הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

4.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62300

⸱

5 באפריל 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology and the Rocky Mountain Taste and Smell Center, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

תקציר

חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג'ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.

מבוא

במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון1. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5+ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינםטעם 5. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טע....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו במתקן מוסמך AAALAC בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים ומדיניות שירות בריאות הציבור, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו Anschutz. עכברי Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 המשמשים בפרוטוקול זה הם ממעבדת ג'קסון, מלאי מס ' 008875.

הערה: השלבים הבאים יש להשלים לפני תחילתו כדי להבטיח התקדמות חלקה בזמן של הפרוטוקול: להגדיר אמבט מים ל 37 °C ,, להגדיר צנטריפוגה ל 4 °C (5 °C), להפוך פתרונות אנזימי הזרקה ודיסוציאציה מן 10 מ"ג / מ"ל Dispase, Collagenase, ופתרונות מלאי אלסטאז (ראה טבלה של חומרים), להסיר ג'ל מטריצה מ -20 °C מ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לעכברים יש CVP אחד, הממוקם בחלק האחורי של הלשון, שממנו ניתן לבודד תאי LGR5+ גזע(איור 1A, קופסהשחורה). הזרקת תמיסת אנזימים מתחת ל- CVP ובסביבתהגורמתלנפיחות קלה של האפיתל והעיכול של רקמת החיבור. עיכול מספיק מושגת לאחר דגירה של 33 דקות, המאפשרת הפרדה קלה של אפיתל CVP מהרקמה הבסיסית. כאשר מנסים לקלף את האפיתל CVP, יש לבצע חתכים במרחק מספיק מה- CVP כדי להבטיח שחפירות לא ישבשו או ייפגעו(איור 1C). זה גם מאפשר אח.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות-עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP+ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת אפיתליה תעלת CVP ממוטבת על ידי הזרקת האפיתל הלינגואלי עם דיספאז II טרי ופתרון קולגנאז מסוג I, ואחריו דגירה של 33 דקות. עם זאת, זמן דגירה קצר יותר, עליקוטים ישנים של אנזימים, מגרשים שונים, או באמצע.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים רוצים להודות לד"ר פיטר דמפסי ומוניקה בראון (אוניברסיטת קולורדו Anschutz קמפוס רפואי Organoid ורקמות מודל משאב משותף) על מתן מדיה מותנית WNR ודיונים יקרי ערך. אנו מודים גם לטכנולוגיות התאים של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו ולמשאבים משותפים של Cytometry זרימה, במיוחד דמיטרי בטורין, על מומחיות במיון תאים. עבודה זו מומנה על-ידי: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, ו- NIH/NCI R21 CA236480 ל- LAB, ו- R21DC016131 ו- R21DC016131-02S1 ל- DG, ו- F32 DC015958 ל- EJG.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>נוגדנים
Alexa Fluor 546 חמור נגד עזים IgGבדיקות מולקולריותA11056, RRID: AB_1426281:2000
Alexa Fluor 546 עז אנטי ארנב IgGבדיקות מולקולריותA11010, RRID:AB_25340771:2000
Alexa Fluor 568 עז אנטי חזיר ניסיונות IgGInvitrogenA11075, RRID:AB_25341191:2000
Alexa Fluor 647 חמור אנטי ארנב IgGבדיקות מולקולריותA31573, RRID:AB_25361831:2000
Alexa Fluor 647 Goat Anti Rat IgGבדיקות מולקולריותA21247, RRID:AB_1417781:2000
DAPI (עבור FACS)Thermo Fischer62247
DAPI (לאימונוהיסטוכימיה)InvitrogenD3571, RRID:AB_23074451:10000
עז אנטי-CAR4מו"פ D SystemsAF2414, RRID:AB_20703321:50
חזיר ניסיונות נגד KRT13Acris נוגדניםBP5076, RRID:AB_9796081:250
ארנב נגד GUSTDUCINSanta Cruz Biotechnology Inc.sc-395, RRID:AB_6736781:250
ארנב נגד NTPDASE2CHUQmN2-36LI6, RRID:AB_28004551:300
Rat anti-KRT8DSHBTROMA-IS, RRID:AB_531826 1:100
Equipment
2D rockerBenchmark Scientific Inc.BR2000
3D מסובבמעבדה קו מכשירים4630
טיימר / שעון עצר גדולספרתי פישרS407992
צנטריפוגהEppendorf5415D
CO2 טנקAirgasCD USP50
FormaTM סדרה 3 מים Jackeed CO2 אינקובטורThermo Scientific4110184 L, מלוטש אל חלד דגם
פלדה IncucyteSartorius:S3 Cancer Center Cell Technologies משאב משותף, אוניברסיטת קולורדו Anschutz Medical Campus
MoFlo XDP100Cytomation Incדגם: S13211997  מרכז גייטס זרימה ציטומטריה ליבה, אוניברסיטת קולורדו אנשוץ קמפוס רפואי
שייקר אורביטליניו ברונסוויק סיינטיפיק סיינטיפיקאקסלה E1
מערכת PCR בזמן אמתיישומי ביוסיסטמס4376600
צנטריפוגה מקוררתאפנדורף5417R
ספקטרופוטומטרתרמו סיינטיפיקND-1000
  סטריאומיקרוסקופZeissStemi SV6
Thermal CyclerBio-Rad580BR
VortexFisher Scientific12-812
אמבט מיםדיוק51220073
<חזק>מדיה
A83 01סיגמאSML0788-5MGריכוז מלאי 10 מ"מ, סופי ריכוז 500 ננומטר
מתקדם DMEM/F12גיבקו12634-010
B27 תוסףגיבקו17504044ריכוז מלאי 50X, ריכוז סופי 1X
ג'נטמיציןגיבקו15750-060ריכוז מלאי 1000X, ריכוז סופי 1X
גלוטמקסגיבקו35050061ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X
HEPESGibco15630080ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X
עכברים EGFPeprotech315-09-1MGריכוז מלאי 500 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל
עכבר, נוגיןפפרוטק250-38ריכוז מלאי 50 ומיקרו; גרם/מ"ל, ריכוז סופי 25 ננוגרם/מ"ל
N-אצטיל-L-ציסטאיןסיגמאA9165ריכוז מלאי 0.5 מ', ריכוז סופי 1 מ"מ
ניקוטינמידסיגמאN0636-100 גרםריכוז ציר 1 מ', ריכוז סופי 1 מ"מ
עט/סטרפטוקוסגיבקו15140-122ריכוז מלאי 100X, ריכוז סופי 1X
פרימוציןInvivoGenant-pm-1ריכוז מלאי 500X, ריכוז סופי 1X
SB202190מו"פ D Systems1264ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 0.4 ומיקרו; מדיה
מותנית M WRNהתקבלה ממעבדת דמפסי (משאב שיתוף אורגנואידים ומידול רקמות של AMC). נגזר מ-L-WRN (ATCC® CRL-3276&סחר;) תאים
Y27632 דיהידוכלוריד 10ugAPExBIOA3008-10ריכוז מלאי 10 מ"מ, ריכוז סופי 10 ומיקרו; M
<חזק>אחר
1 מ"ל מזרק TBBDמזרק 309659
2-מרקפטואתנול, מינימום 98%סיגמאM3148-25MLβ-מרקפטואתנול
2.0 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגהUSA Scientific1420-2700
צלחות 48 בארותThermo Scientific150687
5 3/4 אינץ 'פסטר פיפטספישרברנד12-678-8A
אלבומין מסרום בקר (BSA)Sigma Life ScienceA9647-100G
מאגר RLT מאגר ליזהQIAGEN1015750
תמיסת שחזור תאיםקורנינג354253
Cohan-Vannas מספריים אביבכלים מדעיים עדינים15000-02
קולגנאז מ-Clostridium histolyticum, סוג ISigma Life ScienceC0130-1G
Cultrex RGF BME, סוג 2, PathclearR& D Systems3533-005-02Matrigel
Dispase II (פרוטאז ניטרלי, דרגה II)סיגמא-אולדריץ' (רוש)4942078001
מסננים חד פעמייםSysmex04-0042-2316
Dulbecco' s פוספט חומצי מי מלח pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)Gibco10010-023
Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט עם Ca2+ & Mg2+ Sigma Life SciencesD8662-500ML
Dumont #5 מלקחייםFine Science Tools11252-30
EDTA, 0.5M (pH 8.0)PromegaV4231
Elastase LyophilizedWorthington BiochemicalLS002292
Extra Fine Bonn ScissorsFineTools 14084-08
סרום בקר עוברי (FBS)Gibco26140-079
Fluoromount GSouthernBiotech0100-01
HEPES SolutionSigma Life ScienceH3537-100ML
HyClone Tryspin 0.25% + EDTAThermo Scientific25200-056
iScript cDNA ערכת סינתזהBio-Rad1706691
חימר דוגמנות, גרייסרג'נט ארט22-4084
מזרק BDמחט305106
סרום חמור רגילג'קסון ImmunoResearch017-000-121
סרום עיזים רגילJackson ImmunoResearch005-000-121
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127
PowerSYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
RNeasy Micro KitQIAGEN74004
צינורות נעילה בטוחה 1.5 מ"לEppendorf022363204
נתרן כלוריפישר כימיקל7647-14-5
נתרן פוספט דו-בסיסינטול מים פישר כימי7558-79-4
נתרן פוספט חד בסיסינטול מים פישר ביוריאגנטים7558-80-7
SuperFrost Plus מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
מספריים כירורגיות - SharpFine Science Tools14002-14
Triton X-100Sigma Life ScienceT8787-100ML
VWR מיקרו כיסוי זכוכיתVWR4836606722x22 מ"מ
Science

מקורות

  1. Barlow, L. A. Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development. Development. 142, 3620-3629 (2015).
  2. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  3. Finger, T. E., Silver, W. L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

בלבובות טעם של עכברתרבית אורגנואידיםתאי אב של טעםבידוד באמצעות FACSתרבית בג'ל מטריצהדיפרנציאציה של תאי טעםתאי קולטן של טעםפפילה היקפית (Circumvallate Papilla)
דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.