Escherichia coli הוא הגורם המוביל לדלקת קרום המוח חיידקית גראם שלילית יילודים. במהלך הזיהום החיידקי, מיני חמצן תגובתי המיוצר על ידי נויטרופילים לשחק תפקיד bactericidal גדול. כאן אנו מציגים שיטה לגילוי מינים חמצן תגובתי נויטרופילים בתגובה דלקת קרום המוח E. coli.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כימות בזמן אמת של מינים חמצן תגובתי נויטרופילים נגועים מנינגיטי Escherichia קולי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Escherichia coli (E. coli) הוא החיידק הגרם שלילי הנפוץ ביותר הגורם לדלקת קרום המוח יילודים. המופע של חיידקים וחדירה חיידקית דרך מחסום הדם - מוח הם צעדים הכרחיים להתפתחות של דלקת קרום המוח E. coli. מינים תגובתיים של חמצן (ROS) מייצגים את המנגנונים הבקטריואידיים העיקריים של נויטרופילים כדי להשמיד את הפתוגנים הפולשים. בפרוטוקול זה, ייצור ROS תאיים תלוי זמן נויטרופילים נגועים מנינגיטי E. coli היה לכמת באמצעות בדיקות ROS פלואורסצנטי זוהה על ידי קורא מיקרופלטה פלואורסצנטי בזמן אמת. שיטה זו עשויה לחול גם על הערכת ייצור ROS בתאי יונקים במהלך אינטראקציות מארח פתוגן.
מבוא
דלקת קרום המוח חיידקית יילודים היא מחלה זיהומית בילדים נפוצה. Escherichia coli (E. coli) עם כמוסה K1 הוא הפתוגן הגרם שלילי הנפוץ ביותר גורם דלקת קרום המוח חיידקי יילודים, המהווה כ 80% מכלל השכיחות1,2,3. למרות ההתקדמות בכימותרפיה מיקרוביאלית וטיפול תומך, דלקת קרום המוח חיידקית היא עדיין אחד התנאים ההרסניים ביותר עם תחלואה גבוההותמותה 4.
המופע של דלקת קרום המוח חיידקי יילודים בדרך כלל מתחיל עם חיידקים הנגרמים על ידי כניסת חיידקים פתוגניים לתוך זרימת הדם ההיקפית מן הנגעים המקומיים של התינוקות, ואחריו חדירה דרך....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דם היקפי ממתנדבים המיושמים במחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית החולים הראשון של האוניברסיטה הרפואית של סין (#2020-2020-237-2).
1. הכנת ריאגנטים ובינוני תרבות
- הכן את מאגר התמוגה של תאי הדם האדומים על ידי הוספת 8.29 גרם של NH4Cl, 1 גרם של KHCO3, 37.2 מ"ג של Na2EDTA לתוך 1 L של מים מזוקקים כפולים ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. הסר את החיידקים על ידי סינון באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
- הכן מדיום תרבות ניסיוני לנויטרופילים על ידי הוספת 5% סרום שור עוברי למדיום RPMI 1640 ולאחסן ב 4 °C (69 °F). יש להשוות לטמפרטורת החדר לפני השימוש.
הערה: השתמש באמצעי RPMI 1640 ללא פנול אדום.
<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות הפרוטוקול המתואר במאמר זה, נויטרופילים היו מבודדים מדם היקפי אנושי טעון עם בדיקה פלואורסצנטית DHE כדי לזהות את השינויים של רמות ROS בתגובה לזיהום E44. כאן, אנו מספקים נתונים מייצגים המדגימים את ייצור ROS עורר על ידי זן E44 נקבע על ידי קורא microplate בזמן אמת. על ידי הוספת זני E44 ב- MOI של 100, רמות ה- ROS עלו באופן מיידי והראו מגמת עלייה מתמשכת באופן תלוי זמן (איור 1). על ידי הוספת PMA, גורם ROS ידוע של ROS תאיים נויטרופילים, ראינו עקומה בצורת S המציגה עקומה שטוחה בשלב הראשוני ואחר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
נויטרופילים פועלים כמרכיב הנפוץ ביותר של תאי דם לבנים במחזור הדם האנושי. הם תאים משפיעים חשובים במערכת החיסון האנושית המולדת, אשר בונה את קו ההגנה הראשון נגד הפלישה של פתוגנים11. הדור של ROS מייצג את אחד המנגנונים bactericidal העיקריים של נויטרופילים בעקבות phagocytosis11. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי מבנה דמוי רשת שפורסם על ידי נויטרופילים הנקראים מלכודת חוץ תאית נויטרופילים (NET) מעורב גם בתהליך הרג החיידקים6,11
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים פיננסיים מתחרים או ניגודי עניינים אחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31670845, 31870832, 32000811) ותכניתו של פרופסור מצטיין במחוז ליאונינג (LJH2018-35).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים מפוליפרופילן | KIRGEN | KG2611 | |
| צלחת 96 בארות | קורנינג | 3025 | |
| Agar | DINGGUO | DH010-1.1 | |
| מונה תאים מאושר | Bio-rad | 508BR03397 | |
| בטיחות ביולוגית קרבינט | שנחאי Lishen | Hfsafe-1200Lcb2 | |
| עירוי לב מוח | BD | 237500 | |
| CD16 מיקרו-חרוזים, אנושי | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| צנטריפוגה | Changsha Xiangyi | TDZ5-WS | |
| עמודות | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| דיהידרואתידיום (DHE) | MedChemExpress | 104821-25-2 | |
| סרום בקר עוברי | Cellmax | SA211.02 | |
| חממה | Heraeus | Hera Cell | |
| MACS מאגר הפרדה | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| קורא מיקרו-פלטות | התקנים מולקולריים | SpectraMax M5 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Beyoitme | S1819-1mg | |
| יחידת הפרדה QuadroMACS | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Rifampicin | Solarbio | 13292-46-1 | |
| RPMI1640 | בינוני סנגון ביוטק | E600027-0500 | |
| שייקר תרמוסטטי | שנחאי Zhicheng | ZWY-100D | |
| טריפטון | OXOID | LP0042 | |
| תמצית שמרים | OXOID | LP0021 |
מקורות
- Kim, K. S. Acute bacterial meningitis in infants and children. Lancet Infectious Diseases. 10 (1), 11(2010).
- Woll, C., et al. Epidemiology and Etiology of Invasive Bacterial Infection in Infants
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
