מיקרוסקופיה לסריקת לייזר קונפוקלית של דינמיקת סידן בפרוסות רקמת לבלב חריפה של עכבר

הלבלב של היונקים הוא בלוטה אקסוקרינית ואנדוקרינית גדולה. החלק האקסוקריני מהווה 96-99% מנפח הלבלב הכולל ומורכב מאצ'יני ותעלות. החלק האנדוקריני מורכב ממספר רב של איים של לנגרהנים המהווים את 1-4% הנותרים של נפח הלבלב הכולל¹. החלק האקסוקריני מפריש אנזימי עיכול עיקריים המפרקים פולימרים עשירים באנרגיה במזון, כמו גם נוזל עשיר בביקרבונט, המשלב הפרשות אחרות במערכת העיכול כדי לספק סביבה המתאימה לפעולה של אנזימים. החלק האנדוקריני מפריש הורמונים המווסתים את ההתפלגות, האחסון והשחרור הבין-פרינדיאלי של חומרים מזינים עשירים באנרגיה. אף על פי שהרקמה האקסוקרינית אינה מפותחת יחסית והאנדוקרינית מפותחת יחסית בלידה, הראשונה מתגברת במהירות על האחרונה עם גמילה^{של 2,3,4}. מחקרים מוקדמים על תפקוד הלבלב סימנו את לידתה של הפיזיולוגיה המודרנית, וההתקדמות המתודולוגית העיקרית בתחום לוותה בשברים מדעיים גדולים⁵. העבודה עם הלבלב היא מאתגרת מבחינה טכנית בשל המבנה המורכב של הבלוטה, אך היא גם מוטיבציה גדולה בגלל מחלות כמו סרטן הלבלב, דלקת הלבלב וסוכרת המהוות איומים גדולים על בריאות הציבור, ואשר עבורן יש צורך בגישות טיפוליות חדשניות.

איים מבודדים⁶, אצ'יני ^7,8 ושברי צינורות פותחו ושימשו במשך עשרות שנים כשיטות תקן זהב בשל יתרונותיהם בהשוואה לקווי תאים ותאים אנדוקריניים, אצינריים ותאים דוקטליים מפוזרים ראשוניים ^9,10. למרות התפקוד המשופר במידה ניכרת של קולקטיבים של תאים מבודדים, שיטות אלה עדיין כרוכות בלחץ מכני ואנזימטי ניכר, מבודדות תאים מהרקמה הסובבת ולכן חסרות אינטראקציות פאראקריניות ותמיכה מכנית, והכי חשוב, מלוות בשינויים משמעותיים בפיזיולוגיה הרגילה 11,12,13 . פרוסת רקמת הלבלב החריפה של העכבר פותחה בשנת 2001 מתוך צורך נתפס לפתח פלטפורמה ניסיונית הדומה לפרוסות מוח, יותרת המוח ואדרנל עם מגעים בין-תאיים משומרים, אינטראקציות פאראקרין, מזנכים וארכיטקטורת רקמות, כמו גם ללא כמה מהחסרונות החשובים ביותר של שיטת תקן הזהב במחקר האיים של אותה תקופה - האיים המבודדים^{12, 14}. בין החסרונות הללו ניתן למנות את הפגיעה בשכבות החיצוניות ביותר, היעדר נגישות לאזורי הליבה של האיים, והצורך בטיפוח עם השפעות חשובות על זהות התא ועל הפיזיולוגיה^12,15. יתר על כן, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מחקרים על מודלים של בעלי חיים עם ארכיטקטורת איים מעוותת באופן גס, שבהם לא ניתן לבודד איים, או כאשר תפוקת האיים נמוכה ביותר על ידי בידוד מסורתי 16,17,18,19,20,21.

בנוסף, הפרוסה מתאימה יותר לחקר שינויים מורפולוגיים במהלך התפתחות סוכרת ודלקת הלבלב, למשל, מכיוון שהיא מאפשרת סקירה טובה יותר של הרקמה כולה ותואמת גם את חקר ההבדלים האזוריים. חשוב לציין שלמרות ההתמקדות המוקדמת בחלק האנדוקריני, שיטת פרוסת הרקמה מאפשרת מטבעה לחקור את הרכיבים האקסוקריניים ^9,22,23. במהלך העשור הראשון לאחר הצגתה, נעשה שימוש בשיטה למחקרים אלקטרופיזיולוגיים של תאי בטא 14,24,25,26,27,28,29 ואלפא^30,31 וכן לבחינת ההבשלה המורפולוגית והתפקודית של הלבלב ^2,3 . עשור לאחר מכן, בשנת 2013, השיטה הותאמה בהצלחה להדמיית סידן בתאים חיים של תאי איון באמצעות CLSM כדי לאפיין את תגובותיהם לגלוקוז³², את דפוסי הקישוריות התפקודיים שלהם³³, ואת הקשר בין פוטנציאל הממברנה לסידן תוך-תאי על ידי שילוב צבע סידן פלואורסצנטי עם צבע פוטנציאלי של קרום³⁴. מאוחר יותר באותה שנה, השיטה שימשה גם להערכת דינמיקת הסידן בתאים אצינריים^22,35. במהלך השנים הבאות, פרוסות רקמת הלבלב שימשו במספר מחקרים שונים והותאמו בהצלחה לרקמת חזירים ובני אדם 9,36,37,38,39,40,41. עם זאת, יחד, הדמיית סידן - בפרוסות רקמת הלבלב של העכבר בכלל ובאיים בפרט - עדיין מבוצעת בעיקר על ידי קבוצה זו. אחת הסיבות העיקריות לכך עשויה להיות טמונה בשילוב של הכנת פרוסת רקמה מאתגרת מבחינה טכנית, הצורך במיקרוסקופ קונפוקלי וניתוח נתונים מורכב למדי. המטרה העיקרית של המאמר הנוכחי היא להפוך את השיטה החזקה הזו לנגישה יותר למשתמשים פוטנציאליים אחרים.

ישנם כבר כמה מאמרים מתודולוגיים מצוינים העוסקים בפירוט בהכנת פרוסות טישו ושימוש בפרוסות למחקרים מבניים והפרשתיים, אך לא להדמיית סידן קונפוקלית ^9,42,43. לכן, מאמר זה מתמקד בכמה טיפים וטריקים נוספים במהלך הכנת פרוסות, בשלבים קריטיים לטעינת צבע מוצלחת, רכישת תמונה, כמו גם על השלבים העיקריים של ניתוח נתוני סידן בסיסי. לפיכך, יש לראות בתרומה זו משלימה ולא כחלופה לשיטה הנ"ל ולא כחלופה לשיטה הנ"ל. באופן דומה, הדמיית סידן בפרוסות רקמת לבלב של עכברים תיתפס כגישה ניסיונית שיש להשתמש בה כדי לענות על שאלות ספציפיות ולכן היא משלימה ולא חלופה מוחלטת לגישות הדמיית סידן אחרות בפיזיולוגיה של הלבלב כגון צינורות מבודדים או אצ'יני, איונים מבודדים, אורגנואידים, איונים המושתלים בתא הקדמי של העין, והקלטות in vivo 11,44,45,46,47,48. ההבטחה להדמיית סידן בפרוסות רקמת הלבלב של עכברים מומחשת כנראה בצורה הטובה ביותר על ידי הקלטות מוצלחות אחרונות של דינמיקת סידן בתאים מזנכימליים באיים כגון פריסיטים⁴⁹ ומקרופאגים⁵⁰, כמו גם בתאי צינור²³.

הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם במחקר. הפרוטוקול אושר על ידי מינהל הרפובליקה של סלובניה לבטיחות מזון, מגזר וטרינרי והגנת הצומח (מספר היתר: 34401-35-2018/2).

1. הכנת פרוסות רקמת הלבלב

הערה: הכנת פרוסות רקמות לבלב חריפות של עכברים להדמיית סידן באמצעות CLSM דורשת מספר מכשירים, תמיסות שונות, ומתקדמת בסדרה של שלבים קריטיים המוצגים באופן סכמטי באיור 1 ומתוארים בפירוט להלן.

איור 1: דיאגרמת זרימת עבודה. ייצוג סכמטי של כל השלבים בתהליך הכנת פרוסת רקמת הלבלב, החל בהזרקת אגרוז לתוך צינור המרה המשותף, ואחריו מיצוי הלבלב וחיתוך. הפרוסות המוכנות יכולות לשמש להערכת הכדאיות של הרקמה באמצעות ערכת Live/Dead או מוכתמות בחיישן סידן. ברגע שהם מוכתמים, הם מוכנים להדמיה. הקלטות המתקבלות מתהליך ההדמיה משמשות לאחר מכן לניתוח נתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

1. הכנת פתרונות
   הערה: יש להכין את כל הפתרונות מראש וניתן לאחסן אותם במקרר בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד חודש. להכנה ואחסון של פרוסות טישו, יש צורך בכ-0.5 ליטר של תמיסה חוץ-תאית (ECS) עם 6 מ"מ גלוקוז ו-0.3 ליטר של 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזין-אתאנסולפונית (HEPES) מאגר חומצה (HEPES). עבור יום אחד של הדמיית סידן עם מערכת פריפוזיה שנקבעה בקצב זרימה של 1-2 מ"ל לדקה, יש צורך בכ-0.5 ליטר של ECS.
   1. תמיסה חוץ-תאית עם 6 mM גלוקוז
      1. הכן 1 ליטר של ECS המכיל 125 mM NaCl, 26 mM NaHCO₃, 6 mM גלוקוז, 6 mM חומצה לקטית, 3 mM מיו-אינוזיטול, 2.5 mM KCl, 2 mM Na pyruvate, 2 mM CaCl₂, 1.25 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂, ו 0.5 mM חומצה אסקורבית. מערבבים היטב עד שכל המרכיבים מתמוססים לחלוטין. קח 50 μL של ECS לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, להניח אותו על האוסמומטר על פי הוראות היצרן, ולבדוק את osmolarity.
         הערה: osmolarity צריך להיות 300-320 mOsm. לגירוי של תאי בטא, השתמש בתמיסות עם ריכוזי גלוקוז גבוהים יותר. כדי להבטיח ערך pH פיזיולוגי של 7.4 במהלך חיתוך וניסויים, כל הזמן מבעבעים את ה-ECS עם קרבוגן (כלומר, תערובת גזים של 95% O₂ ו-5% CO₂) בלחץ ברומטרי. ניתן להגדיר מערכת מבעבעת פשוטה על ידי חיבור קצה אחד של צינורות סיליקון בקוטר 5 מ"מ למקור של קרבוגן (כלומר, בלון גז בלחץ) והקצה השני של הצינורות המונח ישירות לתוך הבקבוק המכיל ECS.
      2. לחלופין, הכינו מלאי 10x המכיל 1250 mM NaCl, 260 mM NaHCO₃, 30 mM מיו-אינוזיטול, 25 mM KCl, 20 mM Na pyruvate, 12.5 mM NaH₂PO₄, ו 5 mM חומצה אסקורבית. כאשר יש צורך ב- ECS המכיל 6 mM גלוקוז, יש לערבב 100 מ"ל מהמלאי עם 2 מ"ל של 1 M CaCl₂, 1 מ"ל של 1 M MgCl₂, 0.455 מ"ל של 13.2 M חומצה לקטית, ו-1.08 גרם גלוקוז, ולמלא במים מזוקקים כפולים עד 1 ליטר. במידת הצורך, השתמש בכמויות שונות של גלוקוז כדי להשיג ריכוזי גלוקוז אחרים.
   2. חיץ HEPES עם 6 mM גלוקוז
      1. הכן 0.5 ליטר של תמיסה עם חציצה HEPES (HBS) המכילה 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 6 mM גלוקוז, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂ ו- 1 mM MgCl₂; titrate ל- pH = 7.4 עם 1 M NaOH.
         הערה: אם קרבוגן אינו זמין, ניתן להשתמש במאגר זה עבור כל השלבים במקום ECS.
   3. אגרוז (1.9% w/w)
      1. מחממים מראש אמבט מים ל-40 מעלות צלזיוס.
      2. הוסיפו 0.475 גרם של אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ו-25 מ"ל של ECS המכיל 6 מ"מ גלוקוז לבקבוקון ארלנמאייר, והניחו את הבקבוקון בתנור מיקרוגל בעוצמה מקסימלית למשך מספר שניות עד שהוא מתחיל לרתוח. מוציאים את הבקבוקון מהתנור ומסובבים אותו כמה פעמים, עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין. מעבירים את הבקבוקון עם האגרוז הנוזלי לאמבט המים המלוחמים מראש ב-40 מעלות צלזיוס כדי לקרר את האגרוז לטמפרטורה הרצויה ולשמור עליו נוזלי עד ההזרקה. מאבטחים את הבקבוקון באמצעות טבעת עופרת מייצבת.
         הערה: ניתן להכין את האגרוז מראש ולשמור במקרר. לפני השימוש, מחממים את האגרוז בתנור המיקרוגל עד שהוא נוזל, ומעבירים את בקבוקון ארלנמאייר לאמבטיית מים מתוכננת מראש ל-40 מעלות צלזיוס. ניתן להשתמש מחדש באגרוז עד פי 5. אם נעשה בו שימוש חוזר מעבר ל-5x, הוא יהפוך צפוף וקשה יותר להזרקה.
2. הזרקת לבלב עם אגרוז
   הערה: סעיפים 1.2 ו-1.3 מסבירים את הכנת פרוסות הרקמות שניתן להשתמש בהן למטרות ניסוי שונות כגון הדמיית סידן, אלקטרופיזיולוגיה, אימונוהיסטוכימיה, מחקרי הפרשה ומחקרים מבניים/מיקרו-אנטומיים.
   1. מלאו מזרק 5 מ"ל עם האגרוז הנוזלי מבקבוקון ארלנמאייר באמבט המים משלב 1.1.3.2, הסירו את כל הבועות והרכיבו מחט 30 גרם. הגן על המחט עם כובע, ושמור את המזרק המלא בחזרה באמבט המים כאשר המחט פונה כלפי מטה וכל נפח האגרוז מתחת לפני המים. אבטח את המזרק באמצעות טבעת עופרת מייצבת באופן כזה שהטבעת לוחצת את המזרק על קיר אמבט המים.
      הערה: היזהר לא לדחוף כל אגרוזה לתוך המחט מכיוון שהיא תתקשה במהירות ותחסום את המחט. אם טמפרטורת החדר נמוכה, ואם ההזרקה מבוצעת על ידי אדם פחות מנוסה, הגדל את הטמפרטורה של אמבט המים עד 42 °C (74 °F) כדי לקבל קצת זמן נוסף להזרקה.
   2. מלאו דלי קרח בקרח, והניחו את הבקבוק המכיל בו ECS. מבעבעים את ה-ECS כל הזמן ב-1.5 מ"ל/דקה עם קרבוגן בלחץ ברומטרי וטמפרטורת החדר כדי להבטיח חמצון ו-pH של 7.4.
   3. להקריב עכבר על ידי מתן ריכוז גבוה של CO₂ ואחריו פריקה צוואר הרחם. עשו את כל המאמצים כדי למזער את סבלם של בעלי החיים.
   4. בעבודה תחת סטריאומיקרוסקופ, ניגשו לבטן דרך לפרוטומיה (איור 2A). הפוך בעדינות את המעיים לצד שמאל של העכבר (מנקודת המבט האנטומית של העכבר) כדי לחשוף את צינור המרה המשותף. השתמש במלקחיים כדי להרים מעט את החלק התריסריון, ולמצוא את הפפילה-פפילה-פפילה של התריסריון הגדול של ואטר. מהדקים את צינור המרה הנפוץ בפפילה התריסריון באמצעות המוסטאט (איור 2B,C) כדי למנוע דליפה של אגרוז מהצינור לתוך התריסריון.
      הערה: כדי למנוע דליפת אגרוז לתוך התריסריון ועוד למעלה ולמטה במערכת העיכול, מניחים את ההמוסטט באופן כזה שהוא גם מהדק את התריסריון הן באופן פרוקסימלי והן דיסטלי מהפפילה. עדיף להשתמש hemostat מעוקל למטרה זו.
   5. עם מלקחיים חדים קטנים, להגיע מתחת לצינור המרה המשותף, ולשבור את הממברנה המחברת את הצינור לרקמת הלבלב. לשליטה ויזואלית טובה יותר ולהזרקה קלה יותר, יש לנקות כמה שיותר שומן ורקמת חיבור מהצינור.
   6. מניחים את הצינור בניצב על מלקחיים גדולים (איור 2D), ומזריקים את האגרוז הנוזלי המוכן לחלק הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף (איור 2D). הקפידו לסחוט את המזרק בחוזקה מכיוון שהאגרוז צמיג. ממשיכים למלא את הלבלב עד שהוא הופך לבנבן ומעט מעוות או לפחות 20-30 שניות.
      הערה: זהו השלב הקריטי ביותר בהכנת פרוסות. אם יש סטיות כלשהן בעץ הצינור של הלבלב, הגבהו או משכו את הלבלב בעדינות הרחק מהמזרק כדי ליישר אותם. אין להחליט מתי להפסיק את ההזרקה על סמך נפח ההזרקה מהמזרק, שכן הזרימה האחורית בנקודת ההזרקה והדליפה קדימה לתוך התריסריון בדרך כלל גבוהים בהרבה מהנפח המוזרק לעץ הצינור של הלבלב. חשוב לציין, זריקות מוצלחות יכולות להתבצע עם שינויים כמעט בלתי מורגשים בנפח המזרק.
   7. הסירו את המזרק, ושפכו באיטיות 20 מ"ל של ה-ECS הקר כקרח מבעבע בטמפרטורה של 0-4 מעלות צלזיוס מהבקבוק אל הלבלב כדי לקרר את הרקמה ולהקשיח את האגרוז.
   8. יש לחלץ בעדינות את הלבלב באמצעות מלקחיים ומספריים דקיקים בחיתוך קשיח. מכניסים את הלבלב שחולץ לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ המכילה כ-40 מ"ל של ECS קר כקרח, ומזיזים אותה בעדינות כדי לשטוף אותה. מעבירים את הלבלב לתוך צלחת פטרי טרייה בקוטר 100 מ"מ המכילה כ-40 מ"ל של ECS קר כקרח.
   9. מהחלק המוזרק היטב של הלבלב, שנראה לבנבן (איור 3A), חתכו עד 6 גושי רקמה, בגודל 0.1-0.2 ס"מ³ , באמצעות מלקחיים ומספריים קשים. נקו אותם מכל רקמת חיבור ושומנית.
   10. מלאו תבשיל תחתית-פטרי לא דביק בקוטר 35 מ"מ בכ-5 מ"ל של אגרוז נוזלי בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס, העבירו לתוכה את גושי הרקמה, ומיד הניחו את צלחת הפטרי על הקרח כדי לקרר אותה ולהקשיח את האגרוז.
       הערה: האופן שבו גושי הלבלב נלכדים באגרוז קובע את האופן שבו הם נחתכים במהלך החיתוך. נסיינים מנוסים יכולים לנסות לכוונן את מיקום הבלוקים ברגעים הספורים שלפני שהאגרוז מתקשה כאשר הוא מונח על קרח.
   11. לאחר שהאגרוז עם בלוקי הרקמה מתקשה, הופכים את צלחת הפטרי על משטח חלק ושטוח כמו המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ, ומסירים את האגרוז על ידי חיתוך עדין עם חצי סכין גילוח לתוך השוליים שבין הדופן הצדדית של צלחת פטרי לבין האגרוז. בעזרת סכין גילוח, חותכים קוביות אגרוז בודדות, שכל אחת מהן מכילה גוש רקמה אחד, ומטפלים בכך שכל גוש רקמה מוקף באגרוז. הדביקו את גושי האגרוז על צלחת הדגימה של הוויברטום באמצעות דבק ציאנואקרילט (איור 3B).

איור 2: הזרקת אגרוז לתוך צינור המרה המשותף. (A) פתחו את חלל הבטן, וחשפו את האיברים בחלל הצפק. (ב) החלק המוגדל של השטח הסגור על ידי המלבן בלוח A. הכתם הלבן על התריסריון (המסומן על ידי החץ) מציין את האמפולה של ואטר. איי לנגרהאנס מסומנים על ידי ראשי חץ. (C) מהדקים את האמפולה של ואטר על ידי המוסטאט מעוקל, ומעלים אותה מעט כדי לחשוף ולמתוח בעדינות את צינור המרה המשותף (חץ). (D) שימורים של צינור המרה הנפוץ והזרקה של תמיסת אגרוז של 1.9% באמצעות מזרק 5 מ"ל ומחט של 30 גרם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

3. חיתוך
   1. מלאו את תא החיתוך של הוויברטום בכ-0.15 ליטר של ECS קר כקרח, ובועטים ללא הרף בקרבוגן. הקיפו את תא החיתוך בקרח, והוסיפו 2 קוביות קרח (כ-10 מ"ל כל אחת) העשויות מ-ECS עם גלוקוז של 6 מ"מ לתוך תא החיתוך. הרכיבו את סכין הגילוח לחיתוך על הוויברטום, והברגו במקומו את צלחת הדגימה עם בלוקי אגרוז.
   2. הגדר את החותך לחתוך בלוקים אגרוזים ב-0.05 עד 1 מ"מ לשנייה ו-70 הרץ לפרוסות בעובי 140 מיקרומטר עם שטח פנים של 20-100 מ"מ². לקבלת הגדרות כלי פריסה, בצע את הוראות היצרן.
   3. מיד לאחר כל שלב חיתוך, השהו את החתך, אספו בעדינות את הפרוסות במברשת צבע עדינה והעברו אותן לצלחת פטרי 100 מ"מ מלאה ב-40 מ"ל של חיץ HEPES עם 6 מ"מ גלוקוז בטמפרטורת החדר (איור 3C).
      הערה: ניתן לשמור את הפרוסות במאגר HEPES בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות לפחות, ויש להחליף את המאגר כל 2 שעות.

איור 3: הכנה וחיתוך של רקמת הלבלב. רקמה לבנה משמאל מצביעה על חלק מוזרק היטב (חלק תריסריון), בעוד החלק האדמדם יותר בצד ימין מראה את החלק המוזרק מספיק של הלבלב (חלק splenic). (B) חיתוך ויברטום של שני גושי רקמת לבלב המשובצים באגרוז. (C) פרוסת רקמת לבלב חריפה עם איים של לנגרהנים המסומנים על ידי ראשי חץ. סרגל קנה מידה = 3000 μm. (D) פרוסת רקמת לבלב חריפה מתחת למיקרוסקופ האור עם האי לנגרהנס המצוין על ידי ראש חץ, כוכבית מציינת צינור לבלב. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

2. בדיקה חיה/מתה באמצעות כדאיות חיה/מתה/ערכת ציטוטוקסיות לתאי יונקים

הערה: עבור ניסויים מסוימים, כדאי לבדוק את הכדאיות של התאים בפרוסות (איור 4) על-ידי הבדיקה החיה/מתה באופן הבא.

1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להפשיר בקבוקונים עם ריאגנטים של ערכת LIVE /DEAD Viability / Cytotoxicity, והכן פתרונות עבודה של calcein AM רגע לפני השימוש. השתמש בפתרונות תוך יום אחד.
2. בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, יש לערבב 5 μL של 4 mM calcein AM (רכיב A), 20 μL של 2 mM ethidium homodimer-1 (EthD-1, רכיב B), ו-10 מ"ל של מלוחים עם חיץ פוספט (D-PBS) של D-PBS של Dulbecco כדי להכין תמיסת עבודה המכילה כ-2 μM calcein AM ו-4 μM EthD-1. מערבולת ביסודיות.
3. באמצעות מברשת צבע עדינה, מעבירים בעדינות את פרוסות הרקמה לצלחת פטרי בגודל 3 מ"ל עם חיץ HEPES טרי כדי לדלל את פעילות האסטראז בסרום. הסר את מאגר HEPES וכסה את הפרוסות ב- 100-200 μL (או יותר במידת הצורך) של הפתרון העובד משלב 2.2.
4. דגירו את הפרוסות למשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר בצלחת פטרי סגורה. דמיינו את פרוסות הרקמה באמצעות מסנני עירור/פליטה בהתאם להמלצת היצרן.

3. העמסת צבע סידן

הערה: צבעים פלואורסצנטיים צריכים להיות מוגנים מפני חשיפה לאור במהלך כל תהליך ההכנה וההעמסה של הצבע, כמו גם במהלך הטיפול בפרוסות הרקמה המוכתמות. ניתן להשתמש בנייר כסף לכיסוי צינורות או צלחות פטרי המכילות את צבע הסידן.

1. הכנת צבע
   1. להמיס את התוכן של בקבוקון אחד (50 מיקרוגרם) של צבע מחוון Ca²⁺ החדיר לתא (עירור/פליטה 495/523 ננומטר; ראו טבלת החומרים), 7.5 μL של דימתילסולפוקסיד (DMSO) ו-2.5 μL של הפולקסאמר (20% תמיסה ב-DMSO; טבלת חומרים) ב 6.667 מ"ל של HBS המכיל 6 mM גלוקוז בצינור מכסה בורג 15 מ"ל.
      הערה: פתרון סופי זה מכיל 6 μM של צבע מחוון Ca²⁺ , 0.11% DMSO ו-0.037% פולקסאמר.
   2. לשאוף ולגרש את הפתרון בצינור מכסה הבורג שוב ושוב עם פיפטה במשך 20 שניות; להטביע את הצינור בתא אמבטיה על-קולי במשך 30 שניות, ולסובב מערבולת במשך 30 שניות כדי לשפר את הסולוביליזציה. Aliquot 3.333 מ"ל של תמיסת הצבע הסופית Ca²⁺ מחוון שהוכן בשלב 3.1.1 לתוך 5 מ"ל צלחות פטרי.
2. טעינת צבע
   1. מעבירים את פרוסות הרקמה המוכנות מצלחת פטרי 60 מ"ל עם HBS לתוך 5 מ"ל צלחות פטרי מלאות בתמיסת הצבע על ידי הרמה עדינה של כל פרוסת טישו באמצעות מברשת צבע דקה ורכה והנחתה בתמיסת הצבע. דגירה של עד 10 פרוסות טישו לכל צלחת פטרי.
   2. הניחו את צלחת הפטרי עמוסת הפרוסות על שייקר מסלולי בטמפרטורת החדר שנקבעה לתנועה מסלולית של 40 סיבובים לדקה למשך 50 דקות. דגירה של הפרוסות בתמיסת הצבע החשופה לאוויר הסביבה בטמפרטורת החדר, אך מוגנת מפני אור על ידי כיסוי צלחת הפטרי בנייר כסף.
3. אחסון פרוסות
   1. מעבירים את פרוסות הרקמות המוכתמות מצלחת פטרי 5 מ"ל לצלחת פטרי 60 מ"ל במילוי HBS ללא צבע על ידי הרמתן בעדינות באמצעות מברשת צבע עדינה ורכה. יש לאחסן עד 20 פרוסות לכל צלחת פטרי.
      הערה: השתמש בפרוסות הרקמות להדמיה בשלב זה. פרוסות הרקמה ישמרו על צבע מחוון Ca²⁺ למשך מספר שעות. ניתן לשפר את הישרדות הפרוסות ואת שימור הצבע על ידי הצבת צלחת פטרי במיכל מבודד, מוקף בקרח. זה חשוב במיוחד אם יש להעביר את הפרוסות הטעונות בצבעים. בנוסף, החליפו את ה-HBS כל שעתיים.

4. הדמיית סידן

1. הגדרת המיקרוסקופ הקונפוקלי
   1. בחר הגדלה אובייקטיבית מתאימה בהתאם לעניין של המחקר. בחר 20x ו- 25x (מפתח צמצם מספרי [NA] 0.77-1.00) להדמיית איון שלם, מספר אציני בו-זמנית, או צינורות גדולים יותר. בחר הגדלות גבוהות יותר כדי לחקור את הדינמיקה התוך-תאית.
   2. בחר את מצב הרכישה להדמיית קיטועי זמן (לדוגמה, קיטועי זמן, xyt או מצב דומה). הגדר את חור הסיכה ל- 100-200 מיקרומטר.
   3. קבעו את נתיב האור לפלואורופורים ירוקים: עירור ב-488 ננומטר, ואיסוף פליטה ב-500-700 ננומטר. עדיף לבחור גלאים בעלי נצילות קוונטית גבוהה (למשל, גליום ארסניד פוספיד) על פני גלאים פוטומולטיפליים יותר.
2. הגדרת תא ההקלטה ומערכת הפריפיוז'ן
   1. הרכיבו את תא ההקלטה על השלב מבוקר הטמפרטורה של המיקרוסקופ ומערכת הפריפוזיה (התקנה הניזונה מכוח הכבידה או מבוססת משאבה פריסטלטית, נפח 1 מ"ל). מקם את הכניסה ואת השקע בקצוות הרחוקים של תא ההקלטה כדי למנוע התפתלות של השקע בתוך התא, והגדר את הזרימה ואת הזרימה לערכים שווים (1-2 מ"ל לדקה). הימנעו מסחיפה של גובה המניסקוס הנוזלי והטיפות בפריפוסאט.
   2. הגדר את בקרת הטמפרטורה של מערכת הפריפוזיה ל 37 °C (84 °F. התחל את הפריפוזיה עם הפתרון שאינו מגרה, והכן את הפתרונות הממריצים. שנה את הפתרונות באמצעות שסתומים ממונעים או על ידי החלפה ידנית של הפתרונות המזינים את מערכת הפריפוזיה.
3. שיא הדינמיקה של הסידן
   1. מעבירים פרוסת טישו בודדת לתא ההקלטה. שתקו את פרוסת הרקמה במשקל פלטינה בצורת U עם רשת ניילון מתוחה (למשל, מגרבי ניילון). הימנעו ממיקום חוטי ניילון על מבנה העניין.
   2. אתר איון/אצינוס/תעלה באמצעות אפשרות שדה בהיר. הפעל הדמיה חיה כדי למקם את המבנים הנחקרים בשדה הראייה, והגדר את פרמטרי ההדמיה. מטב את יחס האות לרעש על-ידי התאמת הספק הלייזר, הגברת הגלאי וממוצע הקווים/ניתוק כדי לאפשר הדמיה של התאים תוך שמירה על הספק הלייזר מינימלי.
   3. התאימו את מישור המוקד של ההקלטה לכ-15 מיקרומטר מתחת למשטח החיתוך (איור 5) כדי להימנע מהקלטה של תאים שעלולים להינזק במשטח החיתוך.
   4. רכוש תמונות. הגדר את תדר הדגימה ל- 1-2 הרץ כדי לזהות תנודות בודדות בתחילה, והשתמש בסורק תהודה המסוגל לבצע ממוצע קו מהיר (8-20) בקצב רכישה גבוה יותר (>10 הרץ) כדי להקליט פעילות Ca²⁺ תוך-תאית ([Ca²⁺]_IC). אפשר מרווח (לדוגמה, 30% מזמן הדגימה הכולל) בין תאורת נקודה עוקבת כדי למנוע פוטוטוקסיות. הקלט תמונה ברזולוציה גבוהה (לדוגמה, 1024 x 1024 פיקסלים, ממוצע קו > 50) לפני רכישת סדרת הזמן (ראה סעיף 5).
      הערה: תדר הדגימה של 1-2 הרץ נמצא מתחת לקריטריון Nyquist לתדר רכישה עבור רוב התאים, וצורת האות תהיה תחת דגימה כברירת מחדל.
   5. עיין בתרשים מקוון, אם זמין בתוכנת ההדמיה, כדי לקבל משוב מיידי על תגובת ההכנה, תאורת יתר, הלבנת תמונות וסחף מכני. במקרה של קצב גבוה של הלבנה במהלך הרכישה, עצרו את ההקלטה והפחיתו את כוח הלייזר תוך הגדלת רווח הגלאי כדי לשמור על יחס האות לרעש. במקרה של סחיפה מכנית, יש לבדוק מתח בין צינורות/כבלים לבין שלב המיקרוסקופ וכן דליפת נוזלים או שינויים בנפח בתא ההקלטה. לחלופין, נסה לתקן את הסחף במהלך הרכישה באופן ידני; עם זאת, שים לב כי זה מטבעו יניב תוצאות מוגבלות.
      הערה: תאים אנדוקריניים הם הטרוגניים מאוד בריכוזים קרובים לסף. יש צורך במשך מספיק של גירוי כדי לזהות את טווח העיכובים בהפעלה/השבתה בתאים בודדים. זה חשוב במיוחד לזיהוי מדויק של תגובות מחוץ לתגובות בעקבות פרוטוקולים מעוררי מאוד.
   6. השתמשו בהדמיית סידן כדי להבחין באופן פונקציונלי בין תאים אנדו ואקסוקריניים (איור 6). כדי לתעד פעילות חולפת במהלך ההפעלה וההשבתה, החל גירויים מבלי לעצור את ההקלטה.
   7. שמור את הנתונים לאחר סיום הניסויים (שקול להשתמש בפונקציית שמירה אוטומטית). אפשרו תקופת קירור לפני כיבוי כוח הלייזר כדי לא לפגוע בלייזרים במהלך הליך הכיבוי.

5. ניתוח נתונים

1. בדוק חזותית את ההקלטה באופן איכותי על ידי השמעה חוזרת של הסרטון בהילוך מהיר. בדוק אם יש סחף של תאים משדה הראייה או מהמישור האופטי. אם התרחש סחף בתוך המישור האופטי, השתמש בתוסף תיקון הסחף ב- ImageJ.
2. בחר אזורי עניין (ROIs) באמצעות תוכנת מיקרוסקופ או תוכנת צד שלישי. השתמש בתמונה ברזולוציה גבוהה, בהקרנה מקסימלית או בממוצע המסגרות כהפניה לבחירת ROIs. הפעל מחדש את ההדמיה של קיטועי הזמן כדי להמחיש תאים מגיבים שאינם נראים בתמונות ייחוס. מקם את ה- ROIs כך שהאזור שנבחר של החזר השקעה אינו חופף לתאים שכנים כדי למנוע הצלבת אות בין ROIs.
3. ייצא את נתוני סדרת הזמן כערך ממוצע ROI לכל מסגרת. ייצא קואורדינטות ROI.
4. תיקון נתוני סדרות הזמן להלבנה (איור 7A) על-ידי שימוש בשילוב של התאמה מעריכית וליניארית, כפי שמתואר על-ידי
   (1)
   כאשר x(t) מציין את האות הפלואורסצנטי בנקודת זמן t; xcorr(t) האות המתוקן בנקודות הזמן המתאימות; ו-a, b ו-c הפרמטרים של ההתאמה המחושבים כסכום הריבועים הנמוך ביותר בין ה-corr(t) ל-x(t).
5. נתחו את שלב ההפעלה וההשבתה של התגובה (איור 7B). חשב את הנגזרת הראשונה של נתוני סדרת הזמן, וקבע את השיא ואת השפל של הנגזרת המתאימים להפעלה ולהשבתה, בהתאמה. לחלופין, בחר באופן ידני את תחילת העלייה הפאזית. שמור וייצא את זמני ההפעלה/ביטול ההשבתה ואת קואורדינטות התא המתאימות.
6. נתחו את שלב המישור (איור 7C). זהה תנודות בודדות על-ידי סף הנתונים הגולמיים או על-ידי סף הנגזרת הראשונה של נתוני סדרות הזמן. הגדר את ההתחלה והסוף של תנודה בודדת כזמן המתאים לחצי משרעת של התנודה.
   1. חשב את משך הזמן ואת התדירות של תנודות בודדות עבור כל תא. חשב את הערך ההופכי של מרווח interspike (מתאים לדפוסי פעילות רגילים). לחלופין, חלקו את מספר התנודות במרווח הזמן של הרשומה (מתאים לדפוסי פעילות לא סדירים).
   2. חשב את הזמן הפעיל. ציין את הזמן הפעיל כסכום משכי הזמן, וחלק ערך זה במרווח הזמן. לחלופין, הכפל את התדירות ואת משך הזמן המתאימים לתנודה.
      הערה: חלוקת סכום משכי הזמן במרווח הזמן מספקת תוצאות חזקות, אך יש לה הבחנה סטטיסטית נמוכה כאשר מתקבלת נקודת נתונים יחידה לכל תא. הכפלת התדירות והמשך של תנודה מספקת רזולוציה טמפורלית של תנודה לתנודה.

הזרקת תמיסת האגרוס לתוך צינור הלבלב היא השלב הקריטי ביותר בהכנת פרוסת רקמות הלבלב. ניתן לזהות הזרקה מוצלחת על ידי הלבנה של רקמת הלבלב, כפי שניתן לראות בצד שמאל של איור 3A, בעוד שחלק מוזרק חלקית של הלבלב מוצג בצד ימין של איור 3A. ניתן לזהות את האיים של לנגרהאן בעין בלתי או תחת סטריאומיקרוסקופ, וזה מסייע בחיתוך החלקים המתאימים של הלבלב להטבעה לאחר מכן בבלוקים אגרוזים (איור 3B). בפרוסת רקמת לבלב של עכבר שזה עתה נחתכה, ניתן להבחין בקלות בין איים של לנגרהנים לבין הרקמה האקסוקרינית שמסביב ומזנכים ככתמים לבנים מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 3C) או כמבנים חומים מתחת למיקרוסקופ האור (איור 3D). פרוסות רקמת הלבלב יכולות לשמש לסוגים שונים של ניסויים במשך 12 שעות לפחות לאחר החיתוך. בנוסף להערכה המורפולוגית הגסה תחת הסטריאומיקרוסקופ, מיקרוסקופ האור והתגובות התפקודיות של תאים במהלך הדמיית סידן, ניתן להעריך את הכדאיות של פרוסות רקמת הלבלב (איור 4).

איור 4: כדאיות התאים בתוך פרוסת הרקמה. הכדאיות של התאים נקבעה באמצעות בדיקת Live/Dead. תאים חיים מוכתמים על ידי Calcein AM (מוצג בירוק), בעוד שתאים מתים מוכתמים באתידיום הומודימר-1 (מוצג באדום). קווים צהובים מציינים את המיקום של חתך X-Y של מחסנית Z המוצגת בתחתית ובימין. העומק המלא של מחסנית Z הוא 88 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

עבור ניסויי הדמיית סידן, מחוון הסידן הפלואורסצנטי צריך לחדור דרך כמה שכבות של תאים. איור 5A מציג טעינה מוצלחת של צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים לתוך פרוסת רקמת הלבלב שבה ניתן לזהות תאי איון ואצינר בודדים. לעומת זאת, פרוסות באיור 5B-D אינן אופטימליות בשל חדירה לא מוצלחת של הצבע (איור 5B), היעדר תאי איון (איור 5C) והרבה רקמה נמקית על פני השטח (איור 5D). ניתן להשליך פרוסות כאלה, לבדוק את נוכחותם של איונים נוספים שנחתכים או מוכתמים טוב יותר (ראה טבלה 1 לפתרון בעיות), או להשתמש בהם לתיעוד התגובות של תאים אקסוקריניים.

איור 5: דוגמאות לתכשירים שמישים ובלתי שמישים. (A) דוגמה להכנה מוצלחת של פרוסת רקמת הלבלב עם תאים מוכתמים היטב באיים של לנגרהנס, כמו גם תאי צינור ורקמה אסינארית מסביב. (B) דוגמה לפרוסת טישו מוכתמת בצורה גרועה. (C) דוגמה של איון של לנגרהנים עם הפסקות מבניות. (D) דוגמה לאי של לנגרהנים המכיל תאים מתים רבים והרבה פסולת. טבלת בדיקת המידע "זוהר-מעל, זוהר-תחת" בצד ימין מציגה עוצמה 0 בירוק ורוויה בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

תוצאות מייצגות מהדמיית סידן באמצעות צבע האינדיקטור Ca2+ החדיר לתאים מוצגות באיור 6. באיור 6A מוצגת תמונה ברזולוציה גבוהה של פרוסת רקמת לבלב, המכילה איון של לנגרהנים, רקמה סינרית וצינור לבלב. להבחנה טובה יותר, החלק האנדוקריני, האקסוקריני והצינורי של פרוסת רקמת הלבלב המוצג באיור 6A צבועים באיור 6B. שימוש בגירויים מתאימים יכול להבחין באופן פונקציונלי בין תאי איון שונים, או תאי איון ולא תאי איון51. תאי בטא יגיבו בדרך כלל לגירוי של דופק ריבועי על ידי גלוקוז עם עלייה חולפת ב-[Ca2+] IC ואחריה תנודות סידן מהירות על מישור מתמשך (איור 6C, פאנל עליון).

מכיוון שכל תאי הבטא מצומדים לסינסיטיום יחיד, גדול ומתפקד, תנודות אלה גם מסונכרנות היטב בין תאים שונים באמצעות התפשטות גלי IC [Ca2+] 32,34,52,53,54 (איור 7C). תנודות IC איטיות יותר [Ca2+] עם פרק זמן של 5-15 דקות עשויות לעמוד בבסיס התנודות המהירות או אפילו להיות הסוג השולט של תגובה55,56. אותו פרוטוקול פשוט עשוי לחשוף סוגים אחרים של תגובות, במיוחד בשולי האיים (איור 6C, פאנל תחתון). מכיוון שתאים אלה אינם מסונכרנים עם תאי בטא ומגיבים עם תנודות מהירות ולא סדירות יותר שכבר קיימות בתנאי גלוקוז נמוכים או עם ירידה בפעילות, תגובות כאלה מרמזות מאוד על תאים שאינם בטא 21,32,57,58. עם זאת, האפיון התפקודי הסופי שלהם דורש פרוטוקולים מורכבים יותר עם שלבי גירוי נוספים או גישות חלופיות, שיידונו להלן. תגובות אופייניות של תאים אצינריים ותאים דוקטליים מוצגות באיור 6D ובאיור 6E, בהתאמה. עיין בספרות לקבלת פרטים נוספים על תאים אצינריים ותאים צינוריים 22,23,35.

איור 6: תוצאות מייצגות של דינמיקת סידן בסוגים שונים של תאי לבלב. סרגל קנה מידה = 100 μm. (B) תיחום של חלקים שונים של רקמת הלבלב עם רקמה אסינארית המוצגת בצהוב, איון של לנגרהנים המוצג באדום, וקטע של עץ הצינור בכחול. סרגל קנה מידה = 100 μm. (C) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן בתאי בטא ותאי פוטטיביים שאינם בטא במהלך גירוי עם גלוקוז של 12 mM; 3 mM גלוקוז שימש למצבים שאינם מעוררים. פרוטוקולים שניתן להשתמש בהם לאפליה ספציפית יותר של תאים שאינם בטא מתוארים בסעיף הדיון. (D) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים אצינריים מגורה על ידי אצטילכולין של 25 ננומטר. (E) עקבות אופייניים של דינמיקת סידן של תאים צינוריים המעוררים על ידי חומצה כנודאוקסיכולית של 1 mM. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

לאחר הדמיית סידן מוצלחת, הנתונים מיוצאים ומתוקנים תחילה להלבנה על ידי שילוב של התאמה מעריכית וליניארית, כמתואר בסעיף הפרוטוקול. סדרת זמן לפני ואחרי תיקון הלבנה מוצגת באיור 7A. לאחר מכן, ניתן לנתח מספר פרמטרים בשלב ההפעלה וההשבתה של התגובה, כמו גם את שלב המישור. ניתן למדוד עיכוב בהתפרצות של [Ca2+]IC עלייה לאחר גירוי כפי שהוא מיוצג על ידי עיכובA באיור 7B וההטרוגניות בעיכובים בין תאים בודדים (עיכובA1). ניתן להשתמש באותם פרמטרים (השהיהD ו- delayD1) כדי לתאר את שלב ההשבתה. בעקבות העלייה הארעית הראשונית [Ca2+] IC , שלב הרמה ברוב תאי הבטא של הלבלב באי מתאפיין בתדר גבוה יחסית [Ca2+]IC תנודות IC בתדירות גבוהה. ניתן לתאר את שלב המישור על ידי ניתוח הפרמטרים הפונקציונליים הקלאסיים. ההצגה הסכמטית של משך הזמן, התדירות ואחוז הזמן הפעיל של [Ca2+]IC מוצגת באיור 7C. בהדמיית סידן עם קצבי רכישה גבוהים מ-10 הרץ, ניתן לזהות בבירור גם גלי סידן המתפשטים שוב ושוב על פני האי (איור 7C).

איור 7: ניתוח של נתוני סדרות זמן. (B) ניתוח עיכובים בהפעלה לאחר גירוי ולהשבתה לאחר הפסקת גירוי עם גלוקוז של 12 מ"מ. משך הגירוי מסומן על ידי הפס האפור הבהיר, המוצלל בתמונה. (C) ניתוח של מספר פרמטרים של שלב המישור: I) משך התנודה שנקבע בחצי גובה, II) תדירות התנודות הנקבעות על ידי מרווחי בין תנודות. III) זמן פעיל כתוצר של תדירות ומשך של תנודות. I-IV) עיכובים בין תנודות בכל גל נתון של תנודות המתפשטות על פני האי לנגרהנס שנקבעו על ידי העיכובים (Δt) בזמן שבו תא יחיד מגיע לחצי גובה של התנודה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר כל אינטרס מסחרי או כספי.