גישה מיקרופלואידיקה לחקירה פונקציונלית של איתות תנודות השולטות בסמיטוגנזה

סיכום

פרוטוקול לתרבות ומניפולציה של רקמת עובר עכבר על שבב microfluidic מסופק. על ידי החלת פולסים של אפננים מסלול, מערכת זו יכולה לשמש כדי לשלוט חיצונית תנודות איתות לחקירה פונקציונלית של סמיטוגנזה עכבר.

תקציר

פילוח תקופתי של המזודרם הפרזומיטי של עובר עכבר מתפתח נשלט על ידי רשת של מסלולי איתות. תנודות איתות ושיפועים נחשבים לשלוט על התזמון והמרווח של היווצרות קטע, בהתאמה. בעוד מסלולי איתות המעורבים נחקרו בהרחבה בעשורים האחרונים, ראיות ישירות לתפקוד של איתות תנודות בשליטה סומיטוגנזה כבר חסר. כדי לאפשר חקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות, microfluidics הוא כלי שהוקם בעבר עבור אפנון עדין של דינמיקה זו. עם זה microfluidics מבוסס entrainment גישה אנדוגני איתות תנודות מסונכרנות על ידי פולסים של אפננים מסלול. זה מאפשר אפנון של, למשל, תקופת התנודה או את הפאזה-יחסים בין שני מסלולים מתנדנדים. יתר על כן, שיפועים מרחביים של אפננים מסלול ניתן להקים לאורך הרקמה כדי ללמוד כיצד שינויים ספציפיים בשיפועי איתות להשפיע על סמיטוגנזה.

הפרוטוקול הנוכחי נועד לעזור ליצור גישות מיקרופלואידיות עבור המשתמשים הראשונים של מיקרופלואידיקה. העקרונות הבסיסיים והציוד הדרושים להקמת מערכת מיקרופלואידית מתוארים, וניתן עיצוב שבב, שאיתו ניתן להכין תבנית לייצור שבבים בנוחות באמצעות מדפסת תלת-ממד. לבסוף, כיצד לתרבות רקמת עכבר ראשית על שבב microfluidic וכיצד לאמן תנודות איתות לפולסים חיצוניים של אפננים מסלול נדונים.

מערכת מיקרופלואידית זו יכולה להיות מותאמת גם לאספקת מערכות מודל אחרות של vivo ו - vio במבחנה כגון gastruloids ו organoids לחקירה פונקציונלית של דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן בהקשרים אחרים.

מבוא

הפיתוח נשלט על ידי תקשורת בין-תאית באמצעות מסלולי איתות. יש רק מספר מוגבל של מסלולי איתות המתזמרים היווצרות מורכבת של רקמות ובידול תאים נכון במרחב ובזמן. כדי לווסת את ריבוי התהליכים, מידע יכול להיות מקודד בדינמיקה של מסלול איתות, שינוי מסלול לאורך זמן, כגון תדירות או משך של אות ^1,2.

במהלך סמיטוגנזה, רקמה סומיטית מחולקת מעת לעת מן mesoderm presomitic (PSM)³. ה- PSM מאורגן באופן מרחבי על ידי שיפועים של Wnt, גורם גדילה פיברובלסט (FGF) ואיתות חומצה רטינואית. ב- PSM הקדמי בחזית הקביעה, כאשר אותות Wnt ו- FGF נמוכים, התאים מוכנים לבידול לסומיטים. הבחנה מתרחשת כאשר גל של הפעלה תמלולית מגיע לחזית קביעה זו. בתוך PSM, Wnt, FGF, ו Notch איתות תנודה. תאים שכנים מתנדנדים מעט מחוץ לפאזה, מה שגורם לגלים של הפעלה תמלולית מתנדנדת במורד הזרם של מסלולי Wnt, FGF ו- Notch הנוסעים מהחלק האחורי ל- PSM הקדמי. בעוברי עכבר, גל תמלול מגיע לחזית הקביעה בערך כל 2 שעות ויוזם היווצרות מוכה. לימוד סומיטוגנזה על ידי הפרעה או הפעלה של מסלולי איתות יכול להמחיש את החשיבות של מסלולים אלה4,5,6,7,8,9. עם זאת, כדי להיות מסוגל לחקור את הפונקציה של דינמיקת איתות בשליטה של התנהגות הסלולר, זה חיוני כדי לווסת בעדינות נתיבי איתות במקום להפעיל או לעכב אותם לצמיתות.

כדי לווסת זמנית את פעילות מסלול האיתות בתוך עובר העכבר פילוח, Sonnen ואח ' פיתחו מערכת ^{מיקרופלואידית10}. מערכת זו מאפשרת שליטה הדוקה של זורם נוזלים בתוך מיקרוצנלים של שבב המכיל את המדגם ^{הביולוגי11}. כדי ללמוד את החשיבות של דינמיקת איתות עבור פילוח נכון של PSM, התקנה זו microfluidics מנוצל כדי לווסת את הדינמיקה איתות של שעון פילוח העכבר ex vivo. על ידי מפעילי מסלול פועם ברצף או מעכבים לתוך תא התרבות, שליטה חיצונית של הדינמיקה של Wnt, FGF, ו Notch איתות ^מושגת10. לדוגמה, ניתן לשנות את התקופה של מסלולים בודדים ואת יחסי הפאזה בין מסלולי איתות מתנדנדים מרובים. באמצעות הדמיה בזמן אמת בו זמנית של כתבי איתות דינמיים, ניתן לנתח את ההשפעה של אימון על המסלולים עצמם, על בידול ועל היווצרות סומיט. באמצעות רמה זו של שליטה על דינמיקת איתות, החשיבות של יחסי הפאזה בין Wnt - ו Notch איתות מסלולים במהלך somitogenesis ^הודגש10.

עיצובי שבבים מותאמים אישית מאפשרים שפע של אפשרויות להפרעות מרחביות בתוך הסביבה המקומית, למשל, היווצרות שיפוע יציבה12,13,14,15, הפעלה/עיכוב פועם10,16,17,18 או הפרעות ^{מקומיות19,20} . Microfluidics יכול גם לאפשר קריאה לשחזור יותר ותפוקה גבוהה יותר עקב אוטומציה של טיפול ניסיוני21,22,23. הפרוטוקול הנוכחי נועד להביא מיקרופלואידיקה ו entrainment של תנודות איתות אנדוגני בתוך רקמות לכל מעבדת מדעי החיים סטנדרטית. גם בהיעדר ציוד מתוחכם לייצור שבבים, כגון חדר נקי וציוד לליתוגרפיה רכה, ניתן לייצר שבבים מיקרופלואידיים ולהשתמש בהם כדי לענות על שאלות ביולוגיות. ניתן לעצב תבניות באמצעות תוכנת עיצוב (CAD) הזמינה באופן חופשי בעזרת מחשב. תבנית לייצור שבבים מיקרופלואידיים, המורכבת בדרך כלל מפולידימתילסילוקסן (PDMS), ניתנת להדפסה עם מדפסת תלת-ממד, או להזמין מחברות הדפסה. בדרך זו, שבבים microfluidic ניתן לייצר בתוך יום אחד ללא הדרישה של ציוד ^יקר24. כאן, עיצוב שבב מסופק, שבו עובש עבור entrainment של שעון פילוח העכבר בתרבויות ex vivo דו-ממדי (2D) ex vivo25 ניתן להדפיס עם מדפסת 3D.

תרביות על שבב ו ההפרעות המדויקות, המופעלות על ידי מיקרופלואידיקה, מחזיקות בפוטנציאל יוצא מן הכלל בפענוח המנגנונים המולקולריים של האופן שבו מסלולי איתות שולטים בהתנהגות רב-תאית. דינמיקת איתות ושיפועי מורפוגן נדרשים לתהליכים רבים בפיתוח. בעבר, מעבדות היו תאים תרבית, רקמות ואורגניזמים שלמים שבבים microfluidic ופרוטוקולים עבור הפרעה spatiotemporal של תרבית תאים דו-ממדיים בעיקר מסופקים במקומות אחרים 12,26,26,27,28,29. החלת מיקרופלואידיקה לווסת סביבות מקומיות במערכות רב-תאיות פותחת נקודות מבט חדשות עבור הפרעות מרחביות בעלות תפוקה גבוהה ומדויקות. תחום המיקרופלואידיקה הגיע כעת לנקודה שהוא הפך לכלי לא מומחה, זול וישים בקלות לביולוגים התפתחותיים.

כאן, פרוטוקול עבור entrainment של שעון פילוח העכבר לפולסים של מעכב איתות חריץ מסופק. ניסוי כזה מורכב מהשלבים הבאים: (1) ייצור שבב מיקרופלואידי, (2) הכנת צינורות וציפוי של השבב, ו-(3) הניסוי המיקרופלואידי עצמו (איור 1A). מחקרים הקשורים למערכות מודל בעלי חוליות דורשים אישור אתי מוקדם מהוועדה האחראית.

פרוטוקול

המחקר המוצג כאן אושר על ידי ועדת האתיקה של ^EMBL10 והוועדה ההולנדית לחקר בעלי חיים (dierenexperimentencommissie, DEC), ועוקב אחר הנחיות הוברכט לטיפול בבעלי חיים.

יש ללבוש כפפות תוך כדי עבודה עם PDMS נוזלי. לכסות משטחים וציוד. הסר כל דליפות מיד, כמו ניקוי הופך להיות קשה ברגע שהוא התקשה.

1. דור השבב

הערה: שבבים מיקרופלואידיים נוצרים על ידי יציקת PDMS (Polydimethylsiloxane) בתבנית. ניתן לעצב תבניות באמצעות תוכנת CAD (למשל, uFlow או ^3DμF30). מאגר של עיצובים בחינם מסופק על ידי MIT (Metafluidics.org). תבניות מודפסות במדפסת תלת-ממד או יכולות להיווצר על ידי ליטוגרפיה רכה באמצעות מסכת צילום המכילה את העיצוב הרצוי (למידע נוסף ראו, למשל, Qin et al., ²⁰¹⁰³¹). כאן מסופק עיצוב לעובש שניתן להדפיסו עם מדפסת תלת-ממד לתרבות על השבב של רקמת עובר העכבר (איור 1B,C, Files משלימים 1 ו-2). כדי לאפשר הדפסה עם מדפסות תלת-ממד ברזולוציה נמוכה יותר, העיצוב השתנה בהשוואה ל- ^one10 שפורסם בעבר. עובש ללא מלכודות בועת אוויר ואחד עם מלכודות בועת אוויר מסופק (קבצים משלימים 1 ו 2, בהתאמה). מאחר שההליך להדפסה תלוי במדפסת הזמינה, הפרטים להדפסה לא יתואר. עם זאת, יש לוודא כי כל שרף לא פולימרי מוסר לחלוטין. לעתים קרובות הוא נדרש לבצע כביסה נוספת עם ממיסים כדי להסיר שרף לא פולימרי מן החורים הקטנים <200 מיקרומטר בתוך התא microfluidic. חורים אלה ייצרו עמודי PDMS כדי ללכוד את הרקמה העוברית בתוך השבב במהלך הניסוי. PDMS משמש בדרך כלל עבור microfluidics, כפי שהוא זול, תואם ביולוגית, ושקוף, ויש לו autofluorescence נמוך. לאחר הריפוי, שבב ה-PDMS נחתך מהתבנית ומחובר למגלשת זכוכית. טיפול בפלזמה הן של הזכוכית והן של שבב ה- PDMS מפעיל את המשטחים ומאפשר היווצרות של קשרים קוולנטיים, כאשר הם באים במגע.

1. הכן את הכמות הנדרשת של PDMS על ידי ערבוב המונומר עם הזרז ביחס של 9:1 (w:w) כדי לגרום פילמור. השתמשו בכלים חד פעמיים לערבוב, כגון כוסות פלסטיק ומזלגות. ודא כי הערבוב מושגת כראוי.
2. מניחים את תערובת PDMS במייבש ומניחים ואקום במשך כ -30 דקות כדי להסיר אוויר מתערובת PDMS. בשל הוואקום בתוך המייבש, האוויר יוסר מתערובת PDMS.
   הערה: לכסות את החלק הפנימי של התייבשות עם רקמות במקרה PDMS זורם מעל.
3. יוצקים את תערובת ה-PDMS לתבנית השבבים (מספיקה שכבת PDMS של כ-3-5 מ"מ).
4. מניחים את התבנית המלאה PDMS בחזרה לתוך המייבש ולהחיל ואקום כדי להסיר את כל הבועות הנותרות. ודא כי האוויר מוסר מכל המבנים הקטנים יותר של התבנית.
5. לרפא את התבנית על ידי הצבתו בתנור 65 °C (או נמוך יותר בהתאם לחומר התבנית) לילה. חותכים את השבב מהתבנית באמצעות אזמל. חותכים את ה- PDMS הקשוח מהתבנית עם מספיק מקום (1-2 ס"מ) סביב העיצוב כדי לאפשר מליטה מאוחרת יותר. הקפד לחתוך את PDMS לחלוטין כדי למנוע שבירה של השבב בעת הוצאתו. הרם את שבב PDMS בזהירות, תחילה עם הקצה הבוטה של האזמל, וכאשר אפשר, עם הידיים.
6. ניקוב חורי כניסה ושקע, החל מבפנים של התא microfluidic באמצעות אגרוף ביופסיה 1 מ"מ.
7. נקו את שבב ה-PDMS בקצרה עם אוויר דחוס והדביקו סרט הדבקה משני הצדדים כדי להסיר פיסות PDMS ואבק תקועות ולשמור עליו נקי עד לשימוש נוסף.
   הערה: ניתן לשמור את השבב כך עד לשימוש נוסף.
8. נקו את מגלשת הזכוכית עם אוויר דחוס. היזהר שזה לא נשבר. הסר סרט דבק משבב ה- PDMS.
9. קשרו את השבב למגלשת הזכוכית באמצעות תנור פלזמה. ההוראות הבאות מותאמות עבור פלזמת אוויר.
   הערה: יש להתייעץ עם המדריך לתנור הפלזמה של המעבדה ולמטב את ההליך לניסוי הספציפי.
   1. מניחים את שבב שקופית זכוכית לתוך תנור פלזמה עם הצדדים להיות מלוכדים עם הפנים כלפי מעלה.
   2. מניחים את המכסה על תנור הפלזמה ומחזיקים אותו במקומו תוך מריחת ואקום וממתינים עד שנוצר ואקום.
   3. הפעל את הגז על ידי לחיצה על כפתור הגז ולחכות כ 1 דקות (הלחץ צריך להיות סביב 0.37 mbar).
   4. צור פלזמה על ידי לחיצה על גנרטור (כוח: 9.0, זמן: 1 דקות).
   5. בסיום, כבה את המשאבה והגז; לאוורר ולפתוח את הדלת.
   6. קשרו את השבב לזכוכית על ידי הנחת המשטחים הפעילים זה על זה והפעלת לחץ באופן שווה. היזהר כי הזכוכית לא לשבור.
      הערה: ניתן לבצע בדיקת מים כדי לאשר שטיפול בפלזמה עבד. מניחים טיפת מים על משטח הזכוכית. אם טיפול פלזמה עבד, המים צריכים להתפשט מיד במקום ליצור טיפה.
10. מניחים את השבב המלוכד בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
11. לאטום את הצד החשוף של השבב עם סרט דבק כדי למנוע אבק מלהיכנס למפרצונים.
    הערה: ניתן לשמור את השבב עד לשימוש. יש לסגור את הפתחים עם סרט הדבקה עד אז.

2. הכנת ניסוי במיקרופלואידיקה

הערה: שלבי ההכנה הבאים נחוצים כדי לבצע את הניסוי microfluidics: ראשית, בעת ביצוע הניסוי microfluidics, זרימת נוזלים נוצרת מן הכניסות לשקעים. כל חור בשבב יתפקד כשקעים בשל הצטברות הלחץ מהמפרצונים. לכן, כל החורים שאינם בשימוש חייבים להיות סגורים; למשל, חורים המשמשים לטעינת רקמות על השבב. אם אלה לא סגורים, הרקמה עלולה לזרום החוצה עם הנוזל. כדי לסגור חורים אלה, צינורות מלאים PDMS משמש. צינורות מלאים PDMS ניתן לשמור ללא הגבלת זמן, ולכן, לא יהיה צורך להיות מוכן לכל ניסוי microfluidics בנפרד, אבל יכול להיעשות בקבוצות גדולות יותר. שנית, לפני תחילת הניסוי המיקרופלואידי, צינורות, צינורות מלאים PDMS והשבב, הנדרש לניסוי, מוכנים ומעוקרים UV. לבסוף, השבב צריך להיות מצופה פיברונקטין, כך הרקמה העוברית יכולה להתחבר ^{זכוכית25}.

1. הכנת צינורות מלאים PDMS.
   1. קח ± 1 מ 'של צינורות. צינורות נוספים יכולים להיות מלאים PDMS על ידי לקיחת חתיכות מרובות של צינורות.
   2. הכן את הכמות הנדרשת של PDMS על ידי ערבוב המונומר עם הזרז ביחס של 9:1 (w:w) כדי לגרום פילמור.
      הערה: השתמשו בכלים חד פעמיים לערבוב, כגון כוסות פלסטיק ומזלגות. מערבבים כמו שצריך.
   3. מניחים את תערובת PDMS במייבש ומניחים ואקום במשך כ -30 דקות כדי להסיר אוויר מתערובת PDMS.
      הערה: לכסות את החלק הפנימי של התייבשות עם רקמות במקרה PDMS זורם מעל.
   4. מלא מזרק של 3 מ"ל ב-PDMS. מלאו בזהירות כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בתערובת.
   5. השתמש מלקחיים כדי להכניס את הקצה של מחט 22 G לתוך הצינורות.
      הערה: היזהרו לא לנקב את הצינורות או את האצבעות עם המחט.
   6. חבר את הצינורות למזרק מלא PDMS דרך המחט. השתמש במשאבת המזרק כדי למלא את הצינורות, עם קצב זרימה של כ 500 μL / h. היזהר לא להפעיל לחץ גבוה מדי כדי למנוע שבירה של המשאבה.
   7. לאחר הצינורות מלאים לחלוטין PDMS, מניחים אותו בצלחת 15 ס"מ לרפא בטמפרטורת החדר (לפחות לילה).
2. הכינו את הצינורות והשבב לניסוי.
   הערה: הצינורות הבאים נדרשים לניסוי: ראשית, כ -50 ס"מ של צינורות לכל שקע ושני, כ 2-3 מ 'לכל מפרצון (הגודל המדויק תלוי בארגון המרחבי של המשאבות, החממה או המיקרוסקופ המשמשים בהמשך). הצינורות הנכנסים צריכים להיות ארוכים כדי לאפשר למדיום התרבותי להשתוות עם _CO2 לתרבות העובר במהלך הניסוי.
   1. חותכים את הצינורות בזווית של 45° כך שקצוות מחודדים נוצרים; זה יקל על החדרת הצינורות לתוך החורים של השבב. חבר מחט אחת לכל אחד מהצינורות הנכנסים. ראה שלב 2.1.5.
   2. חותכים צינורות במילוי PDMS לתקעים ±1 ס"מ. גזור בזווית של 45° כך שנוצרים קצוות מחודדים; זה יקל על החדרת הצינורות לתוך החורים של השבב. מספיק תקעים נדרשים כדי למלא כל חור שאינו מחובר לכל צינורות.
   3. הסר את סרט הדבקה מהשבב.
   4. מניחים את כל הצינורות עם מחטים מחוברות, השבב, ואת התקעים בצלחת לעקר על ידי חשיפה לאור UV במשך ±15 דקות. ניתן להשתמש בכל מכסה המנוע של תרבית התא עם אפשרות לעיקור UV.
3. ציפוי של שבב עם פיברונקטין.
   הערה: לתרבות של תרבויות 2D ex vivo של PSM אחורי, צפו את השבב בפיברונקטין.
   1. מניחים את השבב בכוס המכילה PBS + 1% פניצילין/סטרפטומיצין בטמפרטורת החדר. ודא שהשבב מכוסה לחלוטין ב-PBS. יש לשטוף את השבב עם PBS כדי להסיר אוויר עם פיפטה P200.
      הערה: כל טיפול נוסף בשבב ייעשה בכוס זו עד תחילת הניסוי כדי למנוע כניסת אוויר לשבב. היזהר לא לשבור את שקופית הזכוכית של השבב.
   2. הכינו 2 מ"ל של 1:20 פיברונקטין ב-PBS ומלאו בכוס.
   3. טען מזרק 3 מ"ל עבור כל תא של השבב. עם מלקחיים, הכנס מחט 22 גרם לתוך צינורות השקע. חבר את המחט למזרק המכיל פיברונקטין.
   4. חבר את המזרק למשאבת המזרק. לשטוף את הצינורות, עד שלא נשאר אוויר בצנרת.
   5. חבר את צינורות השקע לשקע של השבב. הקפד לדחוף את הצינורות כל הדרך לתחתית. הגדר קצב זרימה נמוך כדי לצפות את השבב. כל שאר הפתחים יכולים להישאר פתוחים. תן משאבת מזרק לרוץ לפחות 2 שעות, יכול גם לרוץ בן לילה.
   6. עצור את המשאבה. תחתוך את הצינורות מיד אחרי המחט. הצינורות הנותרים ישמשו כשקע במהלך הניסוי מאוחר יותר.

3. ניסוי מיקרופלואידיקה

הערה: כאן, פרוטוקול עבור entrainment של שעון פילוח העכבר בתרבויות ex vivo 2D על ידי החלת פולסים של מעכב איתות חריץ DAPT מוצג. החלת פולסים עם פרק זמן של 130 דקות, קרוב לתקופה הטבעית של שעון פילוח העכבר (137 ^min25), מאפשרת אימון יעיל. פולסים של 100 דקות בינוניות ו-30 דקות של 2 מיקרומטר DAPT מוחלים (איור 2A). הנוכחות של תרופה בתוך השבב מנוטר באמצעות צבע פלואורסצנטי. ספקטרום העירור והפליטה של צבע זה וכתב איתות פלואורסצנטי חייב להיות שונה מספיק כדי למנוע דימום דרך במהלך הדמיה פלואורסצנטית בזמן אמת. כאשר חלבונים פלואורסצנטיים צהובים משמשים ככתב איתות, כגון כתב איתות חריץ ^LuVeLu5 (שוליים מטורפים-ונוס-מטורף), הצבע, Cascade כחול, ניתן ליישם. כדי לזהות שילובים אפשריים אחרים של צבע פלואורסצנטי וכתב, ניתן להשתמש במציג הספקטרום הזמין באופן חופשי. ההשפעה של אימון ניתן לזהות על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים איתות דינמי ^5,10,32. לכל שבב יש שני תאי דגירה. זה מאפשר השוואה ישירה של פולסים סמים (DAPT) כדי לשלוט פולסים (DMSO).

1. הפוך בינוני ודגה.
   1. ביום הניסוי, להכין 50 מ"ל של מדיום תרבות (DMEM-F12 בתוספת גלוקוז 0.5 mM, 2 מ"מ גלוטמין, ו 1% BSA, לקבלת מידע נוסף של תרבות tailbud העכבר ^ראה25).
   2. הכן מזרקים מלאים במדיום לניסוי. הכן מדיום תרבות בכוסות: כדי לאמן תנודות איתות חריץ, להכין 6 מ"ל של בינוני עם 1.2 μL של DMSO + 10 μM Cascade כחול; 6 מ"ל של מדיום תרבות עם 2 מיקרומטר DAPT + 10 μM מפל כחול; שתי צינורות עם 6 מ"ל בינוני כל אחד. יש להשתמש ב-6 מ"ל לפחות של מ"ל בינוני למזרק. טען מזרקים עם המדיום. הקפד לתייג את המזרקים המכילים סמים ו- DMSO.
   3. Degas השבב בתוך PBS והמזרקים המכילים בינוני במייבש. מניחים את המזרקים בכוס כשהקצה פונה כלפי מעלה, כך שהאוויר יכול לברוח בחלק העליון. זה עלול להתרחש כי השבב צף והוא עדיין מלא בועות. אלה יוסרו לאחר מכן.
   4. נסו לשטוף /למצוץ את רוב בועות האוויר מהשבב באמצעות פיפטה P200. אם נשאר קצת אוויר, זה יוסר במהלך הניסוי הבא.
   5. התקן מזרקים במשאבות וחבר צינורות מפרצון למזרקים. כדי לאמן איתות חריץ ', השתמש בשתי משאבות מזרק, אחת נושאת את המזרקים הבינוניים, אחת נושאת את מזרקי התרופה / DMSO. תן לזה לרוץ בקצב זרימה גבוה יותר (0.5 מ"ל / שעה) עד תחילת הניסוי כדי להסיר בועות אוויר מן הצינורות. היזהר להגדיר את פרטי המזרק (קוטר) כראוי במשאבה.
2. העמסת רקמות על השבב.
   1. לנתח רקמת עובר עכבר. לנתח את הקצה האחורי ביותר של הזנב (tailbud). מניחים את הרקמה המנותחת לתוך מדיום תרבות + 25 מיקרומטר HEPES.
   2. לשטוף את השבב עם מדיום תרבית + 25 מיקרומטר HEPES באמצעות P200 כדי להסיר PBS.
   3. טענו את הרקמה לשבב באמצעות פיפטת P200 (איור 1C). הקפד לא להכניס בועות אוויר לתוך השבב.
      הערה: טעינה יעילה דורשת תרגול מסוים. אם הרקמה אינה מכוונת כראוי, ייתכן שניתן יהיה להפוך אותה על ידי מציצה בזהירות החוצה ושטיפה שוב. עם זאת, זה לעתים קרובות גורם למוות תא מהיר.
   4. לאחר כל שלב בטעינת רקמות, סגור את הכניסה המתאימה לטעינת רקמות באמצעות חתיכת צינורות מלאים PDMS. ודאו שהתקעים נדחפים מספיק לתחתית השבב באמצעות פינצטה קהה.
   5. לאחר שכל הדגימות נטענו, סגור את כל המפרצונים / שקעים שאינם בשימוש עם חתיכות של צינורות מלאים PDMS באמצעות מלקחיים קהים.
3. הרכבה של התקנה מיקרופלואידית.
   1. הנמיכו את קצב הזרימה של המשאבות המיקרופלואידיות. 60-100 μL / h עובד טוב עבור tailbuds עובר עכבר. בשיעורי זרימה גבוהים יותר נצפתה תמותת תאים – ככל הנראה בשל גזיזת תאים גבוהה מדי. קצב הזרימה המצטבר של משאבות מרובות לא יעלה על אלה 60-100 μL / h לכל תא microfluidic בזמן נתון.
   2. חבר צינורות לשבב המיקרופלואידי. לעשות זאת מבלי לקבל בועות אוויר בתוך השבב (זה יכול להיות מושגת על ידי הבטחת כי יש טיפה של נוכח בינוני בסוף הצינורות). שקעים עדיין נוכחים מציפוי הפיברונקטין (ראה 2.3).
   3. ברגע שכל הצינורות מחוברים לשבב, מוציאים אותו מהכוס, מייבשים אותו כמו שצריך, מניחים אותו בצלחת, ומניחים את זה יחד עם כ -1.5 מ 'של צינורות מפרצון באינקובטור (37 °C ,20% _O2, 5% _CO2) לתרבות הלילה. הצינורות חדירים לגז; זה יאפשר שיווי משקל של _{O2 ופחמן דו} חמצני במדיום. לחלופין, עבור הדמיה פלואורסצנטית בו זמנית בזמן אמת, השבב וכ 1.5 מ 'צינורות מפרצון ממוקמים לתוך המיקרוסקופ ישירות. מחזיק עבור השבב, אשר מתאים למחזיקי צלחת 96-well סטנדרטיים, מסופק בקובץ משלים 3.
      הערה: ודא שהלחות גבוהה מספיק במהלך הדגירה. במידת הצורך, הוסיפו רקמה לחה לתא ההדמיה או לאינקובטור כדי למנוע אידוי במערך המיקרופלואידיקה. אם הלחות בחממת המיקרוסקופ נמוכה מדי, התוצאה היא היווצרות בועת אוויר בצינורות ובשבב המיקרופלואידי. לאחר מכן ניתן להשתמש בתיבת הדמיה סגורה, שבה ממוקמים שבבים וצינורות. הדרך הפשוטה ביותר לעשות תיבת הדמיה כזו היא על ידי הצבת מכסה גדול על השבב והוספת רקמה רטובה, זה לא צריך להיות סגור לחלוטין. ודא כי הפרש הגובה בין משאבה ושבב אינו גדול מדי, ואם יש צורך, לשנות גבהים לאט כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר עקב כוח המשיכה.
   4. תן לכל המשאבות לזרום בקצב זרימה של 20 μL / h במשך 20 דקות, לאחר ההתקנה הוצבה למיקומה הסופי. מכיוון שהתא והמשאבה ככל הנראה נעו בגובה, יש צורך לבסס מחדש את הלחץ הנכון בצינורות.
   5. כבה את משאבת התרופה, תן רק את המשאבה הבינונית לרוץ ב 60 μL / h עד תחילת הניסוי / הדמיה בזמן אמת.
4. תחילת הניסוי.
   1. התחל את תוכנית השאיבה המתוכננת לניסוי. כדי לאמן איתות Notch, להשתמש בתוכנית שאיבה של 100 דקות בינוני ו 30 דקות פולסים סמים, אשר חוזר על עצמו עד סוף הניסוי, בדרך כלל במשך 24 שעות.
      הערה: ניתן להשתמש בכל משאבה מיקרופלואידית הניתנת לתכנות. בפורמט הפשוט ביותר, ניתן לתכנת את המשאבות ולהפעילן באופן ידני. לחלופין, המשאבות יכולות להיות נשלטות על ידי תוכנת מחשב.
   2. במקרה של הדמיה בזמן אמת, יש להתחיל בהדמיה לאחר פרק זמן של 30 דקות לפחות. זה יאפשר לטמפרטורת השבב להסתגל לטמפרטורה בתוך האינקובטור ולמנוע סחיפה חזקה מדי במהלך ההדמיה. פוקוס אוטומטי עדיין מועיל.
   3. בצע הדמיה קונפוקלית סטנדרטית באמצעות שקופית הזכוכית של השבב באמצעות מיקרוסקופ הפוך. השתמש מרווח הדמיה של 10 דקות כדי לזהות מספיק תנודות איתות עם תקופה של 130 דקות.
   4. לפרקי זמן קצרים יותר, קצרו את מרווח הזמן לדגימה מספקת. כלול מסלול הדמיה ברזולוציה נמוכה לגילוי של Cascade כחול כדי לדמיין את נוכחותה של תרופה על השבב.
   5. להתרגשות של כתב ונוס, השתמש בלייזר 515 ננומטר או לייזר 2 פוטון באורך גל של 960 ננומטר.
   6. לרכוש מחסנית z של 6-8 מישורים עם מרחק של 8 מיקרומטר דרך יעד תוכנית 20x (רזולוציה 512 x 512 פיקסלים, 1.38 מיקרומטר / פיקסל). השתמש בשלב ממונע כדי לדמות דגימות מרובות בניסוי אחד.
   7. רגש את Cascade Blue עם לייזר 405 ננומטר ורכוש מישור z יחיד כל 10 דקות (רזולוציה 32 x 32 פיקסלים, 22.14 מיקרומטר /פיקסל).
      הערה: מידע נוסף על הדמיה וניתוח תמונה מסופקים בתוצאות הייצוגיות וניתן למצוא אותם בהפניה ¹⁰.

תוצאות

עם פרוטוקול זה, מוצגת שיטה לאימון חיצוני של תנודות איתות של שעון פילוח העכבר באמצעות מיקרופלואידיקה. על ידי החלת פולסים של מעכב איתות Notch, איתות תנודות בתרבויות עובר עצמאיות לקבל מסונכרן זה ^לזה10. תנאי מוקדם ליישום של מערכת זו כדי ללמוד את הפונקציונליות של שעון הפילוח הוא כי דינמיקת איתות וסגמנטציה עדיין קיימים על שבב. בעבר הוכח כי הן דינמיקת האיתות של Wnt והן של Notch נשמרות למרות זרימה בינונית מתמדת ויצירת גבולות פיזיים נמשכת בתרבויות דו-ממדיות היקפיות, המייצגות את ^PSM10 הקדמי.

כדי לאשר אימון של תנודות איתות לפולסים תרופתיים חיצוניים, הדמיה בזמן אמת של, למשל, כתב איתות Notch ^LuVeLu5, המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי הצהוב ונוס, במהלך הניסוי המיקרופלואידי מבוצעת. מאז אוריינטציה של תרביות 2D על שבב קשה לשלוט, תנודות איתות ברקמה הקדמית מנותחים. ניתן לזהות את הפריפריה של התרבות הדו-ממדית. הכיוון של מקטעי הרקמה על השבב לא ניתן לשלוט כרצונו ואת כל פני השטח הפנימיים של השבב מקבל מצופה פיברונקטין. לכן, זה קורה מדי פעם כי תרבויות לצרף את הצדדים או התקרה של השבב. במקרה שהדגימות יוצאות משדה הראייה (בכיוון x, y ו- z) או שהן מתחברות לקצה האחורי של הזנב הפונה כלפי מטה, בדרך כלל דגימות אלה אינן נכללות.

לניתוח נוסף, משולבים מספר רב של ניסויי אימון כאלה. ניסויים עצמאיים יכולים להיות מיושרים זה לזה באמצעות התזמון של פולסים סמים דמיינו על ידי הצבע, Cascade כחול, על כ 400 ננומטר. כדי לנתח ולהציג סינכרון באופן חזותי, ניתן לבטל תנודות מכמתות (איור 2B,D) ולאחר מכן להציגן כממוצע וניתן לחשב סטיית תקן או שלבים של התנודות. זה מאפשר ניתוח של יחסי הפאזה בין תנודות של תרבויות עובר אחוריות עצמאיות זה לזה לבין פולסים סמים חיצוניים (איור 2C,E). התוכנית המבוססת על פיתון ^pyBOAT33 היא כלי פשוט וידידותי למשתמש כדי לקבוע תקופה, שלב, משרעת של תנודות איתות כאלה. כדי לאשר אימון, אפשר, למשל, לקבוע את התקופה של תנודות איתות אנדוגני. בעת החלת פולסים בפרק זמן של 130 דקות, תנודות איתות נוטש מציגות גם פרק זמן של 130 דקות (איור 2F)¹⁰. בנוסף, באמצעות פולסים כחולים מפל, ניסויים עצמאיים עם כתבי איתות שונים יכולים להיות מיושרים זה לזה. בדרך זו ^{ניתן לקבוע} בעקיפין את יחסי הפאזה בין תנודות של כתבי איתות מרובים.

לכן, המערכת המיקרופלואידית המוצגת מאפשרת שליטה על תנודות איתות בתרבויות ex vivo של עובר העכבר המתפתח. בשילוב עם הדמיה של סמנים להיווצרות קטע ובידול, מערכת זו יכולה כעת להיות מיושמת כדי לנתח כיצד מסלולי איתות של שעון הפילוח אינטראקציה וכיצד הם שולטים היווצרות somite.

איור 1: סקירה סכמטית של פרוטוקול המיקרופלואידיקה. (A) ניתן לתכנן תבניות שבבים באמצעות תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). עיצוב שבב כדי לאמן תנודות איתות בדגמי ex vivo של עכבר סמיטוגנזה מסופק. תבניות יכולות, למשל, להיווצר על ידי הדפסה בתלת-ממד או לפי הזמנה. שבבים מיקרופלוידיים מיוצרים על ידי דפוס של PDMS. שבב PDMS מוקשח נחתך ונקשר באופן קוולנטי למגלשת זכוכית באמצעות תנור פלזמה. משטח הזכוכית בתוך השבב מצופה פיברונקטין כדי לאפשר לרקמה המנותחת להתחבר. רקמה עוברית נטענת על השבב באמצעות מפרצונים טעינה, אשר נסגרים לאחר מכן. משאבות עם תנאי מדיה שונים מחוברות לכניסות השבב ותוכנית זרימה מאותחלת. ניתן לצלם רקמות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי במהלך הניסוי. (קימוגרפיות מעובדות מתוך Sonnen et al., 201810. הודפס מחדש ושונה מהתא בהתאם לייחוס Creative Commons CC BY-NC-ND 4.0.) (B) ציור סכמטי של עיצוב עובש לתרבות על שבב של רקמת עובר עכבר אחורית. הגובה של הערוצים המיקרופלואידיים הוא 500 מיקרומטר, מספיק לתרבות זנבות העכבר העובריים האחוריים. הקובץ להדפסת תבנית זו מסופק בקובץ משלים 1, ואלטרנטיבה ניתנת בקובץ משלים 2. (ג) תמונת ברייטפילד של זנב עכבר חתוך E10.5 המוקף בעמודי PDMS על השבב. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוצאות מייצגות מניסוי מיקרופלואידיקה. (א) ייצוג סכמטי של ניסוי אימון עם משאבה בינונית ותרופות. פולסים של אפנן מסלול איתות מוחלים על תרבויות ex vivo של עוברי עכבר ואת תנודות איתות ניתן לדמיין על ידי הדמיה בזמן אמת של כתבים איתות דינמי (למשל, נוטש איתות כתב LuVeLu5 ו Wnt איתות כתב Axin2T2A10). קווים מקווקווים מציינים את האזור המשמש לניתוחים לאורך זמן. (ב-פ) תנודות כתב LuVeLu הם entrained על ידי פולסים תקופתיים של DAPT מעכב איתות Notch. (ב,ד) כימותים של תנודות איתות חריץ ב- PSM הקדמי בעת אימון באמצעות DAPT או פקד DMSO. (ג,ה) התוויות קשר פאזה-פאזה בין השלב של תנודות איתות Notch ואת התזמון של פולסים DAPT / DMSO חיצוניים. במקרה של אימון, נוצר קשר פאזה יציב. (ו) כימות התקופה הממוצעת ו- SEM של תנודות עיתונאיות המשווה דגימות המורכבות עם פולסים DMSO ו- DAPT. (איור מעובד מסונת אל, 201810). הודפס מחדש ושונה מהתא בהתאם לייחוס Creative Commons CC BY-NC-ND 4.0.). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

בעיה	פתרונות מוצעים
ה-PDMS לא מתחבר לזכוכית.	- ודא גם PDMS וזכוכית נקיים.
	- ודא שיש מספיק PDMS סביב התא עבור מליטה.
	- לייעל את ההגדרות של תנור הפלזמה.
יש בועות אוויר על השבב שלי.	תבדוק אם המשאבה הופעלה.
	- דגה השבב לפני טעינת רקמה על השבב.
	דגה המדיום לפני תחילת הניסוי.
	תוודא שהלחות בתא הדגירה גבוהה מספיק.
הרקמה מתה בתחילת הניסוי.	- הוסף HEPES למדיום בעת טעינה והרכבת השבב.
	- אין לשטוף את הרקמה פנימה והחוצה לעתים קרובות מדי במהלך הטעינה.
	- ודא כי קצב הזרימה אינו גבוה מדי.
הרקמה מתה במהלך ההדמיה.	- ודא שאין פוטוטוקסיה מההדמיה
	תוודא שאין זיהום.
	- קצב הזרימה לא צריך להיות גבוה מדי.
המוקד משתנה במהלך ההדמיה.	- השתמש במיקוד אוטומטי במהלך ההדמיה כדי להתאים את הסחף של שקופית ההדמיה.
	- תן לשבב להתכווץ לטמפרטורה בתוך המיקרוסקופ למשך 30 דקות לפחות.
שקעים / מפרצונים מתנתקים.	- לדחוף את כל הצינורות לחלוטין למטה לתחתית.
השבב נשברת.	תיזהר יותר, הזכוכית מאוד שברירית.
	הזכוכית הדקה נדרשת רק להדמיה. אם הדמיה אינה מבוצעת, ניתן להשתמש במגלשת זכוכית עבה רגילה.
	- אם ההפסקה היא מחוץ לשבב, זה לא יכול להיות בעיה. אם חותם הזכוכית לשבב שבור, הנוזל ידלוף החוצה והאוויר ייכנס.
יש זיהום על השבב שלי.	תוסיף אנטיביוטיקה למדיום התרבותי.
	- לחטא את כל הציוד וצינורות.
	תעבדו מהר ונקי.

טבלה 1: פתרון בעיות

קובץ משלים 1: קובץ STL להדפסת תבנית עם מדפסת תלת-ממד. תבנית זו משמשת ליצירת שבב מיקרופלואידי לתרבות על השבב של הרקמה העוברית האחורית (עיצוב המוצג באיור 1). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2: קובץ STL להדפסת תבנית עם מדפסת תלת-ממד ליצירת שבב מיקרופלואידי לתרבות על השבב של הרקמה העוברית האחורית. בניגוד לקובץ המשלים 1 ולעיצוב המוצג באיור 1, עיצוב זה מכיל מלכודות בועות בכל הכניסות כדי למנוע מכמויות קטנות של אוויר להיכנס לתא המיקרופלואידי הראשי. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 3: עצב קובץ עבור יצירת מחזיק כדי למקם את השבב במיקרוסקופ. למחזיק זה יש את הממדים של צלחת 96 בארות והוא צריך להתאים למחזיקים סטנדרטיים של רוב המיקרוסקופים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

דיון

כיצד דינמיקת האיתות שולטת במערכות רב-תאיות הייתה שאלה ארוכת שנים בתחום. חקירה פונקציונלית מהווה אתגר מרכזי, כי הדינמיקה הזאת צריכה להיות מאופננת בעדינות כדי לאפשר את ^זה11. שליטה זמנית כזו על הפרעות מסלול ניתן להשיג באופן עקרוני עם אופטוגנטיקה, אשר מאפשר גם שליטה מרחבית ^גבוהה34. עם זאת, אופטוגנטיקה דורשת הקמת כלים גנטיים מתוחכמים לניתוח כל מסלול איתות המדובר. הפרוטוקול הנוכחי המתואר כאן מספק כלי רב תכליתי מאוד עבור ההפרעה של כל מסלול איתות. ניסוי המיקרופלואידיקה מאפשר יישום של פולסים תרופתיים מבוקרים זמנית כדי לחקור באופן פונקציונלי את הדינמיקה של מסלולי איתות בתרביות רקמות. כאן, ההתמקדות היא בחקר סומיטוגנזה בתרבויות ex vivo , אך ניתן להתאים את הפרוטוקול כך שיתאים לכל מערכות מודל אחרות.

שלבים מסוימים בפרוטוקול הם קריטיים לביצוע ניסוי מוצלח במיקרופלואידיקה (המסוכם בטבלה 1). נקודות מפתח נדונות כדלקמן. בשל זרימה בינונית במהלך הניסוי, תרבית הרקמה חווה מתח גזירה. חשיפה של מערכת המודל לזרימה רציפה יכולה לגרום ללחץ תאי ובמקרים קיצוניים למוות של תאים עקב אפקט הגזירה. עבור תרביות רקמת ex vivo של tailbuds העכבר ואת עיצוב השבב הנוכחי, קצב זרימה של 60 μL / h (מקסימום של 100 μL / h) נמצא לעבוד היטב עם אפקט גזירה מינימלי. כאשר משאבות מרובות מופעלות בו זמנית עבור אותו שבב, קצב הזרימה של משאבות בודדות צריך להיות מותאם בהתאם כדי לא לגרום לעלייה בקצב הזרימה הכולל. כאשר הפרוטוקול הנוכחי מותאם למערכות מודל אחרות ולעיצובי שבבים, יש למטב את קצב הזרימה. לחלופין, ניתן לא לשטוף בינוני ברציפות, אבל מעת לעת לשנות מדיום על ^השבב35. התקנה כזו יכולה להיות מיושמת גם על תנודות איתות בקרה בסומיטוגנזה של העכבר (לא פורסם, נתונים לא מוצגים). יתר על כן, ניתן גם לדמיין התקנה, שבה תרביות רקמות אינן חשופות לזרימת נוזלים ישירה, אך תרופות מגיעות לרקמה על ידי דיפוזיה מערוץ סמוך. מערכות כאלה שימשו בהצלחה כדי להחיל שיפועים של גורמי גדילה על מודלים במבחנה של בידול ^ESC14,36.

נושא מרכזי אחד של ניסויים מיקרופלואידיים הוא התרחשות של בועות אוויר על שבב במהלך הניסוי. בועות אוויר בתוך השבב או הצינורות עלולות להפריע לזרימה נוזלית אחידה על השבב ויכולות להוביל להסרת תרבות העובר ממיקומה. כדי למנוע נוכחות של בועות אוויר, צעדים שונים של הפרוטוקול הם הכרחיים. ראשית, מדיום תרבות בתוך מזרקים ואת השבב microfluidic עצמו חייב להיות degassed באמצעות ייבוש (שלב 3.1.3). שנית, בעת טעינת דגימות לתוך מפרצוני הטעינה, יש להיזהר שלא להזרים אוויר לתוך השבב יחד עם המדגם (שלב 3.2.3). שלישית, בעת מילוי הצינורות עם בינוני, כל בועות האוויר חייב להיות נשאב החוצה לפני הצמדת השבב (שלב 3.3.2). אחרת, בועות אלה יידחפו לתוך השבב הראשי במהלך הניסוי. לבסוף, במהלך הניסוי, המדיום הוא שיווי משקל בתוך תא ההדמיה או החממה בשל צינורות חדיר למחצה. חדירות הצינור מאפשרת גם אידוי של המדיום, לכן ודא כי הלחות מווסתת במהלך הניסוי כדי למנוע היווצרות של בועות חדשות בצינורות.

באופן כללי, microfluidics הוא כלי רב תכליתי מאוד שניתן להתאים לשאלה הספציפית של החוקר. הגישה העיצובית הנוכחית מאפשרת הדמיה של עד 12 תרביות ex vivo במקביל לשבב. מספר זה מוגבל בעיקר על ידי מספר העוברים לכל ניסוי והזמן שלוקח לדמיין כל תרבות עובר ברזולוציה מספקת. אם יש צורך להשוות תנאים מרובים בניסוי יחיד, ניתן להרכיב שבבים מרובים על שקופית זכוכית אחת. עיצוב שבב מסופק, אשר אידיאלי עבור הדמיה של explants רקמות מרובות במקביל, אבל עיצובים מותאמים אישית יכולים להתגבר על מגבלות במספר המדגם כדי לאפשר ניתוח תפוקה גבוהה ולהגדיל את השילוב של תנאים נוספים בתוך ניסוי ^אחד16,17. Microfluidics מוגבלת לדגמים שניתן לתרבות על שבב ותרבות על שבב יהיה צורך אופטימיזציה עבור כל מערכת מודל בנפרד 27,37,38.

במהלך 5-10 השנים האחרונות, microfluidics יושם כדי לטפל בשאלות ביולוגיות שונות בשל הפוטנציאל שלה גישות תפוקה גבוהה אפנון עדין של דינמיקת איתות ושיפועים. כיום, מיקרופלואידיקה הפכה לכלי ישים, זול ורב-תכליתי בקלות שמעבדות יכולות להקים בקלות. כאן, הפרוטוקול הנוכחי ממוטב עבור יישום מסוים, כלומר, לימוד דינמיקת איתות השולטת בסמיטוגנזה. זה פשוט להתאים את הפרוטוקול הזה ואת העיצוב כדי להתאים את שאלות מחקר בודדים בביולוגיה רקמות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מזרק 10 מ"ל	בקטון, דיקינסון והחברה	300912
184 חומר ריפוי סיליקון אלסטומר	SYLGARD	1673921
184 סיליקון אלסטומר PDMS	SYLGARD	1673921
מזרקים 3 מ"ל	בקטון, דיקינסון והחברה	309657
סרט			סקוטש מג'יק טייפ או דומה
מלקחיים עם קצה קהה Bochem 18/10 נירוסטה	Fisher Scientific	10663341
בקר סרום אלבומין Lyophilized pH~7	Biowest	P6154
מערכת
צלחת התגבשות	VWR	10754-7	מעוקר
D-(+)-גלוקוז 45%	Sigma	G8769
מייבש	VWR	467-0104
כוסות חד פעמיות	Duni	173 941
מזלגות חד פעמיים	סיכות	511514
ציוד
DMEM/F12	טכנולוגיות תרבית תאים	מותאמות אישית	DMEM/F-12, ללא פנול אדום, ללא L-גלוטמין, ללא גלוקוז
פיברונקטין	סיגמא	F1141-5MG
מכסה מנוע זרימה BioVanguard Greenline	CleanAir על ידי Baker	511514	עבור מקור אור UV
זכוכית שקופית מס 1.5H דיוק גבוה, 70x70 מ"מ	Marienfeld	107999098
HEPES Buffer	Gibco	15630-056
L-גלוטמין	Gibco	25030024
מיקרוסקופ	Leica	Leica SP8 MP
מחטים 22G	Becton, dickinson ו company	z412139-100EA
תנור	VWR	390-09
PBS0
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15070063
תנור פלזמה Femto	Diener אלקטרוני
אגרוף ואוסלאש; 1 מ"מ	חד ליבת	WB100073
סולם	Sartorius	Entris
משאבת מזרק	WPI	AL-4000
צינורות ואוסלאש; 1 מ"מ	APT	AWG24T
משאבת ואקום	VWR	181-0308