הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת שיעורי השומנים והשומנים הכוללים בדגימות ימיות

4.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62315

⸱

11 בדצמבר 2021

 , 
1Department of Ocean Sciences and CREAIT Network, Memorial University of Newfoundland

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה הוא לקביעת שומנים במי ים ודגימות ביולוגיות. שומנים בסינון מופקים עם כלורופורם או תערובות של כלורופורם ומתנול במקרה של מוצקים. מחלקות השומנים נמדדות על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה עם זיהוי יינון להבה והסכום שלהם נותן את תכולת השומנים הכוללת.

תקציר

שומנים מורכבים במידה רבה מפחמן ומימן, ולכן מספקים אנרגיה ספציפית גדולה יותר מאשר מקרומולקולות אורגניות אחרות בים. בהיותם עשירים בפחמן ומימן הם גם הידרופוביים ויכולים לשמש כנשא ממסים וספיגה למזהמים אורגניים ולכן יכולים להיות מניעים של ביו-קומקולציה מזהמת במערכות אקולוגיות ימיות. טבעם ההידרופובי מאפשר את בידודם ממי ים או מדגימות ביולוגיות: ניתוח שומנים ימיים מתחיל בדגימה ולאחר מכן מיצוי בממסים אורגניים שאינם קוטביים, ומספק שיטה נוחה להפרדה שלהם מחומרים אחרים במטריצה מימית.

אם נדגמו מי ים, הצעד הראשון כרוך בדרך כלל בהפרדה לפלגים 'מומסים' ו'חלקיקיים' המוגדרים מבצעית על ידי סינון. דגימות נאספות ושומנים מבודדים מטריצת המדגם בדרך כלל עם כלורופורם עבור חומר מומס באמת קולואידים, ועם תערובות של כלורופורם ומתנול עבור מוצקים ודגימות ביולוגיות. תמציות כאלה עשוי להכיל מספר סוגים ממקורות ביוגניים ואנתרופוגניים. בשלב זה, שומנים מוחלטים ושיעורי שומנים עשויים להיקבע. ניתן למדוד את השומנים הכוללים על ידי סיכום מחלקות שומנים בנפרד שנקבעו באופן אינדיבידואלי אשר בדרך כלל הופרדו כרומטוגרפית. כרומטוגרפיה בשכבות דקות (TLC) עם זיהוי יינון להבה (FID) משמשת באופן קבוע לניתוח כמותי של שומנים מדגימות ימיות. TLC-FID מספק מידע מחלקת שומנים סינופטיים, ועל ידי סיכום שיעורים, מדידת שומנים מוחלטת.

מידע מחלקת שומנים הוא שימושי במיוחד בשילוב עם מדידות של רכיבים בודדים למשל, חומצות שומן ו/או סטרולים, לאחר שחרורם מתמציות שומנים. המגוון הרחב של מבנים ותפקודים שומנים פירושו שהם משמשים באופן נרחב במחקר אקולוגי וביוגוכימי הערכת בריאות המערכת האקולוגית ואת מידת ההשפעה על ידי השפעות אנתרופוגניות. הם הועסקו כדי למדוד חומרים בעלי ערך תזונתי לחי ימי (למשל, אקווה-פיד ו/או טרף), וכאינדיקטור לאיכות המים (למשל פחמימנים).

מבוא

השיטות המתוארות כאן נוגעות לחומרים המוגדרים מבצעית כשלומנים ימיים. הגדרה זו מבוססת על נוחותם להפקת נוזל נוזלי בממסים אורגניים שאינם קוטביים, והיא מספקת שיטה נוחה להפרדה שלהם מחומרים אחרים במטריצה מימית. טבעם ההידרופובי מאפשר את בידודם ממי ים או מדגימות ביולוגיות, כמו גם את העשרתם, ואת הסרת המלחים והחלבונים.

מדידת תכולת השומנים והרכבה באורגניזמים ימיים מעניינים מאוד באקולוגיה של רשתות מזון, תזונה בחקלאות ימית ובמדעי המזון במשך עשרות שנים. שומנים הם מרכיבים אוניברסליים באורגניזמים חיים, הפועלים כמולקולות חיוניות בקרומי התא, כמקורות עיקריים לאנרגיה ביולוגית, המספקים בידוד תרמי וציפה, ומשמשים כמולקולות איתות. למרות נהלים לקביעת שומנים בדם בתחומים אחרים תוארו היטב, השימוש שלהם עם דגימות ימיות בדרך כלל מחייב שינוי כדי להתאים לתנאי שדה, כמו גם מדגם סוג1.

עבור דגימות מי ים, הצעד הראשון דורש בדרך כלל הפרדה לתוך השברים המוגדרים מבצעית "מומסים" ו"חלקיקים ", בדרך כלל על ידי סינון (פרוטוקול שלב 1). שבר החלקיקים הוא מה שנשמר על ידי המסנן, וגודל הנקבוביות חשוב בהגדרת החתך2. לעתים קרובות כאשר אנו טועמים חומר חלקיקי, ברצוננו לקשר ריכוזי שומנים לריכוזים המוניים כוללים, ובמקרה זה יש לקחת דגימה נפרדת, קטנה יותר (למשל, 10 מ"ל) למטרה זו (פרוטוקול שלב 1, הערה). כדי לקבל קביעת מסה מדויקת חשוב להוסיף אמוניום formate (35 גרם / ליטר) בסוף הסינון.

מי הים המסונקים מהדגימה הגדולה יותר אמורים להסתכם בין 250 מ"ל ל-1 ליטר בהתאם לסוג המדגם, והוא נתון להפקת נוזלים-נוזליים במשפך נפרד (פרוטוקול שלב 2). הטבע ההידרופובי של שומנים אומר שהם יכולים להיות מופרדים מתרכובות אחרות על ידי מיצוי בממס לא קוטבי כגון כלורופורם. מערכת דו-שכבתית נוצרת כאשר שומנים מתחלקים לשכבה האורגנית בעוד רכיבים מסיסים במים נשארים בשכבה מימית.

דגימות חלקיקים על מסנן, או דגימות ביולוגיות מופקות עם Folch שונה ואח 'מיצוי3, גם מעורבים כלורופורם (פרוטוקול שלב 3). שוב, נוצרת מערכת אורגנית/מימית שבה שומנים מתחלקים לשלב האורגני, בעוד מולקולות מסיסות במים נשארות בשלב מימי, וחלבונים הם מזודרזים. למעשה, עבור מוצקים, רוב המעבדות להשתמש וריאציה כלשהי של Folch ואח 'החילוץ3 הליך מעורבים כלורופורם ומתנול. עבור מסננים, הצעד הראשון הוא הומוגניזציה ב 2 מ"ל של כלורופורם ו 1 מ"ל של מתנול.

במהלך החילוץ, יש לנקוט זהירות כדי להגן על שומנים מפני שינוי כימי או אנזימטי, על ידי שמירה על דגימות וממסים על קרח כדי להפחית הידרוליזה קשר אסתר או חמצון קשר כפול פחמן-פחמן. רקמות ושומנים תאים מוגנים היטב על ידי נוגדי חמצון טבעיים ועל ידי מידור4; עם זאת, בעקבות הומוגניזציה של דגימות, תוכן התא משולבים עיבוד שומנים נוטים יותר לשינוי, כימית או אנזימטית. שומנים מסוימים, כגון רוב סטרולים, יציבים מאוד, בעוד שאחרים, כגון אלה המכילים חומצות שומן רב בלתי רוויות, רגישים יותר חמצון כימי. אחרים, כגון סטרולים עם קשרים כפולים מצומדים, נוטים חמצון מזורז על ידי אור5. לאחר עקירות, שומנים רגישים הרבה יותר חמצון כימי, ודגימות צריך להיות מאוחסן תחת גז אינרטי כגון חנקן. זרם עדין של חנקן ישמש גם לרכז תמציות.

לאחר הריכוז, שומנים היו מכמתים בדרך כלל בתפזורת מכיוון שהם מרכיב חשוב במערכות אקולוגיות ימיות המספקות ריכוז גבוה של אנרגיה, יותר מכפליים kJ / g של פחמימות וחלבונים. תמיד הם יהיו כיתבו הבאים כמרכיבים בודדים: ניתוח מקיף של שומנים בדרך כלל כרוך הפרדה לקטגוריות פשוטות יותר, על פי הטבע הכימי שלהם. לכן, ניתוח מלא כרוך במדידת שומנים הכוללים, שיעורי שומנים בדם ותרכובות בודדות.

השומנים הכולל יכול להיקבע על ידי לקיחת הסכום של שיעורי שומנים שנמדדו בנפרד מופרדים על ידי כרומטוגרפיה6. תמצית שומנים ימיים עשויה להכיל יותר מתריסר שיעורים ממקורות ביוגניים ואנתרופוגניים. מגוון רחב של מבני השומנים אומר מידע רב ניתן להשיג על ידי קביעת קבוצות בודדות של מבנים. שיעורי שומנים בנפרד, או בקבוצות מסוימות, שימשו כדי לאותת על נוכחות של סוגים מסוימים של אורגניזמים, כמו גם את מצבם הפיזיולוגי ופעילותם2. הם שימשו גם כאינדיקטור למקורות של חומר אורגני, כולל חומר אורגני מומס (DOM) כמו גם מזהמים הידרופוביים.

טריאציליגליצרולים, פוספוליפידים וסטרולים הם בין שיעורי השומנים הביוגניים החשובים יותר. השניים הראשונים קשורים מבחינה ביוכימית מכיוון שיש להם עמוד שדרה של גליצול שאליו משתיים או שלוש חומצותשומן (איור 1). Triacylglycerols, יחד עם אסטרים שעווה הם חומרי אחסון חשובים מאוד, בעוד שיעורים שומנים המכילים חומצות שומן אחרים כגון diacylglycerols, חומצות שומן חינם, monoacylglycerols הם בדרך כלל מרכיבים משניים. חומצות שומן חופשיות נמצאות בריכוזים נמוכים יותר באורגניזמים חיים, שכן אלה הבלתי רוויים יכולים להיות רעילים7. סטרולים (הן בצורות החופשיות והן באלכוהול שומני) ואלכוהול שומני כלולים גם בין שומנים פחות קוטביים, בעוד גליקולפידים ופוספוליפידים הם שומנים קוטביים. שומנים קוטביים יש קבוצה הידרופילית, המאפשר היווצרות של bilayers שומנים נמצאו בקרומי התא. סטרולים חינם הם גם רכיבים מבניים ממברנה, וכאשר נלקח ביחס triacylglycerols הם מספקים מצב או אינדקס תזונתי (TAG: ST) אשר היה בשימוש נרחב8. כאשר נלקח ביחס פוספוליפידים (ST : PL) הם יכולים לשמש כדי להצביע על רגישות הצמח למלח: ערכים גבוהים יותר לשמור על שלמות מבנית ולהפחית חדירות הממברנה9. ההופכי של יחס זה (PL : ST) נחקר ברקמות דו-שנתיות במהלך התאמתטמפרטורה 10.

מחלקות שומנים ימיות ניתנות להפרדה על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה (TLC) על מוטות מצופים ג'ל סיליקה (פרוטוקול שלב 4) ולאחר מכן זוהו וכימתו על ידי זיהוי יינון להבה (FID) בסורק FID אוטומטי. TLC / FID הפך בשימוש שגרתי עבור דגימות ימיות כפי שהוא מספק במהירות נתונים מחלקת שומנים סינופטיים מדגימות קטנות, ועל ידי לקיחת הסכום של כל הכיתות, ערך עבור שומנים כוללים. TLC/FID עבר הערכת אבטחת איכות (QA) ונמצא כי הוא עומד בתקנים הנדרשים לכיול חיצוני עקבי, ריקים נמוכים וניתוח שכפול מדויק11. מקדמי וריאציה (CV) או סטיות תקן יחסיות הם סביב 10%, וסורק FID סך נתוני השומנים הם בדרך כלל סביב 90% מאלה המתקבלים על ידי gravimetric ושיטות אחרות2. Gravimetry נותן שומנים כוללים גבוהים יותר סביר כי סורק FID מודד רק תרכובות לא נדיפות, וגם כתוצאה של הכללה אפשרית של חומר שאינו שומנים במדידות כבידתיות.

המידע המסופק על ידי ניתוח כיתת השומנים שימושי במיוחד בשילוב עם קביעות של חומצות שומן כיחידים, או סטרולים, או השניים בשילוב. הצעד הראשון לקראת ניתוחים אלה כרוך שחרור של כל חומצות שומן רכיב יחד עם סטרולים בתמציות השומנים (פרוטוקול שלב 5). המגוון הרחב של מבנים שומנים ותפקודים אומר שהם ראו שימוש נרחב במחקרים אקולוגיים וביוגיאוכימיים הערכת בריאות המערכת האקולוגית ואת המידה שבה הם הושפעו על ידי תשומות אנתרופוגניות ויבשתיות. הם שימשו למדידת biosynthesis של חומרים בעלי ערך תזונתי לחיות ימיות, כמו גם כדי לציין את איכות דגימות מים. מדידת שומנים בדגימות ליבת משקעים מסייעת להראות את הרגישות של משקעים לשינויים בשימוש בקרקע האנושית ליד השוליים היבשתיים-ימיים.

הכלי העיקרי לזיהוי וכימות תרכובות שומנים בודדות היה באופן מסורתי כרומטוגרפיה גז (GC) עם FID. לפני הניתוח עם זאת, תרכובות אלה נעשים תנודתיים יותר על ידי derivatization. חומצות שומן משתחררות בנוכחות זרז חומצי (H2SO4)משיעורי סיל שומנים בדם(איור 1). בכימיה אורגנית, קבוצת האציל (R-C=O) מופקת בדרך כלל מחומצה קרבוקסילית (R-COOH). לאחר מכן הם מחדש אסטרים מתיל חומצת שומן (FAME) אשר נותן הפרדות טובות יותר על עמודות GC (פרוטוקול שלב 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כדי לנקות כלי זכוכית, מכשירים ומסננים עבור ניתוחי שומנים בדם, לשטוף אותם 3 פעמים עם מתנול ואחריו 3 שטיפות עם כלורופורם, או לחמם אותם ל 450 מעלות צלזיוס לפחות 8 שעות.

1. הליך סינון למי ים מומסים ושומנים חלקיקיים

הערה: שבר העניין המסוים מוגדר תפעולית על-ידי הליך הסינון. במקרה זה גודל הנקבבובית הוא 1.2 מיקרומטר.

  1. הגדר את סעפת הסינון ללא מסנן ושטוף את ההתקנה במי ים מסוננים.
  2. באמצעות מלקחיים נקיים מניחים מסנן סיבי זכוכית 47 מ"מ (GF/C), שנשטף, לתוך מערכת הסינון הנקי.
  3. קח את המדגם והסתובב בעדינות כדי להקיף מחדש כל חומר שאולי התיישב בתחתית מיכל האיסוף. מדוד במדויק אמצעי אחסון ידוע, במקרה זה 1 L, וסנן אותו דרך המסנן.
    הערה: הנפח יהיה תלוי בכמות החומר החלקיקים במדגם: בדרך כלל בין 250 מ"ל ל -5 ליטר בהתאם לעונה ולמיקום.
  4. כאשר המדגם נמדד, הרטיב בעדינות את המסנן במי ים מסוננים. מוסיפים את כל הדגימה לאט למערכת הסינון ושוטפים את הגליל המדורג במי ים מסוננים כדי להבטיח שכל החלקיקים יוסיפו למסנן. יש לשטוף את ההתקנה במי ים מסוננים בצדדים כדי להבטיח שכל החלקיקים ישטפו כלפי מטה אל המסנן.
    1. אפשר לכל מי הים לעבור דרך המסנן אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין מכיוון שהוא יכול לשבש את התאים על המסנן; לשבור שאיבה כמו האחרון של המים נעלם.
  5. באמצעות מלקחיים נקיים ופיפטה נקייה, מקפלים את המסנן לשניים, ואז בשלישים ואז בחצי אורך כדי לגלגל את המסנן לצינור. מניחים אותו לתוך בקבוקון זכוכית נקי, מתויג 10 מ"ל.
  6. לכסות את המסנן עם 2 מ"ל של כלורופורם. מלא את שטח הראש עם חנקן ולאטום עם סרט PTFE. מניחים בארון ארון תקשורת במקפיא של 20 מעלות צלזיוס. הדגימות יהיו יציבות בטמפרטורה זו עד שנה.
    הערה: כדי לקשר את ריכוזי השומנים לריכוז המסה הכולל, יש צורך גם במדידת משקל יבש. זה כרוך לשים מסנן 24 מ"מ שקל מראש לתוך הגדרת סינון משקל יבש, ערבוב המדגם ולקחת תת דגימה קטנה אשר מסונן על המסנן הקטן. כאשר המסנן הוא כמעט יבש, כ 10 מ"ל של 3.5% אמוניום formate מתווסף למסנן. המסנן מקופל לשניים, מוחזר לצלחת פטרי עם תווית ומונח במקפיא.

2. מיצוי נוזלי נוזלי של מי ים או דגימות נוזליות

  1. הכנת המדגם
    1. מדוד נפח ידוע של סינון לתוך גליל זכוכית נקייה שומנים. מניחים את הדגימה במשפך נפרד 1 L נקי. לאחר מכן להוסיף 20 מ"ל של כלורופורם לדגימה לנער במשך 2 דקות, אוורור לעתים קרובות.
  2. הסרת תמצית ראשונה ותוספת חומצה לאחר ההפרדה הראשונה
    1. עוטפים משפך בנייר אלומיניום וממתינים 5 עד 10 דקות עד שההפרדה תתרחש. מקלפים את תחתית נייר הכסף כדי לראות את שתי השכבות. אסוף את השכבה התחתונה, האורגנית דרך stopcock לתוך בקבוקון עגול נקי, נזהר לא לכלול אף אחד מהשכבה העליונה. מכסים את הבקבוקון העגול מתחת לחנקן ומניחים במקפיא.
    2. הוסיפו 0.25 מ"ל של H2SO4 מרוכז לכל ליטר דגימה, לדגימה במשפך המפריד ולנער את המשפך בעדינות.
    3. הוסיפו 10 מ"ל של כלורופורם וניעו במרץ למשך 2 דקות תוך כדי אוורור לעתים קרובות. אפשר להפרדה להתרחש.
  3. הפרדות שניות ושלישיות
    1. המתינו להפרדה והוסיפו את השכבה התחתונה לבקבוקון התחתון העגול.
    2. מוסיפים שליש 10 מ"ל של כלורופורם, ומנערים במשך 2 דקות, שוב פורקים לעתים קרובות. לאחר ההפרדה, מוסיפים את השכבה התחתונה לבקבוקון התחתון העגול.
    3. מעבירים את התמצית בבקבוקון התחתון העגול לאייד סיבובי, מתאדים ומעבירים לבקבוקון 2 מ"ל.

3. פרוטוקול מיצוי למוצקים (שונה Folch ואח '3 מיצוי)

  1. ההתקנה
    הערה: הגדרת החילוץ דורשת מיכל מבודד מלא בקרח. ממסים כוללים מתנול, כלורופורם מופק מים 2:1 כלורופורם:מתנול. כל הממיסים צריכים להיות ממוקמים על קרח, כך שהם קרים עד החילוצים מתחילים. הדגימות גם ללכת על קרח, כך שהכל נשאר קר.
    1. לשטוף את כל הצינורות ואת כובעים מרופדים PTFE 3 פעמים עם מתנול ולאחר מכן 3 פעמים עם כלורופורם. צינור צנטריפוגה אחד ונקיל אחד 15 מ"ל עם כובע נדרש עבור כל מיצוי.
    2. מניחים את המדגם בצינור צנטריפוגה המכיל 2 מ"ל של כלורופורם. גודל המדגם תלוי בכמות השומנים הנוכחית, כ 5 עד 10 מ ג של שומנים מועדפים.
  2. שחיקה ומיצוי
    1. מוסיפים כ 1 מ"ל של מתנול קר כקרח וטוחנים את המדגם לעיסה במהירות עם הומוגניזר נקי או מוט PTFE / מתכת.
    2. לשטוף את המוט בחזרה לתוך הצינור עם כ 1 מ"ל של כלורופורם קר כקרח 2:1: מתנול ולאחר מכן עם 1/2 מ"ל של מים כלורופורם קר כקרח מופק. במידת הצורך, השתמש קבוצה נקייה של מלקחיים כדי לכפות חלקיקים בחזרה לתוך הנקונים לפני הכביסה. כובע הצינור sonicate התערובת במשך 4 דקות באמבט קולי (35 - 42 kHz).
  3. צנרת כפולה:צנטריפוגה הדגימה במשך 2 דקות ב 1800 × גרם. לאסוף את השכבה האורגנית כולה (השכבה התחתונה) באמצעות טכניקת pipetting כפול שבו 5 3/4 "pipette עם הנורה על רופף נדחף בעדינות דרך שתי השכבות, תוך לחיצה על הנורה, גרימת בועות לצאת.
    1. כאשר מגיעה לתחתית השכבה השנייה, השתמש באגודל כדי להסיר את הנורה מבלי למשוך את השכבה האורגנית לתוך הפיפטה. מניחים פיפטה של 9 אינץ' בתוך הפיפטה 5 3/4 אינץ' ומסירים את השכבה התחתונה דרך הפיפטה 5 3/4 אינץ'.
    2. מניחים את התמצית בוויאל נקי. המשיכו להסיר את השכבה התחתונה עד להסרתה.
  4. שטיפת פיפטות: שטפו את הפיפטה בגודל "9 לתוך ה-800 המכילה את השכבה האורגנית תוך שימוש ב-1.5 מ"ל של כלורופורם קר כקרח כדי לשטוף את החלק החיצוני של הפיפטה ו-1.5 מ"ל כדי לשטוף את החלק הפנימי. הפוך בעדינות את הפיפטה בזמן הכביסה וודא שכל הכלורופורם יורד במורד הפיפטה לחקירה.
    1. לשטוף את 5 3/4 "pipette לתוך הצינור המכיל את השכבה מימית באותו אופן.
  5. סוניקאט וצנטריפוגות הדגימות ופיפטה כפולה כאשר מופרדים, באמצעות פיפטות חדשות בכל פעם. יש לחזור על הפעולה לפחות שלוש פעמים ולשחזר את כל השכבות האורגניות. לאחר הסרת השכבה האורגנית בפעם השלישית, לשטוף את שני pipettes לתוך הוויאל המכיל את השכבה האורגנית.
  6. בעזרת זרם עדין של חנקן, יש להתרכז עד עוצמת הקול, ואז לאטום בנייר דבק PTFE ולאחסן במקפיא.

4. פיתוח מערכות וצעדים להפרדת מוט TLC של שיעורי שומנים ימיים

  1. הכנת המוטות ל- TLC
    1. סריקה ריקה של המוטות בסורק FID אוטומטי שלוש פעמים
    2. איתור מדגם: החל דגימות וסטנדרטים עם מזרק על המוטות או ממש מתחת למקור. מחלקים 0.5 μL ונוגעים בטיפה למוט. אפשר להתייבש לפני הנחת הטיפה הבאה על אותה נקודה. לזהות את כל הדגימות בשורה על מוטות.
    3. התמקדות אצטון: פוקוס דגימות פעמיים (שלוש פעמים אם דגימות מרוכזות מאוד) ב 70 מ"ל של אצטון. צפה בחזית הממס כפי שהוא מטפס על המוט עד תחתית הנקודה מתמזגת עם החלק העליון. הסר את המוטות, לייבש אותם סביב 5 s, ולאחר מכן לחזור על ההליך כדי לייצר רצועה צרה של חומר שומנים ליד החלק התחתון של המוט.
    4. יבש ומרכך את המוטות בתא לחות קבוע במשך 5 דקות. תא לחות קבוע הוא חיטוי עם תמיסה רוויה של סידן כלורי מתחת לצלחת.
  2. רצף המוביל לכרומטוגרמה הראשונה (פחמימן לקטון)
    1. מערכת פיתוח ראשונה: מערכת הפיתוח הראשונה היא hexane:diethyl אתר:חומצה פורמית, 98.95:1:0.05. השתמש מזרק כדי להוסיף את החומצה פורמית אבל קודם לשטוף את המזרק 3× עם חומצה פורמית. יש לשטוף את החומצה פורמית מהמזרק מיד לאחר מכן בכלורופורם. השתמש 30 מ"ל של התערובת כדי להרטיב את הנייר ולשטוף את המיכל. יש להשליך את תמיסת השטיפה ולהוסיף את 70 מ"ל הנותרים למיכל.
      1. קח את המתלים והנמיך אותם בעדינות לתוך המיכל. צפה עד חזית הממס מגיע כתמי מדגם, ולאחר מכן להפעיל את שעון התזמן. לאחר 25 דקות, להסיר את המוטות מתא הפיתוח, יבש בתא לחות קבוע במשך 5 דקות, ולפתח מחדש באותו פתרון במשך 20 דקות נוספות.
    2. יבש את המוטות במשך 5 דקות בסורק FID אוטומטי ולאחר מכן לסרוק לנקודה הנמוכה ביותר מאחורי פסגת קטון באמצעות סריקת PPS של 25.
  3. רצף המוביל לכרומטוגרמה השנייה (טריאציליגליצרול לדיאקילגליצריול):
    1. מרככים את המוטות במשך 5 דקות בתא הלחות הקבוע.
    2. מערכת פיתוח שנייה: מערכת הפיתוח השנייה היא hexane:diethyl אתר:חומצה פורמית, 79:20:1. הוסף ~ 30 מ"ל למיכל הפיתוח כדי להרטיב את הנייר ולשטוף את המיכל. ואז להשליך ולפתח את המוטות במשך 40 דקות ב 70 מ"ל הנותרים. להפרדה הטובה ביותר בין הפסגות TAG (רווי) לבין TAG (רב בלתי רווי) השתמש בתערובת של 79.9:20:0.1, אך להפרדה בין פסגות ST ו- DAG השתמש בתערובת של 79:20:1.
    3. יבש וסריקה לנקודה הנמוכה ביותר מאחורי שיא diacylglycerol בסריקה חלקית שנייה באמצעות סריקת PPS 11.
  4. רצף המוביל לכרומטוגרמה השלישית (שומנים קוטביים ופוספוליפידים ניידים אצטון)
    1. מרככים את המוטות במשך 5 דקות בתא הלחות הקבוע.
    2. לפתח את המוטות פעמיים במשך 15 דקות ב 70 מ"ל של אצטון. בין ההתפתחויות האוויר לייבש את המוטות במשך כ 30 שניות.
    3. מרככים את המוטות במשך 5 דקות בתא הלחות הקבוע.
    4. מערכת פיתוח שלישית: מערכת הפיתוח השלישית היא תערובת של כלורופורם, מתנול ומים המופקים מכלורופורם, 50:40:10. לפתח את המוטות פעמיים במשך 10 דקות ב 70 מ"ל של התערובת. בין ההתפתחויות, האוויר לייבש את המוטות במשך כ -30 שניות.
    5. יבש ולסרוק אורך שלם של מוטות.

5. תהילה נגזרת עם H2SO4 ב MeOH

  1. מה שהופך את הילדיץ' ריאגנט
    1. הכנת מתנול: מניחים 100 מ"ל של MeOH בבקבוק נפחי נקי ולאחר מכן מפזרים בעדינות NaSO4 נטול מים עד שתחתית הבקבוק מכוסה. לאחר כיסוי, הפוך פעמיים, כך שכל מים במתנול נספגים על ידי NaSO4. לאחר היפוך ורעד, תן לו לשבת לפחות 5 דקות.
    2. הוספת החומצה: לאט לאט decant מתנול לתוך צנצנת זכוכית (עד עכשיו NaSO4 הוא גוש קשה בתחתית הבקבוקון) ואת H2SO4 מתווסף. לאט לאט להוסיף 1.5 מ"ל חומצה גופרתית למתנול באמצעות פיפטה. מוסיפים כמה טיפות בכל פעם וברגע שכל החומצה נוספה, מכסים ומערבבים בעדינות לערבב. הפתרון מוכן כעת לשימוש בנגזרים, אך יש לפצותו על בסיס שבועי.
  2. מה שהופך את הנגזרות
    1. מעבירים כ-200 מיקרוגרם שומנים מנגינה תמציתית שהנפח שלה עד לכמות ידועה, לנקניקייה נקייה של 15 מ"ל ומתאדה מתחת לחנקן ליובש. הסכום שהוסר ייקבע על ידי ריכוז המדגם מ- TLC / FID. השתמש פיפטה נקייה כדי להסיר את המדגם.
    2. כאשר המדגם התייבש, להוסיף 1.5 מ"ל של dichloromethane ו 3 מ"ל של ריאגנט Hilditch החדש עשה.
    3. מערבולת המדגם, sonicate אותו באמבטיה קולית במשך 4 דקות כדי להסיר שומנים כי דבקו בקבוקון הזכוכית. מלאו את המצטה בחנקן, כובע, ולאטום אותו עם סרט PTFE וחום ב 100 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
  3. עצירת התגובה
    1. אפשר את הדגימות להתקרר לחלוטין לטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לאחר הסרת התנור, ולאחר מכן לפתוח את הבקבוקונים בזהירות.
    2. לאט לאט להוסיף כ 0.5 מ"ל פתרון סודי רווי של נתרן ביקרבונט (9 גרם / 100 מ"ל מים המופקים כלורופורם), ולאחר מכן 1.5 מ"ל hexane. לנער או מערבולת את המשחקון, ולאחר מכן לתת לעמוד כך שהוא נפרד ל 2 שכבות.
  4. איסוף התהילה
    1. הסרת השכבה העליונה: לאחר שהגזרה נעצרה, ויש הפרדה ברורה, הסר את השלב העליון, האורגני והמקום בלווידים נקיים 2 מ"ל.
    2. לאדות את הממס ב 2 מ"ל בוחן ליובש ולמלא אותו עם hexane לכ 0.5 מ"ל.
    3. מלא את שטח הראש של הגואל עם חנקן, כובע ולאטום את המשחקון עם סרט PTFE, sonicate במשך 4 דקות נוספות כדי להשעות מחדש את חומצות השומן, ולאחר מכן הוא מוכן ללכת GC.
      הערה: אם נדרשים ריכוזי חומצות שומן, יש לשטוף את השכבה המימית שלוש פעמים עם הקסאן ואת כל השכבות האורגניות הצטברו לתוך 2 מ"ל בוויאל. זה כרוך הוספת 2 מ"ל של hexane, מערבולת המדגם, centrifuging, והסרת השכבה האורגנית, כל חזר על עצמו 3 פעמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כמגזר ייצור המזון הצומח ביותר, חקלאות ימית מתפתחת במונחים של חידושים טכנולוגיים והתאמות כדי לעמוד בדרישות המשתנות. אחד מהם הוא להפחית את התלות בדגים שמקורם בטבע ושמן דגים, המספקים מרכיבי הזנה למינים רבים של חקלאות ימית. שמנים צמחיים יבשתיים נחקרים כתחליף בר קיימא וחסכוני לשמן דגים במים, והכבד הוא רקמת יעד לניתוח מכיוון שהוא האתר העיקרי לחילוף חומרים שומנים12. איור 2 מראה את הכרומטוגרמה הגולמית TLC-FID המתקבלת מהתקן בן תשעת הרכיבים שלנו, דיאטה שניסחנו עם שמן דגים ב-7% ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המהירות שבה מערכת TLC-FID מספקת מידע מחלקת שומנים סינופטיים מדגימות קטנות הופכת את TLC-FID לכלי מסוגל לבדיקת דגימות ימיות לפני ביצוע הליכים אנליטיים מעורבים יותר. ניתוחים כאלה דורשים בדרך כלל שחרור של תרכובות רכיבים מתמציות שומנים ונגזרות כדי להגביר את התנודתיות במקרה של כרומטוגרפיה גז. TLC-FID בשילוב עם GC-FID נמצא כשילוב רב עוצמה עבור תמציות של פירות ים ומוסדות מזון אחרים14. עבור ניתוחי שומנים ימיים מוצלחים זה קריטי כי דגימות מוגנות מפני השפלה וזיהום לאורך כל וזה טיפול רב נלקח עם היישום של המדגם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

מחקר זה מומן על ידי המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה (NSERC) מענק מספר 105379 ל- C.C. Parrish. רשת ציוד המחקר והכשרת הכלים המרכזיים של אוניברסיטת ממוריאל (CREAIT) סייעה לממן פרסום זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוקונים 15 מ"לVWR66009-560
1-hexadecanolSigma258741-1G
1-Monopalmitoyl-rac-glycerolSigmaM1640-1g
בקבוקונים 2 מ"לVWR46610-722
25 מ"מ מסנני סיבי זכוכיתפישר09 874 32A
נורות פיפט 2 מ"לVWR82024-554
מסנני סיבי זכוכית 47 מ"מפישר09 874 32
5 3/4 אינץ' פיפטפישר1367820A
9 אינץ' פישר1367820C
אצטוןVWRCAAX0116-1
Agilent GC-FID 6890אג'ילנט
סידן כלוריד ANHS 500 גרםVWRCACX0160-1
פקקים לבקבוקונים של 2 מ"לVWR46610-712
כלורופורםVWRCACX1054-1
כולסטריל פלמיטטסיגמאC6072-1G
Chromarod S5Shell ארה"ב3252
דיכלורומתאןVWRCADX0831-1
DL-a-פוספטידילכולין, דיפלמוטואילסיגמאP5911-1g
אתיל אתר, אנהידר בדרגת ACS 4LVWRCAEX0190-4
גליצריל טריפלמיטטSigmaT5888-100MG
מזרק המילטון 702SNR 25µ lSigma58381
הליוםאוויר נוזליA0492781
הקסאןVWRCAHX0296-1
ווסת מימןVWR55850-484
Iatroscan MK6Shell ארה"ב
KimwipesFisher066662
אוויר רפואינוזליA0464563
כפפות ניטריל בינוניותפישר191301597C
כפפות ניטריל LVWRCA82013-782
חנקןאוויר נוזליA0464775
ווסת חנקןVWR55850-474
NonadecaneSigma74158-1G
חומצה פלמיטיתסיגמאP0500-10G
מתקן חוזרSigma20943
נתרן ביקרבונט 1 ק"גVWRCA97062-460
נתרן סולפט Anhy ACS 500 גרםVWRCA71008-804
חומצה גופרתיתVWRCASX1244-5
קלטת טפלוןפישר
רקמות מאסטר 125 115V w/7mm הומוגנטורOMNI בינלאומיTM125-115
TLC מיכל פיתוחמעטפת ארה"ב3201
UHP מימןאוויר נוזליA0492788
VWR ממס מחזירVWR82017-766
טיימר VWR מהבהב LED 2 ערוץVWR89140-196
זברון ZB-שעווה GC עמודPhenomenex7HM-G013-11
14610120

מקורות

  1. Couturier, L. I. E., et al. State of art and best practices for fatty acid analysis in aquatic sciences. ICES Journal of Marine Science. , (2020).
  2. Parrish, C. C. Lipids in Marine Ecosystems. ISRN Oceanography. , 604045(2013).
  3. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. H. S. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226, 497-509 (1957).
  4. Vaz, F. M., Pras-Raves, M., Bootsma, A. H., van Kampen, A. H. C. Principles and practice of lipidomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. , (2014).
  5. Wolf, C., Quinn, P. J. Lipidomics: practical aspects and applications. Progress in Lipid Research. 47, 15-36 (2008).
  6. Parrish, C. C. Determination of total lipid, lipid classes, and fatty acids in aquatic samples. Lipids in Freshwater Ecosystems. Arts, M. T., ainman, B. C. , Springer-Verlag. New York. 4-20 (1999).
  7. Jüttner, F. Liberation of 5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid and other polyunsaturated fatty acids from lipids as a grazer defense reaction in epilithic diatom biofilms. Journal of Phycology. 37, 744-755 (2001).
  8. Carreón-Palau, L., Parrish, C. C., Pérez-España, H., Aguiñiga-Garcia, S. Elemental ratios and lipid classes in a coral reef food web under river influence. Progress in Oceanography. 164, 1-11 (2018).
  9. Maciel, E., et al. Bioprospecting of marine macrophytes using MS-based lipidomics as a new approach. Marine Drugs. 14, 49(2016).
  10. Pernet, F., Tremblay, R., Comeau, L., Guderley, H. Temperature adaptation in two bivalve species from different thermal habitats: energetics and remodelling of membrane lipids. Journal of Experimental Biology. 210, 2999-3014 (2007).
  11. Bergen, B. J., Quinn, J. G., Parrish, C. C. Quality-assurance study of marine lipid-class determination using Chromarod/Iatroscan thin-layer chromatography-flame ionization detector. Environmental Toxicology and Chemistry. 19, 2189-2197 (2000).
  12. Foroutani, B. M., Parrish, C. C., Wells, J., Taylor, R. G., Rise, M. L. Minimizing marine ingredients in diets of farmed Atlantic salmon (Salmo salar): effects on liver and head kidney lipid class, fatty acid and elemental composition. Fish Physiology & Biochemistry. 46, 2331-2353 (2020).
  13. Parrish, C. C., Deibel, D., Thompson, R. J. Effect of sinking spring phytoplankton blooms on lipid content and composition in suprabenthic and benthic invertebrates in a cold ocean coastal environment. Marine Ecology Progress Series. 391, 33-51 (2009).
  14. Sinanoglou, V. J., et al. On the combined application of Iatroscan TLC-FID and GC-FID to identify total, neutral, and polar lipids and their fatty acids extracted from foods. ISRN Chromatography. , 59024(2013).
  15. Peters-Didier, J., Sewell, M. A. Maternal investment and nutrient utilization during early larval development of the sea cucumber Australostichopus mollis. Marine Biology. 164, 178(2017).
  16. Triesch, N., et al. Concerted measurements of lipids in seawater and on submicron aerosol particles at the Cape Verde Islands: biogenic sources, selective transfer and high enrichments. Atmospheric Chemistry and Physics. 21, 4267-4283 (2021).
  17. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Determination of glycoglycerolipids by Chromarod thin-layer chromatography with Iatroscan flame ionization detection. Journal of Chromatography A. 741, 91-97 (1996).
  18. Mejri, S., et al. Bonefish (Albula vulpes) oocyte lipid class and fatty acid composition related to their development. Environmental Biology of Fishes. 102, 221-232 (2019).
  19. Sewell, M. A. Utilization of lipids during early development of the sea urchin Evechinus chloroticus. Marine Ecology Progress Series. 304, 133-142 (2005).
  20. Parrish, C. C., Bodennec, G., Gentien, P. Separation of polyunsaturated and saturated lipids from marine phytoplankton on silica gel coated Chromarods. Journal of Chromatography A. 607, 97-104 (1992).
  21. Stevens, C. J., Deibel, D., Parrish, C. C. Incorporation of bacterial fatty acids and changes in a wax ester-based omnivory index during a long-term incubation experiment with Calanus glacialis Jaschnov. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 303, 135-156 (2004).
  22. Goutx, M., et al. Short term summer to autumn variability of dissolved lipid classes in the Ligurian Sea (NW Mediterranean). Biogeosciences. 6, 1229-1246 (2009).
  23. Conlan, J. A., Rocker, M. M., Francis, D. S. A. comparison of two common sample preparation techniques for lipid and fatty acid analysis in three different coral morphotypes reveals quantitative and qualitative differences. PeerJ. 5, 3645(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח ליפידים ימייםמיצוי ליפידיםקביעת כמות ליפידים כוללתכרומטוגרפיה בשכבה דקהגילוי ביינון בלהבהמיצוי כלורופורם-מתנולסינון מי יםביו-אקומולציה של ליפידיםמערכות אקולוגיות מימיות
קביעת שיעורי השומנים והשומנים הכוללים בדגימות ימיות
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.