כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי

סיכום

Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.

תקציר

Escherichia coli (E. coli) הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר הגורם לדלקת קרום המוח יילודים. המופע של חיידקים וחדירה חיידקית דרך מחסום הדם - מוח הם צעדים הכרחיים להתפתחות של דלקת קרום המוח E. coli. מינים תגובתיים של חמצן (ROS) מייצגים את המנגנונים הבקטריואידיים העיקריים של נויטרופילים כדי להשמיד את הפתוגנים הפולשים. בפרוטוקול זה, ייצור ROS תאיים תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה לכמת באמצעות בדיקות ROS פלואורסצנטי זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה לחול גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים במהלך אינטראקציות מארח פתוגן.

מבוא

דלקת קרום המוח חיידקית יילודים היא מחלה זיהומית בילדים נפוצה. Escherichia coli (E. coli) עם כמוסה K1 הוא הפתוגן הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח חיידקי יילודים, המהווה כ 80% מכלל השכיחות^1,2,3. למרות ההתקדמות בכימותרפיה מיקרוביאלית וטיפול תומך, דלקת קרום המוח חיידקית היא עדיין אחד התנאים ההרסניים ביותר עם תחלואה גבוהה^{ותמותה 4}.

המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים בדרך כלל מתחיל עם חיידקים הנגרמים על ידי כניסת חיידקים פתוגניים לתוך זרימת הדם ההיקפית מן הנגעים המקומיים של התינוקות, ואחריו חדירה דרך מחסום הדם - מוח (BBB) לתוך המוח, וכתוצאה מכך דלקת של קרום המוח⁴. הופעת החיידק תלויה באינטראקציה בין חיידקים לתאי חיסון מארחים כולל נויטרופילים ומאקרופאגים וכו '. נויטרופילים, המהווים ~ 50-70% מתאי הדם הלבנים, הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים חיידקיים^5,6. במהלך הפלישה של חיידקים, נויטרופילים מופעל מגויסים לאתרים זיהומיות ולשחרר מינים חמצן תגובתי (ROS) כולל אניון סופראוקסיד, מי חמצן, רדיקלים הידרוקסיל, וחמצן^{סינגלט 7}. ROS לעבור תגובות redox עם קרום התא, מולקולות חומצת גרעין וחלבונים של החיידקים, וכתוצאה מכך פציעה ומוות של חיידקים פולשים⁸. המיטוכונדריה היא האתר העיקרי של ייצור ROS בתאים אוקריוטיים, ואוקסידאזים שונים (למשל, ניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) קומפלקס אוקסידאז, מערכת ליפוקסיגנאז, חלבון קינאז C ומערכת ציקלואוקסיגניאז) מתווכים את הייצור של ROS^9,10. המדידה בזמן אמת של הייצור של ROS, המייצג את המנגנון האנטי מיקרוביאלית העיקרית נויטרופילים, היא שיטה שימושית לחקר ההגנה המארחת במהלך האינטראקציה חיידקים מארח.

בפרוטוקול זה, ייצור ROS תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה מכמת עם DHE בדיקה ROS פלואורסצנטי, זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה להיות מיושמת גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים אחרים במהלך האינטראקציה פתוגן מארח.

פרוטוקול

דם היקפי ממתנדבים המיושמים במחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים הראשון של האוניברסיטה הרפואית של סין (#2020-2020-237-2).

1. הכנת ריאגנטים ובינוני תרבות

1. הכן את מאגר התמוגה של תאי הדם האדומים על ידי הוספת 8.29 גרם של NH₄Cl, 1 גרם של KHCO₃, 37.2 מ"ג של Na₂EDTA לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. הסר את החיידקים על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
2. הכן מדיום תרבות ניסיוני לנויטרופילים על ידי הוספת 5% סרום שור עוברי למדיום RPMI 1640 ולאחסן ב 4 °C (69 °F). יש להשוות לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
   הערה: השתמש באמצעי RPMI 1640 ללא פנול אדום.
3. הכן מלוחים חיץ פוספט (PBS) על ידי הוספת 8 גרם של NaCl, 0.2 גרם של KCl, 1.44 גרם של Na₂HPO₄·2H₂O ו 0.2 גרם של KH₂PO₄ לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים בקבוק זכוכית 1 L. כוונן את ה- pH ל- 7.2-7.4. אוטוקלאב זה במשך 15 דקות ב 121 מעלות צלזיוס.
4. הכן פתרון ריפאמפיצין על ידי המסת 0.5 גרם של אבקת ריפאמפיצין ב 10 מ"ל של דימתיל סולפוקסיד (DMSO) להניב פתרון ריפאמפיצין 50 מ"ג / מ"ל.
5. הכן פתרון אגר LB על ידי הוספת 10 גרם של NaCl, 10 גרם של טריפטון, 5 גרם של תמצית שמרים ו 15 גרם של אבקת אגר לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים autoclave את התערובת. מלאו את מנות הפטרי לחצי מהנפח על ידי שפיכת תמיסת אגר LB חמה המכילה ריפאמפיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל. אחסן את הצלחת המוצקה המקוררת ב-4 מעלות צלזיוס.
6. הכן את מרק עירוי לב המוח (BHI) המתאים לזנים חיידקיים על ידי המסת 37 גרם אבקת BHI ל-1 ליטר מים מזוקקים כפולים. כוונן את ה- pH ל- 7.2 ונבלע אותו באופן אוטומטי.
7. להמיס את דיהידרותידיום בדיקה פלואורסצנטי (DHE) בממס DMSO להניב פתרון 10 מ"מ למניה. מערבבים בעדינות לפני השימוש.
   הערה: אליגוט פתרון המניה מיד לתוך בקבוקונים אור הוכחה. חיי המדף של פתרון המניה הם 6 חודשים ב -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת זן חיידקים E44

הערה: E44 הוא זן מוטציה של מנינגיטיקה E. coli עם התנגדות ריפאמפיצין.

1. טובלים את מושבת E44 cryopreserved עם קצה פיפטה סטרילי, לחסן את זן E44 על צלחת אגר LB המכיל 100 ריפאמפיצין מיקרוגרם / מ"ל על ידי ציור קווים. שים את הצלחת במהופך באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס לילה.
2. יום אחד לפני הניסוי, לבחור מושבה אחת E44 מהצלחת עם קצה פיפטה סטרילי ולשים אותו 5 מ"ל של מרק BHI המכיל 100 μg / mL ריפאמפיצין בבקבוק 50 מ"ל. דגירה את תרבות החיידקים ב 37 °C (69 °F) עם 90 סל"ד עבור 17 שעות בשייקר דגירה.

3. בידוד נויטרופילים מדם היקפי אנושי

1. צייר 5 מ"ל של דגימת דם ממתנדבים תוך ורידי לצינור איסוף הדם ואקום המכיל EDTA עבור קרישה.
2. צנטריפוגה דגימות הדם ההיקפי ב 500 x g במשך 5 דקות. דגימות הדם מחולקות לשלוש שכבות על ידי צנטריפוגה, אשר מלמטה למעלה הם שכבת תא הדם האדום (RBC), שכבת תא הדם הלבן (WBC) ואת שכבת הפלזמה, ברצף.
3. לשאוף את שכבת תאי הדם הלבנים עם צינור לצינור חדש עם חיץ תמוגה 3x RBC. מערבבים את התערובת ביסודיות ומניחים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
4. צנטריפוגה הצינור ב 500 x g במשך 5 דקות. לשאוף את העל-טבעי לחלוטין ולהשליך.
   1. חזור על הליך התמוגה עם מאגר תמוגה RBC 1-2 פעמים, עד שהמשקע הופך לבן.
5. לשטוף את התאים על ידי שימוש חוזר המשקעים עם 2 מ"ל של PBS. ואז צנטריפוגה ב 300 x g במשך 5 דקות כדי לאפשר לתאים להתיישב לתחתית הצינור.
6. תווית נויטרופילים עם CD16 microbeads על ידי שימוש חוזר משקעים עם 50 μL של מאגר מיון תאים מגנטיים precooled. לאחר מכן לערבב עם 50 μL של מיקרוביאדות CD16 אנושי ביסודיות. דגירה את התערובת ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
   הערה: יש לקרר מראש פתרונות כדי למנוע מכסה של נוגדנים על פני התא ותיוג לא ספציפי. רוב המבוגרים יש כ 4,000 כדי 10,000 כדוריות דם לבנות לכל microliter של דם, ביניהם, נויטרופילים מהווים כ 50-70%. על פי הערכה, הסעיפים של סך תאי הדם הלבנים ב 5 מ"ל של דם היקפי אנושי הם בדרך כלל עד 2-5 x 10⁷.
7. לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס, 300 x גרם במשך 10 דקות. השלך את supernatant לחלוטין ו resuspend את המשקעים עם 500 μL של מאגר מיון.
8. להרכיב את העמודה המגנטית ולהפריד מדף. הזז את המפריד למדף עם העמודה המגנטית ושטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ מיון.
9. זרוק את המתלה התא לתוך העמודה כדי לאפשר נויטרופילים שכותרתו על ידי חרוזים מגנטיים לצרף את העמודה המגנטית.
10. שטפו את התאים שאינם מסומנים בתווית על-ידי הוספת מאגר מיון תאים מגנטיים 3 מ"ל 3 פעמים, וודאו שמאגר העמודות ריק בכל פעם.
11. הסר את העמודה מהמפריד המגנטי והכנס אותה לצינור של 15 מ"ל. הוסף 5 מ"ל של מאגר מיון תאים מגנטיים לעמודה. לדחוף את התאים המסומנים מגנטי באמצעות בוכנה.
    הערה: כדי לשפר את טוהר הנויטרופילים, ניתן לחזור על שלבי המיון באמצעות עמודה חדשה.
12. צנטריפוגה הצינור ב 300 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant לחלוטין resuspend את המשקעים עם 1 מ"ל של מדיום תרבות. קבע את מספר התא עם מונה תאים והכן את התאים לניסויים נוספים.

4. מדידה של ROS

1. צנטריפוגה נויטרופילים מבודדים ב 300 x g במשך 5 דקות, resuspend את המשקעים, ולהתאים את ריכוז התא ל 2 x 10⁶/mL עם מדיום תרבות המכיל 5 μM DHE בדיקת פלואורסצנטיות.
2. דגירה נויטרופילים ב 37 °C (60 °F) במשך 30 דקות כדי לטעון את החללית DHE, ולאחר מכן להקצות את השעיית התא 96-היטב פוליסטירן שחור microplate עם 200 μL לכל באר.
3. הפעל את קורא המיקרו-פלטה ופתח את תוכנת האיתור. בחרו תבנית צלחת אטומה של 96 בארות וקבעו את אזור הקריאה.
   1. הגדר את הפלואורסצנטיות (Ex/Em = 518/605 ננומטר) במצב קינטי כל 5 דקות במשך 60 דקות ב 37 °C (60 °F). הקפידו לנער את הצלחת במשך 3 שניות לפני כל קריאה.
4. מוציאים את המיקרופלטה מהאינקובטור, מוסיפים את ה-E44 (MOI=100) התרבותי או את הפורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA) (100 ng/mL) לכל באר המכילה נויטרופילים טעונים מראש עם 3 שכפולים. השתמש ב- PMA כפקד חיובי.
5. מניחים את הצלחת בקורא המיקרופלאט ומתחילים את ההסתעפות מיד.

תוצאות

באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, נויטרופילים היו מבודדים מדם היקפי אנושי טעון עם בדיקה פלואורסצנטית DHE כדי לזהות את השינויים של רמות ROS בתגובה לזיהום E44. כאן, אנו מספקים נתונים מייצגים המדגימים את ייצור ROS עורר על ידי זן E44 נקבע על ידי קורא microplate בזמן אמת. על ידי הוספת זני E44 ב- MOI של 100, רמות ה- ROS עלו באופן מיידי והראו מגמת עלייה מתמשכת באופן תלוי זמן (איור 1). על ידי הוספת PMA, גורם ROS ידוע של ROS תאיים נויטרופילים, ראינו עקומה בצורת S המציגה עקומה שטוחה בשלב הראשוני ואחר...

דיון

נויטרופילים פועלים כמרכיב הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים במחזור הדם האנושי. הם תאים משפיעים חשובים במערכת החיסון האנושית המולדת, אשר בונה את קו ההגנה הראשון נגד הפלישה של פתוגנים¹¹. הדור של ROS מייצג את אחד המנגנונים bactericidal העיקריים של נויטרופילים בעקבות phagocytosis¹¹. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מבנה דמוי רשת שפורסם על ידי נויטרופילים הנקראים מלכודת חוץ תאית נויטרופילים (NET) מעורב גם בתהליך הרג החיידקים^6,11

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן	KIRGEN	KG2611
צלחת 96 בארות	קורנינג	3025
Agar	DINGGUO	DH010-1.1
מונה תאים מאושר	Bio-rad	508BR03397
בטיחות ביולוגית קרבינט	שנחאי Lishen	Hfsafe-1200Lcb2
עירוי לב מוח	BD	237500
CD16 מיקרו-חרוזים, אנושי	Miltenyi Biotec	130-045-701
צנטריפוגה	Changsha Xiangyi	TDZ5-WS
עמודות	Miltenyi Biotec	130-042-401
דיהידרואתידיום (DHE)	MedChemExpress	104821-25-2
סרום בקר עוברי	Cellmax	SA211.02
חממה	Heraeus	Hera Cell
MACS מאגר הפרדה	Miltenyi Biotec	130-091-221
קורא מיקרו-פלטות	התקנים מולקולריים	SpectraMax M5
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Beyoitme	S1819-1mg
יחידת הפרדה QuadroMACS	Miltenyi Biotec	130-090-976
Rifampicin	Solarbio	13292-46-1
RPMI1640	בינוני סנגון ביוטק	E600027-0500
שייקר תרמוסטטי	שנחאי Zhicheng	ZWY-100D
טריפטון	OXOID	LP0042
תמצית שמרים	OXOID	LP0021