עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.
מאמר שיטה
עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.
אבחון מגיפת SARS-CoV-2 המתמשכת נמצא בראש סדר העדיפויות של כל המדינות ברחבי העולם. נכון לעכשיו, PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR) הוא תקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2 מכיוון שאין פתרון קבוע זמין. יעילה ככל שתהיה טכניקה זו, התגלו מחקרים המראים את מגבלותיה בזיהוי ואבחון, במיוחד כשמדובר במטרות נמוכות בשפע. לעומת זאת, PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), טכנולוגיה מתפתחת לאחרונה עם יתרונות עדיפים על qPCR, הוכחה להתגבר על האתגרים של RT-qPCR באבחון של SARS-CoV-2 מדגימות מטרה בשפע נמוך. באופן פרוספקטיבי, במאמר זה, היכולות של RT-ddPCR מורחבות עוד יותר על ידי הצגת שלבים כיצד לפתח סימפלקס, דופלקס, תערובת בדיקה טריפלקס ומבחני quadruplex באמצעות מערכת זיהוי שני צבעים. באמצעות פריימרים וגשושיות הממוקדים באתרים ספציפיים של גנום SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 ו-RBD2), הפיתוח של בדיקות אלה הוכח כאפשרי. בנוסף, מפורטים צעד אחר צעד פרוטוקולים, הערות והצעות כיצד לשפר את זרימת העבודה של הבדיקות ולנתח נתונים. התאמת זרימת עבודה זו בעבודות עתידיות תבטיח שניתן יהיה לזהות ברגישות את המספר המרבי של יעדים במדגם קטן, שיפור משמעותי בעלות ובתפוקת הדגימה.
תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טכניקה מוכרת היטב, עברה מספר טרנספורמציות מאז הופעתה והפכה לטכניקה רבת עוצמה המסוגלת לספק תשובות למחקר חומצות גרעין. טרנספורמציות אלה היו שיפור מתמיד של הטכניקה הישנה. ניתן לסכם תמורות אלה לשלושה דורות1. הדור הראשון הוא PCR קונבנציונלי המסתמך על אלקטרופורזה בג'ל כדי לכמת ולזהות מטרות מוגברות. הדור השני הוא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) שיכול לזהות דגימות בזמן אמת ולהסתמך על עקומה סטנדרטית כדי לכמת ישירות מטרות בדגימה. הדור השלישי, PCR דיגיטלי (dPCR), יכול לבצע הן זיהוי, והן כימות מוחלט של מטרות חומצות גרעין ללא צורך בעקומה סטנדרטית. dPCR שופר גם עוד יותר מתאי תגובה המופרדים על ידי בארות של קיר לאמולסיות של נפט, מים וכימי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הצהרה אתית
מכון ווהאן לווירולוגיה (WHIOV) הוא בין המעבדות והמכונים שאושרו על ידי ה- CDC הסיני של העיר ווהאן לערוך מחקר על SARS-CoV-2 ולזהות COVID-19 מדגימות קליניות. מחקר על פיתוח טכניקות אבחון חדשות עבור COVID-19 באמצעות דגימות קליניות אושר גם על ידי הוועדה האתית של מכון ווהאן לווירולוגיה (2020FCA001).
1. זרימת עבודה של עיבוד לדוגמה (איור 1A)
הערה: לאורך כל הפרוטוקול, חשוב להשתמש בחדרים נפרדים עם פיפטות ייעודיות לטיפול בדגימות (מיצוי ואחסון), הכנה ואחסון של ריאגנטים/מאסטרמיקס, הכנת תערובת תגובה (דגימה פלוס מאסטרמיקס) ואיתור, כדי למנוע זיהום צולב. הבדיקות שיפותחו יכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
במחקר הוכחת היתכנות, הביצועים האנליטיים של מבחני המולטיפלקס נבדקו על דגימות קליניות ומחקריות19. הביצועים של מבחני המרבב היו עדיפים על אלה של RT-PCR19. מכיוון שמספר נמוך של טיפות עשוי להצביע על בעיה במהלך יצירת טיפות, במאמר זה נקבע סף של 10,000 טיפות לבאר בהתבסס על נתונים אמפיריים.
הפרדה טובה בין טיפות חיוביות ושליליות עם הפרעה מינימלית לגשם יכולה לסייע בניתוח נתונים. לפיכך, בניסוי טוב, אופטימיזציה של בדיקות היא המפתח19. כפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מעט משאבים זמינים כיצד לפתח מבחני RT-ddPCR לזיהוי SARS-CoV-2. למרות שלא נעשה שימוש במאמר זה, ניתן להשתמש בדוגמאות סטנדרטיות עם עותקים ידועים כדי לפתח ולמטב מבחנים. עם זאת, בעבודה זו, דגימות SARS-CoV-2 שגדלו בתאי Vero-E6 הוקפצו על רקע של RNA גנומי אנושי ושימשו כדגימות סטנדרטיות לפיתוח הבדיקות. רצפי פריימר ובדיקה נכונים חיוניים בעת פיתוח מבחנים. מכיוון שרוב העבודה הראשונית על SARS-CoV-2 RT-ddPCR השתמשה בפריימר ובבדיקות של ה-CDC בסין המכוונות לגן ORF1ab ו-N, הם מצאו אותם מתאימים להיכלל בעבודה זו 7,8,.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
מחקר זה מומן על ידי Megaproject of Infectious Disease Control ממשרד הבריאות של סין, מענק מספר 2017ZX10302301-005 ומרכז המחקר המשותף סין-אפריקה, מענק מספר SAJC201605.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מטהר מחלץ חומצות גרעין אוטומטי לחלוטין 32 ערוצים | Genfine Biotech | FHT101-32 | מחלץ אוטומטי לשמן RNA |
| AutoDG לבדיקות | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG מתכלה |
| ddPCR 96 בארות צלחות | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix לבדיקות (ללא dUTP) | BioRad | 1863024 | ביצוע בדיקת ddPCR mastermix |
| DG32 AutoDG מחסניות | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG מתכלה |
| סיר אמבט מים תרמוסטטי אלקטרוני | בייג'ינג צ'אנגפנג מכשיר ומד חברה | XMTD-8000 | השבתת חום של דגימות |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA / RNA ערכת מיצוי Genfine | Biotech | FMY502T5 | מיצוי חרוזים מגנטי של דגימות RNA מושבתות |
| אטמי חום נייר כסף מנוקבים | BioRad | 1814040 | |
| טיפים לפיפטים עבור AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG |
| פחי פסולת מתכלים עם קצה פיפט עבור AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG מתכלה |
| PrimeScript RT Master Mix (מושלם בזמן אמת) | TaKaRa | RR036A | cDNA |
| דור PX1 PCR אוטם צלחות | BioRad | 1814000 | אטום את צלחת הטיפות מ AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 תוכנה | BioRad | 10026368 | רכישת נתונים וניתוח |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | ניתוח נתונים |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG מתכלה |
| QX200 קורא טיפות | BioRad | 1864003 | קריאת טיפות ורכישת נתונים |
| T100 Thermal | Cycler BioRad | 1861096 | הגברת יעד טיפות (PCR) ויצירת cDNA |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה