דילול ליזיס, 20 μL של 10% Tween-20, 20 μL של תחליף Nonidet P40 (עשוי לחלופין להיות מסומן IGEPAL), ו-4 μL של Digitonin.
      5. אחסנו את מאגר הליזיס 1x על קרח.
      6. כדי להכין את מאגר הליזיס 0.1x, שלבו 1.8 מ"ל של מאגר דילול ליזיס עם 200 μL של מאגר 1x lysis ואחסנו על קרח.
      7. כדי להכין את מאגר הכביסה, שלבו 2 מ"ל של מאגר דילול ליזיס ו-20 μL של 10% Tween-20 ואחסנו על קרח.
      8. כדי להכין את מאגר הגרעינים המדולל, שלבו 950 μL של מים נטולי נוקלאז עם 50 μL של חיץ גרעינים (פי 20) ואחסנו על קרח.
    2. בידוד גרעינים
      1. אין להפשיר את המדגם לפני התזה. הוסף 500 μL של מאגר ליזה מצונן 0.1x לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכיל את הדגימה הקפואה. הומוגניזציה מיידית של פי 15 באמצעות מזיק כדוריות.
      2. דגירה במשך 5 דקות על קרח. הכן את החומרים הדרושים לטרנספוזיציה של scATAC במהלך שלב דגירה זה17.
      3. פיפט מערבבת 10x עם פיפטה 1 מ"ל ואינקובציה במשך 10 דקות על קרח. הכנה מלאה של החומרים הדרושים לטרנספוזיציה scATAC במהלך שלב דגירה זה אם עדיין לא הושלמה. אין צורך להכין יותר חיץ גרעינים מדולל.
      4. הוסיפו 500 μL של מאגר שטיפה מצונן לתאים המצוננים. תערובת פיפטה 5x.
      5. מעבירים את ההשעיה דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוג' חדש של 1.5 מ"ל. סנן כ-300 μL בכל פעם באמצעות מסננת תאים חדשה של 70 מיקרומטר בכל פעם.
      6. מעבירים את הזרימה שנאספת דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוג' חדש של 1.5 מ"ל ומאחסנים על קרח.
      7. לקבוע את ריכוז הגרעינים באמצעות המוציטומטר. בהתבסס על ריכוז הגרעינים והנפח הכולל של תרחיף התא, חשב את המספר הכולל של גרעינים מנותקים.
      8. צנטריפוגה ב 500 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant מבלי לשבש את גלולת הגרעינים.
      9. כדי ליצור את מלאי הגרעינים בהתבסס על ספירת הגרעינים הכוללת שנקבעה בשלב 2.2.2.7., יש להחיות את הגרעינים במספיק חיץ גרעינים מדולל כדי להגיע לריכוז גרעינים רצוי.
        הערה: ריכוז הגרעינים הרצוי מבוסס על שחזור הגרעינים הממוקדים לניסוי scATAC-seq והוא נקבע מהנחיות ריכוז הגרעינים שנמצאו בפרוטוקול17 של היצרן. לדוגמה, אם בסופו של דבר רוצים 10,000 גרעינים, ריכוז הגרעינים הרצוי עבור מאגר הגרעינים הוא בין 3,080 ל-7,700 גרעינים/μL. אולי עדיף לשאוף לאמצע הטווח בריכוז.
      10. לקבוע את ריכוז הגרעינים באמצעות המוציטומטר.
      11. המשך מיד ל- scATAC טרנספוזיציה באמצעות מלאי הגרעינים המוכן17.
  3. התייבשות של תאים קבועים מתנול לשימוש ב- scRNA-Seq
    1. הכנת מדיה
      1. כדי להכין את מאגר הכביסה/דילול, ממיסים 0.01 גרם של BSA ב-1 מ"ל של PBS. לאחר מכן הוסיפו 12.5 μL של מעכב 40 U/μL RNase וערבבו בעדינות. יש לאחסן על קרח.
    2. התייבשות תאים
      1. תאי מתנול צנטריפוגה קבועים בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב-3000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הסר את הסופרנאטנט.
      2. הוסיפו 200 μL חיץ כביסה/דילול צונן לצינור microcentrifuge. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. חזרו על הפעולה במשך 2 שטיפות בסך הכל.
        הערה: הכן את החומרים הדרושים ליצירת GEM וברקוד במהלך שני השלבים הקודמים14.
      3. כדי להכין את מלאי התאים, בהתבסס על מספר התא הכולל המחושב ב-2.1.2.12., יש לבצע החייאה של התאים במספיק חיץ שטיפה/דילול כדי להשיג את ריכוז התאים הרצוי. ריכוזי התאים המועדפים הם בין 700 ל-1200 תאים/μL.
      4. קבע את ריכוז התאים של מלאי התאים באמצעות המוציטומטר.
      5. המשך מיד ליצירת GEM וברקוד באמצעות מלאיהתאים 14.
    3. רצף
      1. בעת ביצוע ניתוח קורס זמן (כמו בפיתוח או במחלה), רוצף דגימות מרובות בריצת מולטיפלקסד (כלומר, ספריות מרובות על תא זרימה יחיד) כדי לצמצם את השונות הטכנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת עבודה זו מתווה אסטרטגיה לחקירת פנוטיפים התפתחותיים ותהליכים רגולטוריים באמצעות ריצוף של תאים בודדים. ריבוב דגימות MULTI-seq מאפשר בדיקת פנוטיפ ראשונית בעלות נמוכה, בעוד שאיסוף וקיבוע מזווגים של דגימות עבור scRNA-seq ו-scATAC-seq מאפשרים חקירה מעמיקה יותר (איור 1).

ברקוד MULTI-seq מאפשר ריצוף משולב של דגימות מרובות ואת הדה-קונבולוציה החישובית שלהן לאחר מכן. ניתן לקבוע את דגימת המקור עבור כל תא על סמך ביטוי הברקוד שלו (איור 2A). נ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

העוצמה של MULTI-seq נובעת משילוב חלק של נתונים ממצבים או מודלים ניסיוניים מרובים ומהתועלת העצומה במונחים של עלות והגבלת השפעות אצווה. שימוש ב- MULTI-seq מציע עומק פנוטיפי חסר תקדים במעבדה. שיטות ריבוב לא גנטיות כגון גיבוב תאים או גיבוב גרעינים פתחו את הדלת לדגימות מרובות באמצעות שימוש בנוגדנים ברקוד 7,19,20. עם זאת, זה מסתמך על הזמינות של נוגדנים בעלי זיקה גבוהה המזהים חלבונים על פני השטח המתבטאים בתאים או בגרעינים שלהם, מה שלא ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים ללינדה אורזולק מהתעתיק של ג'ונס הופקינס ולליבת הריצוף העמוק על העזרה בריצוף הספריות שהופקו ולליזי ג'יאנג על ביצוע גולשי הרשתית ex vivo .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 ומיקרו; L, 200 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; L קצות
10% טווין 20Bio-Rad1662404
100 ומיקרו; בקשת פתרון ברקוד Mממעבדת גרטנרhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= אמיתי
100% אתנולMillipore SigmaE7023-500ML
100% מתנולMillipore Sigma322415-100ML
10x מחזיק שבב 10xגנומיקה1000195
10x בקר כרום & ערכת אביזר10x גנומיקהPN-120263
15 מ"ל איכות צינור צנטריפוגהביולוגיP886-229411
40 ומיקרו; m מסננת תאים FlowMiבל-ארטH13680-0040
50 ומיקרו; M Anchor SolutionSigma או בקשה ממעבדת גרטנרhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
= נכון
50 ומיקרו; M Co-AnchorSolution Sigma או בקשה ממעבדת גרטנרhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested
=נכון
5200 מערכת מנתח שבריםAgilentM5310AA
70 um FlowMi מסננת תאיםBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R צנטריפוגהVWRBK392302
בקר סרום אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A9647
כרום הבא GEM שבב G10x גנומיקהPN-1000120
כרום הבא GEM שבב H10x גנומיקהPN-1000161
כרום הבא Gem יחיד תא ATAC ריאגנט ערכת v1.110x גנומיקהPN-1000175
כרום תא יחיד 3' GEM, ספרייה & ערכת חרוזי ג'ל v3.110x גנומיקהPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
מיקרוסקופ דיסקציהLeica
DNA LoBind Tubes, 1.5 מ"לEppendorf22431021
קרח
EVA קצף מחבתקרח Tequipment04393-54
FA 12-נימי מערך קצר, 33 ס"מAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water BathFisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 חממה עם מעטפת מיםThermoFisher Scientific3110
גליצרול 50% תמיסה מימיתRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Bright-Line Counting ChamberFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq או NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
איכות מאגר TE נמוכהביולוגית351-324-721
תמיסת מגנזיום כלוריד 1 MSigma-AldrichM1028
מתלה מפריד מגנטי לצינורות 1.5 מ"לMillipore Sigma20-400
מתלה מפריד מגנטי עבור 200 ומיקרו; צינורות L10x גנומיקהNC1469069
MULTI-seq פריימרסיגמא או IDTראה רשימת
MyFuge מיני צנטריפוגהבנצ'מרק מדעיC1008
Nonidet P40 תחליףסיגמא-אולדריץ'74385
מים ללא נוקלאזפישר סיינטיפיקAM9937
P2, P10, P20, P200, P1000 מיקרופיפטותEppendorf
Worthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7.4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Qiagen Buffer EBQiagen19086
צנטריפוגה מקוררת 5424 REppendorf2231000655
עלי גלולה חד פעמיים ללא RNaseפישר סיינטיפיק12-141-368
מעכב RNasePromegaN2615
RPI פריימרסיגמא או IDTראה רשימת
ערכת אינדקס יחיד N, Set A10x GenomicsPN-1000212
ערכת אינדקס יחיד T סט A10x גנומיקהPN-1000213
תמיסת נתרן כלורי 5 Mסיגמא-אולדריץ'59222C
SPRIselect Reagent Kitבקמן קולטרB23318
פיפטות העברה חד פעמיות סטנדרטיותפישר סיינטיפיק13-711-7M
TempAssure PCR רצועת 8 צינורותארה"ב Scientific1402-4700
תמיסת טריזמה הידרוכלוריד, pH 7.4תמיסת סיגמא-אולדריץ'T2194
טריפן כחול, 0.4% (w/v)קורנינג25-900-CI
פריימר I5 אוניברסליסיגמא או IDTראה רשימת
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
מערבולת מערבולתVWR10153-838
מסנן פיפטהיבשרצפים מערכת דיסוציאציה של פפאין רצפיםרצפים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. 370, (2020).
  2. Nagalakshmi, U., et al. The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).
  5. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).
  6. McGinnis, C. S., et al. MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices. Nature Methods. 16, 619-626 (2019).
  7. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19, 224(2018).
  8. Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling. Nature Communications. 9, 5345(2018).
  9. Hoang, T., et al. Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration. Science. , 8598(2020).
  10. Clark, B. S., et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification. Neuron. 102, 1111-1126 (2019).
  11. Zheng, Y., et al. A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19. Protein Cell. 11, 740-770 (2020).
  12. Satpathy, A. T., et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion. Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).
  13. Worthington Biochemical Corporation. Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System. , (2020).
  14. 10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide. , (2020).
  15. Agilent. DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems. , (2015).
  16. ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. ThermoFisher Scientific. , (2015).
  17. 10x Genomics. Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry). , (2020).
  18. Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling. bioRxiv. , (2020).
  19. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nature Methods. 14, 865-868 (2017).
  20. Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10, 2907(2019).
  21. Ma, S., et al. Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin. Cell. , (2020).
  22. Buenrostro, J. D., et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell. 173, 1535-1548 (2018).
  23. Pliner, H. A., et al. Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data. Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).
  24. Granja, J. M., et al. ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis. BioRxiv. , (2020).
  25. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177, 1888-1902 (2019).
  26. METABRIC Group. The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups. Nature. 486, 346-352 (2012).
  27. Izadi, F. Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network. Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell RNA SeqSingle Cell ATAC SeqRetinal Gene ExpressionChromatin AccessibilityGene Regulatory NetworksMULTI Seq BarcodingCell Type IdentificationCell ClusteringSample BarcodingRetinal Development

Related Articles