מאמר שיטה

הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת

DOI:

10.3791/62334

⸱

17 בפברואר 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה למעקב לא פולשני אחר תאי T שהונדסו גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים ב- vivo עם פלטפורמה זמינה קלינית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי T מהונדסים גנטית לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הראו תוצאות חסרות תקדים בניסויים קליניים מרכזיים עבור חולים עם ממאירות תאי B או מיאלומה נפוצה (MM). עם זאת, מכשולים רבים מגבילים את היעילות ואוסרים על שימוש נרחב בטיפולים בתאי CAR T עקב סחר לקוי וחדירה לאתרי גידול, כמו גם חוסר התמדה ב- vivo. יתר על כן, רעילות מסכנת חיים, כגון תסמונת שחרור ציטוקינים או רעלנות עצבית, הם חששות עיקריים. הדמיה ומעקב יעילים ורגישים של תאי CAR T מאפשרים הערכה של סחר בתאי T, הרחבה ואפיון in vivo ומאפשרים פיתוח אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנוכחיות של טיפול בתאי CAR T. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לשילוב סימפורטר הנתרן יודיד (ש"ח) בתאי CAR T ולהדמיית תאי CAR T באמצעות [18F]טטרפלואורובוראט-פוזיטרונים טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים ([18F]TFB-PET) במודלים פרה-קליניים. ניתן ליישם את השיטות המתוארות בפרוטוקול זה על מבני CAR אחרים ועל גנים ממוקדים בנוסף לאלה המשמשים למחקר זה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR T) הוא גישה מתפתחת במהירות ופוטנציאלית מרפאת ממאירות המטולוגית1,2,2,3,4,5,6. תוצאות קליניות יוצאות דופן דווחו לאחר CD19 מכוון CAR T (CART19) או B התבגרות תאים אנטיגן (BCMA) CAR T טיפול בתאים2. זה הוביל לאישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) של תאי CART19 ללימפומה אגרסיבית של תאי B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, ו lisocabtagene maraleucel)7, לוקמיה לימפובלסטית חריפה (Tisa-Cel)5,8, לימפומה תאי מעטפת (brexucabtagene autoleuce)9, ולימפומה זקיקית (Axi-Cel)10 . לאחרונה, ה-FDA אישר טיפול בתאי CAR T בהכוונת BCMA בחולים עם מיאלומה נפוצה (MM) (idecabtagene vicleucel)11. יתר על כן, טיפול בתאי CAR T עבור לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) נמצא בפיתוח קליני בשלב מאוחר וצפוי לקבל את אישור ה-FDA בשלוש השנים הקרובות1.

למרות התוצאות חסרות התקדים של טיפול בתאי CAR T, השימוש הנרחב בו מוגבל על ידי 1) לא מספיק בהרחבת תאי vivo CAR T או סחר לקוי לאתרי גידולים, מה שמוביל לשיעורים נמוכים יותר של תגובה עמידה12,13 ו -2) התפתחות של תופעות לוואי מסכנות חיים, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)14,15 . סימני ההיכר של CRS כוללים לא רק הפעלה חיסונית וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים / כימותרפים, אלא גם התפשטות מסיבית של תאי T לאחר עירוי תאי CAR T15,16. לפיכך, פיתוח אסטרטגיה מאומתת ברמה קלינית לתמונה תאי CAR T ב vivo יאפשר 1) מעקב תאי CAR T בזמן אמת ב vivo כדי לפקח על הסחר שלהם לאתרי גידול ולחשוף מנגנונים פוטנציאליים של התנגדות, ו 2) ניטור של התרחבות תאי CAR T ופוטנציאל לחזות את הרעילות שלהם כגון התפתחות CRS.

תכונות קליניות של CRS מתון הן חום גבוה, עייפות, כאב ראש, פריחה, שלשולים, כאבי מפרקים, כאבי שרירים, וחולשה. ב CRS חמור יותר, חולים עלולים לפתח טכיקרדיה/תת לחץ דם, דליפת נימי, תפקוד לקוי של הלב, אי ספיקת כליות/כבד, קרישה תוך וסקולרית מופצת17,18. באופן כללי, מידת הגובה של ציטוקינים, כולל אינטרפרון-גמא, גרנולוציט-מקרופאג' גורם מגרה מושבה, אינטרלוקין (IL)-10, ו IL-6, הוכח בקורלציה עם חומרת הסימפטומים הקליניים17,19. עם זאת, היישום הנרחב של ניטור ציטוקינים בסרום "בזמן אמת" כדי לחזות CRS קשה בשל העלות הגבוהה והזמינות המוגבלת. כדי לנצל את המאפיינים המיטיבים של טיפול בתאי CAR T, הדמיה לא פולשנית של תאי T מאמצים יכולה להיות מנוצלת באופן פוטנציאלי כדי לחזות את היעילות, הרעילות וההישנות לאחר עירוי תא CAR T.

מספר חוקרים פיתחו אסטרטגיות לשימוש בהדמיה מבוססת רדיונוקלידים עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), המספקת רזולוציה גבוהה ורגישות גבוהה20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 עבור in vivo הדמיה וניטור של סחר בתאי CAR T. בין אסטרטגיות הדמיה מבוססות רדיונוקלידים אלה, סימפורטר הנתרן יוד (NIS) פותח כמודל רגיש לתאי תמונה ווירוסים באמצעות סריקות PET31,32. הדמיית תאים NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET היא טכנולוגיה רגישה, יעילה ונוחה להערכה ואבחון של הרחבת תאי CAR T, סחר ורעילות30. פרוטוקול זה מתאר 1) פיתוח של תאי NIS+CAR T באמצעות העברה כפולה עם יעילות גבוהה ו-2) מתודולוגיה להדמיית תאי NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה. תאי BCMA-CAR T עבור MM משמשים כמודל הוכחת קונספט לתיאור NIS ככתב להדמיית תאי CAR T. עם זאת, מתודולוגיות אלה ניתן ליישם על כל טיפול בתאי CAR T אחר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק, הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית והוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של מאיו קליניק.

1. ש"ח+ ייצור תאי BCMA-CAR T

הערה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מרפאת מאיו (IRB 17-008762) וועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC Bios00000006.04).

  1. ייצור של BCMA-CAR, ש"ח, וחלבון פלואורסצנטי ירוק לוציפראז (GFP)-קידוד lentiviruses.
    הערה: מבנה BCMA-CAR מהדור השני היה מסונתז דה נובו (ראה טבלת החומרים) ושוכפל לווקטור lentiviral דור שלישי תחת שליטתו של מקדם גורם התארכות-1 אלפא (EF-1α). מבנה BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) כלל תמחיר של 4-1BB ושבר משתנה בעל שרשרת אחת (scFv) הנגזר משיבוט נוגדני BCMA אנטי-אנושי C11D5.333,34. ה- NIS נמצא בשליטת מקדם EF-1α ונקשר לגן ההתנגדות פורומיצין באמצעות פפטידים המבקעים את עצמם (P2A). לוציפראז-GFP של קידוד וקטור lentiviral (ראה טבלת החומרים) משמש להעתקת תאי הגידול, אשר לאחר מכן מבטאים GFP ולוציפראז.
    1. הכן פלסמידים וקטוריים lentiviral: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 מיקרוגרם), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 מיקרוגרם), ו pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 מיקרוגרם).
      הערה: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro ו pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro מכילים את גן ההתנגדות פורומיצין. לכן, ש"ח- או לוציפראז-GFP-transduced תאים ניתן לבחור עם 1 מיקרוגרם / מ"ל או 2 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין דיהידרוכלוריד, כפי שתואר בעבר 14,35.
    2. זרע 20 × 106 של 293T תאים בבקבוק T175 ודגר במשך 24 שעות ב 37 °C (5% CO2). ודא שתאי 293T מופצים באופן שווה על הבקבוקון במפגש של 70-90% על ידי הדמיה ישירה מתחת למיקרוסקופ.
    3. הכינו תערובת ראשית של 15 מיקרוגרם של וקטור הביטוי (למשל, CAR, NIS, או לוציפראז-GFP DNA ליניארי), 7 מיקרוגרם של וקטור המעטפה (VSV-G) ו-18 מיקרוגרם של וקטור האריזה (gag, pol, rev ו-tat). לדלל את תערובת מאסטר DNA ב 4.5 מ"ל של מדיום transfection, ולאחר מכן להוסיף 111 μL של ריאגנט מראש מורכב (תערובת A).
    4. הכן צינור חדש, ולדלל 129 μL של ריאגנט טרנספקטיה liposomal ב 4.5 מ"ל של מדיום transfection (תערובת B).
    5. שלב תערובות A ו- B והפעל את הצינור כדי לערבב את התוכן. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. לאחר הדגירה, פשוט לשאוף את התא supernatant מבלי לנתק את התאים ולהוסיף 16 מ"ל של מדיום גדילה המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת של תערובות A ו- B על 293T תאים dropwise. לבסוף, לדגור את התאים transfected ב 37 °C (5° פרנהייט), 5% CO2 עבור 24 שעות.
    7. בימים 1 ו -2 לאחר טרנספקטוקציה, לקצור את supernatant של 293T, ספין למטה ב 900 × גרם במשך 10 דקות, ולסנן דרך מסנן ניילון 0.45 מיקרומטר. רכז את הסינון ב 24 ו 48 שעות על ידי ultracentrifugation ב 112,700 × גרם עבור 2 שעות, להקפיא ב -80 °C (80 °F).
  2. Ex-vivo בידוד תאי T (איור 1)
    הערה: בצע את כל עבודות תרביות התאים בארון זרימה למינארי באמצעות טכניקה אספטית וציוד מגן אישי. תאים חד גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) נקצרים מדם תורם מתנדב בריא שנאסף במהלך apheresis36. הקרנת פתוגן בוצעה על תאים אנושיים המשמשים במחקר זה.
    1. השתמש בטכניקת מעבר הצבע הסטנדרטית של צפיפות כדי לבודד PBMCs.
      1. הוסיפו בעדינות 15 מ"ל של מדיום הדרגתי בצפיפות (צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל) (המכילים אלפא-D-גלוקיראנוסיד, הומופולימר בטא-D-פרוקטופרנוזיל, ו-3-(אצטילאמינו)-5-(אצטילמתילמינו)-2,4,6-6-מלח מונוסודיום חומצה טריודובנזואית) לצינור הפרדה הדרגתי בצפיפות של 50 מ"ל מבלי ליצור בועות אוויר (ראו טבלת החומרים).
      2. כדי למנוע לכידת תאים, לדלל את דגימת הדם עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן כלורי, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן פוספט מונובאסיק, 8 גרם / ליטר של נתרן כלורי, ו 1.15 גרם / ליטר של נתרן פוספט דיבסיק) המכיל 2% FBS ביחס נפח 1:1. מעבירים בעדינות את הדם המדולל על גבי מדיום שיפוע הצפיפות מבלי לשבור את הממשק בין השניים. ספין למטה ב 1,200 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
        הערה: צינור הפרדה שיפוע צפיפות 50 מ"ל יכול לשמש לבידוד של 4-17 מ"ל של דגימת דם. צינור ההפרדה השיפוע של צפיפות 50 מ"ל (ראה טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה אינו דורש את "הבלם כבוי" במהלך צנטריפוגה. עם זאת, כאשר נעשה שימוש בצינורות סטנדרטיים של 50 מ"ל, הבלם צריך להיות כבוי ודורש צנטריפוגה של 30 דקות.
      3. מעבירים את supernatant לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל, לשטוף עם PBS + 2% FBS על ידי מילוי עד 50 מ"ל, ולאחר מכן לסובב למטה ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב RT.
      4. לשאוף את supernatant, ו resuspend התאים גלולה ב 50 מ"ל של PBS + 2% FBS. ספור את מספר התאים ולאחר מכן סובב כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 8 דקות ב- RT. חזור על השלב הקודם עבור סך של 2 כביסות.
    2. לשאוף את supernatant, ולהחזיר את התאים כדוריים לריכוז של 50 × 106 תאים / מ"ל עם PBS + 2% FBS.
    3. בצע בידוד תאי T ממחשבי PBMCs באמצעות ערכת חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית.
      הערה: ערכת בחירה שלילית אידיאלית כוללת חרוזים מגנטיים המחוברים לנוגדנים נגד אנטיגנים המתבטאים בתאים שאינם תאי T. ערכה נפוצה מכילה נוגדנים המחוברים לחרוזים מגנטיים כנגד CD15, CD14, CD34, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 ו- CD16 (ראה רשימת חומרים).
      1. העבר PBMCs לצינור עגול 14 מ"ל פוליסטירן עגול תחתון. לאחר מכן, מקם את המחשבים האישיים ואת קוקטייל הנוגדנים של הבחירה השלילית במפריד תאים אוטומטי לחלוטין, ובצע בידוד תאי T בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. גירוי תאי T והרחבת תאי T (איור 1)
    1. כדי לתרבות את תאי ה- T המבודדים, הכינו את מדיום הרחבת תאי T (TCM) העשויים מדיום של תאי המטופויטיקה ללא סרום בסרום ללא סרום בסרום בתוספת 10% אלבומין בסרום אנושי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין14. לאחר בידוד תאי T, ספרו את התאים והתרבית בריכוז של 2 × 106 תאים/מ"ל עם TCM.
    2. יש לשטוף חרוזים נגד CD3/CD28 שלוש פעמים עם TCM לפני הכתות עם תאי T.
      1. מערבבים את הבקבוקון המכיל את החרוזים על ידי ערבוב. לאחר מכן, פיפטה את הנפח הנדרש של חרוזים (3:1 חרוזים:תא) (למשל, כאשר מגרה 1.0 × 106 תאים של תאי T, להשתמש 3.0 × 106 של חרוזים נגד CD3 / CD28) לתוך צינור microcentrifuge סטרילי (1.5 מ"ל) ו resuspend ב 1 מ"ל של TCM.
    3. מניחים את צינור microcentrifuge עם החרוזים על מגנט במשך 1 דקות, ושאיפה את supernatant. הסר את הצינור מן המגנט, ו resuspend החרוזים שטף ב 1 מ"ל של TCM. חזור על שני השלבים הקודמים עבור סך של 3 שטיפות.
    4. resuspend החרוזים ב 1 מ"ל של TCM ולהעביר אותם לתאי T. לאחר מכן, לדלל את תאי T לריכוז סופי של 1.0 × 106 תאים / מ"ל עם TCM. מעבירים את ההשעיה של תאי T/חרוזים לצלחת 6-well שטופלו בתרבית רקמות ומניחים אותה באינקובטור (37 °C (37 °C (5% CO2).
  4. טיטרציה של lentiviruses (איור 2)
    1. הכן תאי T לבדיקת טיטרציה. ודא כי כ 1.0 x 106 תאים זמינים כדי titrate סוג אחד של וירוס.
    2. לעורר תאי T כמתואר בסעיף 1.3.2.
    3. צלחת 1.0 × 105 תאים של תאי T מגורה בצלחת של 96 בארות (צלחת טיטר) ודגרה ב-37 °C (37 °C), 5% CO2 עבור 24 שעות (איור 2A). לבודד ולעורר את תאי T כמתואר בסעיף 1.2.
    4. הכינו לוח דילול (לוחית של 96 בארות) על-ידי הוספת 100 μL של TCM לבארות העמודים המיועדים ולבארות הבקרה שלא שוגרו (איור 2B).
    5. להפשיר בקבוקון אחד של חלקיקים lentiviral על קרח בעדינות pipette למעלה ולמטה לערבב היטב. העבר 50 μL של הנגיף supernatant לתוך הבארות של עמודה 6 של צלחת 96-well (דילול 3) (איור 2B). פיפטה למעלה ולמטה לערבב היטב.
    6. בצע דילול סדרתי (דילול סדרתי פי 2): העבר 50 μL מבאר A6 לבאר B6 ולאחר מכן 50 μL מבאר B6 לבאר C6; חזור על הפעולה עד G6. לאחר מכן, הוסיפו 50 μL של הנגיף המדולל ללוחית הטיטר (איור 2B).
    7. דגרו את צלחת הטיטר ב-37 °C (5% CO2 ) ל-48 שעות, וקבעו את האחוזים של תאים חיוביים לרכב, ש"ח או GFP על ידי ציטומטריית זרימה (איור 2C).
      1. לשטוף את הבארות על ידי ספינינג למטה צלחת טיטר פעמיים ב 650 × גרם ב 4 °C (650 °F) במשך 3 דקות.
      2. להכתים את תאי T המושרה כפי שמתואר בשלבים 1.5.3 עד 1.5.9.
      3. קבעו את הטיטרים בהתבסס על האחוזים של תאים חיוביים לרכב, NIS-או GFP באמצעות נוסחה (1):
        Titers = אחוז של BCMA-CAR + או NIS + תאי T × ספירת תאי T בהתמרה × הדילול הספציפי / נפח (1)
  5. טרנסדוקציה של lentiviruses ו- NIS+הרחבת תאי BCMA-CAR T
    1. עשרים וארבע עד 48 שעות לאחר גירוי תאי T, לבצע transduction lentiviral על תאי T מגורה (תאי T צריך ליצור אשכולות).
      1. להפשיר את lentiviruses קפוא קידוד מכונית או שקלים ב 4 °C (50 °F).
      2. מערבבים היטב את תאי ה- T המעוררים כדי לפרק את האשכולות, ופשוט מוסיפים וירוס שהופשר טרי בריבוי של זיהום (MOI) של 5.0 (בעת המרת 1.0 × 106 תאי T, השתמש ב- 5.0 × 106 של lentivirons). לדגור על התאים המועברים ב 37 °C (5° פרנהייט), 5% CO2.
      3. בימים 3, 4 ו-5, ספרו את תאי ה-T המועברים באמצעות המטוציטומטר37 או מונה תאים אוטומטי לחלוטין 38 והתאמו את ריכוז התא ל-1.0 × 106 תאים/מ"ל על-ידי הוספת TCM טרי שחומם מראש. עבור תאי T המועברים על ידי NIS הנושאים את הגן התנגדות פורומיצין, לטפל בתאים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין דיהידרוכלוריד בימים 3, 4, ו -5.
    2. ביום 6, להסיר את החרוזים נגד CD3/CD28 מתאי T transduced (משלב 1.3.4) על ידי ערבוב היטב כדי לשבור את אשכולות תאי T ולהניח אותם במגנט במשך 1 דקה. לאחר מכן, פשוט למקם את תאי T transduced שנאספו בחזרה בתרבית בריכוז של 1.0 × 106 תאים / מ"ל. לאחר הסרת החרוזים מתאי T, להעריך את הביטוי של CAR ו- NIS על ידי cytometry זרימה.
      הערה: מכיוון ששבר המשתנה בעל השרשרת הבודדת של ה- BCMA-CAR נגזר מעכבר, ניתן להכתים אותו ב- IgG אנטי-עכברי עזים (H+L) המצומד עם Alexa Fluor 647. ניתן לזהות ש"ח באמצעות ETNL אנטי-אנושי [פפטיד סינתטי המתאים ל- aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL)]. נוגדן זה מזהה את טרמינוס C הציטוסולי של ש"ח. לכן, תאי T חייבים להיות חלחל לפני הדגירה עם נוגדן NIS אנטי אנושי.
    3. בצע כתמי משטח של BCMA-CAR באמצעות IgG נגד עכבר עזים (H +L).
      1. קח aliquot של התרבות (למשל, 50,000 תאי T) ולשטוף עם מאגר זרימה (PBS, 1% FBS, ו 1% נתרן אזיד). לאחר מכן, resuspend התאים עם 50 μL של מאגר זרימה, ולהכתים את התאים עם 1 μL של נוגדן נגד עכבר עזים לאיתור ביטוי CAR ו 0.3 μL של אקווה חי מת עבור לא כולל תאים מתים.
      2. דגירה במשך 15 דקות בחושך ב RT, לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 μL של מאגר זרימה, צנטריפוגה התאים ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F).
    4. לאחר פני השטח CAR כתמים, לתקן לחלחל את התאים על ידי הוספת 100 μL של מדיום קיבוע (PBS עם 4.21% פורמלדהיד) ודגרה במשך 20 דקות ב 4 °C (4 °F). לשטוף את התאים פעמיים עם 100 μL של מאגר המכיל סוכן חלחול תא כגון סאפונין (650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (650 × גרם ).
    5. resuspend התאים הקבועים/ חלחלו ב 50 μL של מאגר חדירות. לאחר מכן, להוסיף 0.3 ng של נוגדן ETNL ש"ח אנטי אנושי ב 50 μL של מאגר זרימה ודגור במשך 1 שעה ב 4 °C (4 °F).
    6. הוסף 150 μL של מאגר זרימה, וצנטריפוגה התאים ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). לדגור על התאים עם 2.5 μL של נוגדן משני אנטי ארנב ב 50 μL של מאגר זרימה במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 μL של מאגר זרימה, צנטריפוגה ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F).
    7. לבסוף, יש לנצל מחדש 200 μL של מאגר זרימה ולבצע cytometry זרימה כדי לקבוע את יעילות התמרה (איור 3A,B).
    8. ביום 8, לספור ולסובב את תאי T ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). Resuspend תאי T עם בינוני מקפיא (90% FBS + 10% דימתילסולפוקסיד [DMSO]) בריכוז של 10 × 106/mL, ולאחר מכן להעביר 1 מ"ל כל אחד קריוביאלים מסומנים.
    9. מניחים את הבקבוקונים במקפיא של -80 °C (80 °F) למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות (וביום 10), להעביר את תאי T לחנקן נוזלי.
      הערה: ראו איור 1 לסקירה כללית של ייצור תאי NIS+ CAR T. איור 3D מייצג דוגמאות להרחבת תאי ex vivo T משלושה תורמים שונים.

2. הדמיית תאי BCMA-CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה

הערה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של מאיו קליניק (IACUC A00001767-16), IRB ו- IBC (Bios00000006.04). OPM-2 הוא קו תאים BCMA + MM, המשמש לעתים קרובות כקו תא יעד עבור תאי BCMA-CAR T39,40.

  1. צור תאי לוציפראז+ BCMA+ OPM-2.
    1. זרע 500,000 תאי OPM-2 בצלחת 24-well שטופלו בתרבית רקמות. להפשיר lentivirus קידוד לוציפראז-GFP ב 4 °C (60 °F).
    2. הוסף את הנגיף שהופשר טרי ב- MOI של 3.0 לתאי OPM-2 וערבב היטב על ידי צינורות. מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C (5% CO2).
    3. ארבעים ושמונה שעות לאחר ההמרה, להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin כדי לבחור את התאים שהועברו. ארבעה ימים לאחר ההשמדה, העריכו את התאים החיוביים ל-GFP (לוציפראז-חיובי) לפי ציטומטריית זרימה (איור 3E).
  2. בססו את דגמי עכברי הקסנוגרפט BCMA+ OPM-2 (איור 4).
    1. לספור לוציפראז + OPM-2 תאים לסובב אותם למטה פעמיים כדי להסיר את כל מדיום תרבית התאים. resuspend תאי OPM-2 בריכוז של 10 × 106 תאים / מ"ל עם PBS.
    2. ביום -21, הזריקו 100 μL (1.0 × 106 תאים) של תאי לוציפראז + OPM-2 לזנבות של עכברים immunocompromised NOD-scid בן 8 עד 12 שבועות (איור 4).
    3. ביום 20 לאחר הזרקת התא OPM-2 (יום -1 של הזרקת תאי CAR T), בדוק את נטל הגידול באמצעות הדמיית ביולומינציה (BLI) (איור 4).
      הערה: תאי OPM-2 יוצרים גידול הגדל באיטיות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות כדי לחרוט.
    4. לנהל 10 μL / g של D-לוציפרין כדי OPM-2 קסנוגרפט עכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP). לאחר 10 דקות, בצעו BLI על העכברים מתחת ל-2% גז איזופלוריין (איור 5A). לאחר אישור תחריט הגידול, אקראי העכברים על פי נטל הגידול.
    5. ביום -1 של הזרקת תא CAR T, להפשיר NIS + BCMA-CAR T תאים, ולהסיר את המדיום המקפיא על ידי צנטריפוגה (300 × גרם, 8 דקות, 4 °C (500 °F). לאחר מכן, התאים resuspend עם TCM ב 2.0 × 106 תאים / מ"ל ודגר לילה (37 °C (37 °C (5% CO2).
    6. ביום 0, לספור ולצנטריפוגה את התאים NIS + BCMA-CAR T (300 × גרם, 8 דקות, 4 °C (50 °F). התקן מחדש את תאי NIS+BCMA-CAR T ב-50 × 106 תאים/מ"ל עם PBS.
    7. לנהל 100 μL (5.0 × 106 תאים) של NIS + BCMA-CAR T תאים באמצעות הזרקת וריד הזנב לעכברי OPM-2 קסנוגרפט. בימים 7 ו -15, דמיינו את העכברים באמצעות סריקת PET.
  3. NIS + BCMA-CAR T תא בהדמיית ויוו באמצעות דגם עכבר קסנוגרפט BCMA + OPM-2.
    1. שקול את העכברים לפני ההדמיה, ולהסיר כל תגי אוזן מתכת כדי לחסל חפצים הקשורים למתכת.
    2. הכן [18F]TFB כפי שתואר בעבר41.
      הערה: [18F]TFB חייב להיות מיוצר ביום השימוש בו. טוהר רדיוכימי צריך להיות >99% ופעילות טוחנת >5 GBq / mmol.
    3. הזרקו 9.25 MBq [18F]TFB דרך הווריד באמצעות הזרקת וריד הזנב. אפשר תקופת ספיגה של ~ 40 דקות עבור radiotracer להיות מופץ בגוף ולנקות את הדם.
    4. להרדים את העכבר באמצעות שאיפת איזופלוריין (2%).
      הערה: Isoflurane הוא הרדמה בשאיפה המועדפת כפי שיש לו התפרצות מהירה ואמינה והתאוששות.
    5. לפני המרדים את העכבר, לנקות את כל המשטחים של מכונת ההרדמה עם חומרי חיטוי.
    6. מקם את העכבר בתוך תא האינדוקציה. הפוך את לוח המחוגים לאידוי ל-2% והמתן שהעכבר יהפוך למחלים ולא מגיב תוך 1-2 דקות.
    7. לפקח על העכבר כדי למנוע הרדמה לא מספקת או דיכאון מוגזם של תפקודים נשימתיים. בקצרה, לצבוט בוהן כדי לאשר את ההרדמה לא מספקת.
      הערה: קצב הנשימה הרגיל הוא עד 180/דקה, ושיעור הירידה המקובל הוא 50%.
    8. החל משחה עיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית וטראומה.
    9. רכשו תמונות PET/CT 45 דקות לאחר ההזרקה עם העכבר המרדים בתחנת עבודה להדמיית MICRO PET/CT (ראו טבלת החומרים). לאחר מכן, לרכוש תמונות PET סטטיות במשך 15 דקות ואחריו רכישת תמונת CT במשך 5 דקות עם סיבוב 360° ו 180 תחזיות ב 500 μA, 80 keV, ו 200 ms חשיפה.
  4. ניתוח נתוני הדמיה שנרכשו
    1. נתח את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה PET (איור 5B ווידאו S1 משלים).
    2. הגדר את נפח העניין (VOI).
    3. חשב את ערך הספיגה המתוקנן (SUV) באמצעות נוסחה (2).
      SUV ב VOI = ריכוז הפעילות ב- VOI (MBq/mL) × משקל גוף (g) / מינון מנוהל (MBq) (2)
  5. אישור על סחר בתאי NIS+BCMA-CAR T לאתרי הגידול עם ציטומטריית הזרימה
    1. לאחר הדמיית [18F]TFB-PET, הנח את העכבר בחזרה לכלוב. לאחר הפסקת ההרדמה, לעקוב אחר בעלי החיים עד שהם מסוגלים תנועה תכליתית ולוודא שיש להם גישה למזון ומים.
    2. נטר את העכברים עד לריקבון של [18F]TFB המוזרק. ברגע שהרדיוזוטופ אינו ניתן לזיהוי, הרדים את העכברים עם CO2.
    3. כדי להרדים, למקם את העכברים לתוך הכלוב (לא יותר מ 5 עכברים לכלוב).
    4. לחשוף את העכברים CO2 עד להפסקה מלאה של נשימה בכ 5-10 דקות.
      הערה: שיטת המתת חסד זו חייבת להיות עקבית עם הנחיות AVMA למתת חסד של בעלי חיים (מהדורת 2020).
    5. כדי להבטיח את מותם של העכברים, לבצע נקע צוואר הרחם על ידי אחיזה בחלק האחורי של הראש ואת הבסיס של הזנב של החיה, ולאחר מכן מושך את הידיים לגזרים / הרחק אחד מהשני.
    6. לקצור את מוח העצם כדי לאשר כי NIS + BCMA-CAR T תאים ביעילות תנועה לאתר הגידול.
    7. מעבירים את עצם הירך והשוקה שנקטפו לצלחת של 6 בארות המכילה 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים. הסר את השרירים והגידים מן הירך ואת השוקה, ופשוט לחתוך את שני הקצוות (מעל המפרקים) של עצמות הירך והשוקה.
    8. מלאו מזרק אינסולין במדיום תרבית התאים, ושטפו את מח העצם לצלחת של 6 בארות. עבור עצם הירך, להשתמש 22 G מחטים ומזרקים 5 מ"ל כי קוטר עצם הירך גדול יותר מזה של השוקה.
    9. השתמש בקצה השטוח של הבוכנה כדי לטחון את מוח העצם. מניחים מסננת תאים 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל, ומסננים את מח העצם הקרקעי. לאחר מכן, למלא את הצינור עם מאגר הזרימה, צנטריפוגה הצינור ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F).
    10. לשאוף את supernatant, ו resuspened מח העצם עם 5 מ"ל של חיץ זרימה. מעבירים 200 מיקרומטר של מח עצם לצלחת של 96 בארות. צנטריפוגה הצלחת ב 300 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). Decant supernatant, ו resuspend התאים עם 50 μL של מאגר זרימה.
    11. להכתים את מוח העצם עם נוגדני זרימה נגד 0.25 מיקרוגרם של CD45 עכבר, 0.03 מיקרוגרם של CD45 אנושי, 0.06 מיקרוגרם של CD3 אנושי, 0.24 מיקרוגרם של BCMA אנושי, ו 0.3 μL של אקווה חי / מת. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    12. צנטריפוגה הצלחת ב 300 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). לאחר מכן, הוסיפו 200 μL של מאגר זרימה, ופעלו על ציטומטר הזרימה (איור 5C).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1 מייצג את השלבים של יצירת תאי NIS+BCMA-CAR T. ביום 0, בודדו את מחשבי ה-PBMCs ולאחר מכן בודדו תאי T לפי בחירה שלילית. לאחר מכן, לעורר תאי T עם חרוזי אנטי CD3 / CD28. ביום הראשון, יש להעביר תאי T עם lentiviruses NIS ו- BCMA-CAR. בימים 3, 4 ו- 5, לספור תאי T ולהאכיל עם מדיה כדי להתאים את הריכוז להיות 1.0 × 106/mL. עבור תאי T המועברים על ידי NIS, יש להוסיף 1 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין כדי לבחור תאים NIS+ . ביום 6, להסיר את החרוזים על ידי הצבת התאים במגנט במש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לשילוב ש"ח בתאי CAR T והדמיה חדורה לתאי CAR T ב-vivo באמצעות [18F]TFB-PET. כהוכחת קונספט, תאי NIS+BCMA-CAR T נוצרו באמצעות טרנסדוקציה כפולה. לאחרונה דיווחנו כי שילוב ש"ח בתאי CAR T אינו פוגע בתפקודי תאי CAR T וביעילותו ב-vivo ומאפשר סחר והרחבה של תאי CAR T30. כמו טיפולים בתאי CAR T ממשיכים להתרחב מעבר הממאירות הנוכחית של תאי B ליישומים ב- CLL, יהיה צורך גדול יותר בכלים המאפשרים הדמיה וניטור לא פולשניים של vivo הדמיה וניטור של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK היא ממציאה של פטנטים באימונותרפיה לרכב המורשים לנוברטיס (באמצעות הסכם בין מאיו קליניק, אוניברסיטת פנסילבניה ונוברטיס) ומטפורג ' (באמצעות מרפאת מאיו). RS, MJC ו- SSK הם ממציאים על פטנטים בתחום האימונותרפיה של CAR המורשים להומניגן. SSK מקבלת מימון מחקרי מעפיפון, גלעד, ג'ונו, Celgene, נוברטיס, Humanigen, MorphoSys, טולרו, Sunesis, Leahlabs ו- Lentigen. דמויות נוצרו עם BioRender.com.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות צינור K2R של מאיו קליניק (SSK), מרכז מרפאת מאיו לרפואה אישית (SSK) וקרן פרדילין (RS). איורים 1, 2 ו- 4 נוצרו עם BioRender.com.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 22 מדCovidien8881250206
28 מד מזרק אינסוליןBD329461
96 באר צלחתקורנינג3595
אנטי אנושי (ETNL) NISImanisREA009נוגדן ETNL קושר את מסוף C הציטוזולי של NIS
Anti-human BCMA, שיבוט 19F2, PE-Cy7BioLegend357507נוגדן זרימה
אנטי אנושי CD45, שיבוט HI30, BV421BioLegend304032נוגדן זרימה
נגד עכבר CD45, שיבוט 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116נוגדן זרימה
נגד ארנב IgGR& DF0110נוגדן משני למבנה BCMA-CAR מכתים NIS
, דור שניIDT, Coralville, IA
BD  ערכת תמיסת קיבוע/פרמביליזציה של ציטופיקס/ציטופרםBD554714
CD3 נוגדן חד-שבטי (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (מערכות טיפול בתאים) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5בקמן קולטרC04652ציטומטר זרימה
דימתיל סולפוקסידMillipore SigmaD2650-100 מ"ל
מזרקים חד פעמיים עם קצות לואר-לוקBD309646
D-לוציפרין, אשלגן מלחזהב ביוטכנולוגיהLUCK-1G
D-PBS (מי מלח חוצץ פוספט של Dulbecco)Gibco14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt SaltGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (רכז חלקיקים מגנטי)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית; 17951RF כולל טיפים ו מאגר
סרום בקר עובריMillipore SigmaF8067
עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג צולב, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multi Modality PET/CT סורקSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
נוזל איזופלורןPiramal טיפול קריטי66794-017-10
IVIS Lumina S5 מערכת הדמיהPerkinElmerCLS148588
IVIS® מערכת הדמיה ספקטרום In VivoPerkinElmer 
Lipofectamine 3000 Transfection ReagentInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים לתיקון, לעירור 405 ננומטרInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Nalgene Rapid-Flow 500 מ"ל מסנן ואקום, 0.22 uM, סטריליThermo Scientific450-0020
מסנן ואקום Nalgene Rapid-Flow 500 מ"ל, 0.45 uM, סטריליThermo Scientific450-0045
NOD. Cg-Prkdcscid  מעבדת Il2rgtm1Wjl/SzJג'קסון05557
OPM-2DSMZCRL-3273קו תאי מיאלומה נפוצה
pBMN (CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389וקטור לנטי-ויראלי המקודד לוציפראז-GFP
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100x), נוזליGibco10378-016
תוכנת PMODPMODPBAS ו- P3D
מאגר אנושי AB סרום פלזמה נגזרמחקר חדשניIPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin DihydrochlorideMP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000מפריד תאים אוטומטי לחלוטין
RPMI (מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) 1640 בינוני)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450צינורות הפרדת שיפוע צפיפות
נתרן אזיד, 5% (w/v)Ricca Chemical7144.8-16
T175 בקבוקקורנינג353112
טרל (איזופלורן, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 ללא סרום תאים המטופויאטיים בינוניLonza04-418Q
1242620210055210

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973(2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064(2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629(2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209(2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Car TPet CtSodium Iodide SymporterTTT

מאמרים קשורים