ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

Summary

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני תמלול ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי, כולל בקרת איכות וצעדי עיבוד מראש לגישות אנליטיות סטטיסטיות מתקדמות.

Abstract

פתוגנים יכולים לגרום למגוון רחב של מחלות זיהומיות. התהליכים הביולוגיים הנגרמים על ידי המארח בתגובה לזיהום קובעים את חומרת המחלה. כדי לחקור תהליכים כאלה, חוקרים יכולים להשתמש בטכניקות ריצוף תפוקה גבוהה (RNA-seq) המודדות את השינויים הדינמיים של התמלול המארח בשלבים שונים של זיהום, תוצאות קליניות או חומרת המחלה. חקירה זו יכולה להוביל להבנה טובה יותר של המחלות, כמו גם לחשוף מטרות וטיפולים תרופתיים פוטנציאליים. הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי. הצינור מחולק לחמישה שלבים: (1) בקרת איכות של הנתונים; (2) מיפוי וביאור של גנים; (3) ניתוח סטטיסטי לזיהוי גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי וגנים משותפים; (4) קביעת המידה המולקולרית של ההסתבכויות של דגימות; וניתוח פונקציונלי (5). שלב 1 מסיר ממצאים טכניים שעשויים להשפיע על איכות הניתוחים במורד הזרם. בשלב 2, גנים ממופים ומביאים ביאורים בהתאם לפרוטוקולי הספרייה הסטנדרטיים. הניתוח הסטטיסטי בשלב 3 מזהה גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי או באים לידי ביטוי בדגימות נגועות, בהשוואה לגנים שאינם נגועים. שונות מדגם ונוכחות של חריגים ביולוגיים פוטנציאליים מאומתים באמצעות מידת הגישה המולקולרית של perturbation בשלב 4. לבסוף, הניתוח התפקודי בשלב 5 חושף את המסלולים הקשורים פנוטיפ המחלה. הצינור המוצג נועד לתמוך לחוקרים באמצעות ניתוח נתוני RNA-seq ממחקרי אינטראקציה בין מארח לפתוגן ולהניע ניסויים עתידיים במבחנה או ב- vivo , החיוניים להבנת המנגנון המולקולרי של זיהומים.

Introduction

Arboviruses, כגון דנגי, קדחת צהובה, chikungunya, וזיקה, היו קשורים באופן נרחב עם מספר התפרצויות אנדמיות התגלו כאחד הפתוגנים העיקריים האחראים להדביק בני אדם בעשורים ^{האחרונים1,2}. אנשים נגועים בנגיף chikungunya (CHIKV) לעתים קרובות יש חום, כאב ראש, פריחה, polyarthralgia, דלקת פרקים3,4,5. וירוסים יכולים לחתור תחת ביטוי הגנים של התא ולהשפיע על מסלולי איתות מארח שונים. לאחרונה, מחקרי תמלול דם השתמשו RNA-seq כדי לזהות את הגנים המובעים דיפרנציאלי (DEGs) הקשורים זיהום CHIKV חריף בהשוואה ^הבראה6 או פקדים ....

Protocol

הדגימות המשמשות בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדות האתיקה הן מהמחלקה למיקרוביולוגיה של המכון למדעי הביו-רפואה באוניברסיטת סאו פאולו והן מהאוניברסיטה הפדרלית של סרג'יפה (פרוטוקולים: 54937216.5.0000.5467 ו- 54835916.2.0000.5546, בהתאמה).

1. התקנת שולחן עבודה של Docker

הערה: השלבים להכנת סביבת Docker שונים בין מערכות ההפעלה (OSs). לכן, משתמשי Mac חייבים לבצע את השלבים המפורטים כ- 1.1, משתמשי Linux חייבים לבצע את השלבים המפורטים כ- 1.2, ומשתמשי Windows חייבים לבצע את השלבים המפורטים כ- 1.3.

1. התקן ב-MacOS.
   1. גש לאתר האינטרנט של Get Docker (טבלת חומרים), לחץ על שולח....

Results

סביבת המחשוב עבור ניתוחי תמלול נוצרה ומוגדרת בפלטפורמת Docker. גישה זו מאפשרת למשתמשי לינוקס מתחילים להשתמש במערכות מסופים של לינוקס ללא ידע ניהולי קודם. פלטפורמת Docker משתמשת במשאבים של מערכת ההפעלה המארחת כדי ליצור גורם מכיל של שירות הכולל כלים של משתמשים ספציפיים (איור 1B). מכולה המבוססת על הפצת לינוקס OS Ubuntu 20.04 נוצרה והיא הוגדרה במלואה עבור ניתוחי תמלול, הנגישים באמצעות מסוף שורת הפקודה. בגורם מכיל זה, קיים מבנה תיקיות מוגדר מראש עבור ערכות נתונים וקבצי Script הנחוצים עבו.......

Discussion

הכנת ספריות הרצף היא צעד מכריע לקראת מענה על שאלות ביולוגיות בצורה הטובה ביותר. סוג התמלילים שמעניינים את המחקר ינחה איזה סוג של ספריית רצף ייבחר ויניע ניתוחים ביואינפורמטיים. לדוגמה, מתוך רצף של פתוגן ואינטראקציה מארח, על פי סוג הרצף, ניתן לזהות רצפים משניהם או רק מן התמלילים המארח.

ציוד הרצף של הדור הבא, למשל, פלטפורמת Illumina, מודד את ציוני איכות הרצף, מה שמייצג את ההסתברות שבסיס נקרא באופן שגוי. הניתוחים במורד הזרם רגישים מאוד לרצפים באיכות נמוכה ומובילים לביטוי גנים שלא נקרא כהלכה או לא .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CEMiTool	מעבדה לביולוגיה של מערכות חישוביות	1.12.2	גילוי וניתוח מודולי גנים של ביטוי משותף באופן אוטומטי לחלוטין, תוך מתן דוח HTML ידידותי למשתמש עם גרפים באיכות גבוהה.
EdgeR	Bioconductor (מתחזק: Yunshun Chen [yuchen at wehi.edu.au])	3.30.3	ניתוח ביטוי דיפרנציאלי של פרופילי ביטוי RNA-seq עם שכפול ביולוגי
EnhancedVolcano	Bioconductor (מתחזק: קווין בליגה [קווין ב-clinicalbioinformatics.co.uk])	1.6.0	עלילות הר געש מוכנות לפרסום עם צביעה ותיוג משופרים
FastQC	Babraham Bioinformatics	0.11.9	נועד לספק דרך פשוטה לבצע כמה בדיקות בקרת איכות על נתוני רצף גולמיים המגיעים מריצוף תפוקה גבוהה
FeatureCounts	החטיבה לביואינפורמטיקה, מכון וולטר ואליזה הול למחקר רפואי	2.0.0	הקצאת קריאות ריצוף ממופות לתכונות גנומיות מוגדרות
MDP	מעבדה לביולוגיה של מערכות חישוביות	1.8.0	דרגה מולקולרית של הפרעה מחשבת ציונים עבור דגימות נתוני טרנסקריפטום על סמך ההפרעה שלהן מבקרות
R	R Core Group	4.0.3	שפת תכנות וסביבת תוכנה חופשית למחשוב סטטיסטי וגרפיקה
	STAR חטיבת הביואינפורמטיקה, המכון למחקר רפואי ע"ש וולטר ואליזה הול	2.7.6a	Aligner תוכנן לתת מענה ספציפי לרבים מהאתגרים של מיפוי נתוני RNA-seq באמצעות אסטרטגיה להסביר יישורים מחוברים
Bowtie2	אוניברסיטת ג'ונס הופקינס	2.4.2	כלי מהיר במיוחד וחסכוני בזיכרון ליישור קריאות רצף לרצפי ייחוס ארוכים
Trimmomatic	THE USADEL LAB	0.39	משימות רצף מתאם חיתוך עבור נתונים מזווגים ונתונים חד-קצתיים של Illumina
קבל Docker	Docker	20.10.2	צור סביבה ביואינפורמטית הניתנת לשחזור וחיזוי (https://docs.docker.com/get-docker/)
WSL2-Kernel	Windows	NA	https://docs.microsoft.com/en-us/windows/wsl/wsl2-kernel
קבל את Docker Linux	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/
Docker Linux Repository	Docker	NA	https://docs.docker.com/engine/install/ubuntu/#install-using-the-repository
MDP אתר	המעבדה לביולוגיה של מערכות חישוביות	NA	https://mdp.sysbio.tools
Enrichr אתר	MaayanLab		NA https://maayanlab.cloud/Enrichr/
webCEMiTool	Computational Systems Biology Laboratory	NA	https://cemitool.sysbio.tools/
gProfiler	קבוצת ביואינפורמטיקה, אלגוריתמיקה וכריית נתונים	NA	https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
goseq	Bioconductor (מתחזק: מתיו יאנג [my4 ב-sanger.ac.uk])	NA	http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/goseq.html
מחקר SRA	NCBI NCBI		NA https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA507472/