הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים

3.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62348

⸱

20 במרץ 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Emory University, 2Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לשימוש בבדיקות מתח מבוססות דנ"א כדי לדמות את כוחות הקולטן המופעלים על ידי תאי מערכת החיסון. גישה זו יכולה למפות כוחות קולטן >4.7pN בזמן אמת ויכולה לשלב כוחות לאורך זמן.

תקציר

כוחות מכניים המועברים בצומת שבין שני תאים שכנים ובצומת שבין התאים לבין המטריצה החוץ תאית הם קריטיים לוויסות תהליכים רבים, החל מהתפתחות ועד אימונולוגיה. לכן, פיתוח הכלים לחקר כוחות אלה בקנה מידה מולקולרי הוא קריטי. הקבוצה שלנו פיתחה חבילה של חיישני מתח מולקולרי כדי לכמת ולדמיין את הכוחות הנוצרים על ידי תאים ומועברים לליגנדות ספציפיות. הקבוצה הרגישה ביותר של חיישני מתח מולקולרי מורכבת מסיכות שיער של חומצת גרעין. חיישנים אלה משתמשים בזוגות פלואורופור-מרווה כדי לדווח על הארכה מכנית ופתיחה של סיכות שיער DNA תחת כוח. אחד האתגרים עם חיישני מתח של סיכות שיער DNA הוא שהם הפיכים עם קיפול מהיר של סיכת שיער עם סיום המתח ולכן קשה לתעד כוחות חולפים. במאמר זה נתאר את הפרוטוקולים להכנת חיישני מתח דנ"א שניתן "לנעול" ולמנוע קיפול מחדש כדי לאפשר "אחסון" של מידע מכני. זה מאפשר הקלטה של כוחות פיקוניוטון חולפים מאוד, אשר ניתן לאחר מכן "למחוק" על ידי תוספת של חומצות גרעין משלימות להסיר את המנעול. יכולת זו לעבור בין מיפוי מתח בזמן אמת לבין אחסון מידע מכני חושפת כוחות חלשים, קצרי מועד ופחות שופעים, המשמשים בדרך כלל תאי T כחלק מתפקודי מערכת החיסון שלהם.

מבוא

תאי מערכת החיסון מתגוננים מפני פתוגנים ותאים סרטניים על ידי זחילה וסריקה מתמדת של פני השטח של תאי המטרה לאיתור אנטיגנים, תוך שהם חוצבים את פני השטח שלהם 1,2. זיהוי אנטיגן מתחיל עם קשירה בין קולטן תאי T (TCR) לבין קומפלקס היסטותאימות פפטידי-מרכזי MHC (pMHC) המתבטא על פני השטח של תאי המטרה. מכיוון שזיהוי TCR-pMHC מתרחש בצומת בין שני תאים ניידים, הוא נחשד זה מכבר כבעל כוחות מכניים. יתר על כן, זה הוביל למודל mechanosensor של הפעלת TCR, אשר מציע כי כוחות TCR לתרום לתפקוד שלה 3,4. כדי להבין מתי, היכן וכיצד כוחות מכניים תורמים לתפקוד תאי T, הכרחי לפתח כלים להמחשת הכוחות המולקולריים המועברים על ידי תאי T. באופן מסורתי, שיטות כגון מיקרוסקופ כוח משיכה (TFM) ומערכי מיקרו-עמודים משמשים לחקר כוחות תאיים 5,6. עם זאת, רגישות הכוח של TFM ומערכי מיקרו-עמודים היא בקנה מידה של ננוניוטון (nN) ולכן לעתים קרובות אינה מספיקה כדי לחקור את כוחות הפיקוניוטון המולקולרי (pN) המועברים על ידי קולטני התא7. כדי לשפר את הכוח ואת הרזולוציה המרחבית לגילוי, המעבדה שלנו הייתה חלוצה בפיתוח של בדיקות מתח מולקולרי, אשר סונתזו בתחילה באמצעות פולימרים פוליאתילן גליקול (PEG)7. גשושיות מתח מולקולרי מורכבות מ"קפיץ" מולקולרי ניתן להארכה (PEG, חלבון, DNA) שמשני צדדיו פלואורופור ומרווה ומעוגנות על משטח. כוחות המופעלים על קצה הגשושית מובילים להתרחבותה, מפרידים בין הפלואורופור למרווה, וכך יוצרים אות פלואורסצנטי חזק (איור 1A)8,9,10.

במהלך העשור האחרון פיתחנו ספרייה של סוגים שונים של גשושיות מתח מולקולרי עם יסודות קפיציים העשויים מחומצות גרעין11, חלבונים10 ופולימרים8. מבין אלה, בדיקות המתח מבוססות ה- DNA מספקות את יחס האות לרעש הגבוה ביותר ואת רגישות הכוח הגדולה ביותר, אשר מכווננת בקלות מכמה pN עד ~ 20 pN11. השתמשנו בבדיקות מתח דנ"א בזמן אמת כדי לחקור את הכוחות המולקולריים הנוצרים על-ידי סוגי תאים רבים ומגוונים, כולל פיברובלסטים, תאים סרטניים, טסיות דם ותאי מערכת החיסון11,12,13. כתב יד זה יתאר פרוטוקולים לסנתז ולהרכיב גשושיות מתח DNA על משטח כדי למפות כוחות קולטן מולקולרי ברזולוציית כוח pN באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. בעוד שההליך הנוכחי כולל שינויים כימיים בחומצת הגרעין כדי להציג את כתב הפלואורסצנט (איור 1B), חשוב לציין שרבים משלבי השינוי והטיהור יכולים להיות במיקור חוץ לחברות סינתזת דנ"א מותאמות אישית. לכן, טכנולוגיית בדיקות מתח הדנ"א היא קלה, ונגישה לקהילות רחבות יותר של ביולוגיה של התא ומכנוביולוגיה.

בקצרה, כדי להרכיב חיישני מתח דנ"א, סיכת ראש של דנ"א עוברת הכלאה לגדיל ליגנד פלואורסצנטי על זרוע אחת וגדיל עוגן מרווה על הזרוע השנייה, ואז משותקת על מצע זכוכית (איור 1C, מתח בזמן אמת). בהיעדר כוח מכני, סיכת הראש סגורה, וכך הפלואורסצנטיות מרווה. עם זאת, כאשר הכוח המכני המופעל גדול מה-F1/2 (הכוח בשיווי משקל שמוביל להסתברות של 50% להתגלות), סיכת הראש נמסה מכנית, ונוצר אות פלואורסצנטי.

בהתבסס על חיישן מתח דנ"א בזמן אמת, אנו גם מתארים פרוטוקולים למיפוי כוחות מצטברים, דבר שימושי במיוחד לחקר אינטראקציות בין קולטנים על תאי מערכת החיסון לבין הליגנד הטבעי שלהם. הסיבה לכך היא שקולטנים חיסוניים מציגים לעתים קרובות קשרים קצרי מועד 3,14. הכוחות המצטברים מצולמים באמצעות גדיל "נעילה" שנקשר באופן מועדף לסיכות ראש פתוחות של דנ"א ומאפשר אחסון של אותות פלואורסצנטיים הקשורים לאירועי משיכה מכניים (איור 1C, מתח נעול). גדיל הנעילה נועד לקשור אתר קשירה מסתורי שנחשף עם התכה מכנית של סיכת הראש ולנעול את סיכת השיער במצב פתוח על ידי חסימת קיפול מחדש של סיכת השיער, ובכך לאחסן את אות המתח, וליצור מפת מתח מצטברת. יתר על כן, גדיל הנעילה מתוכנן עם אחיזת אצבע בעלת שמונה נוקלאוטידים, המאפשרת תגובת תזוזה של גדיל בתיווך הבוהן עם המשלים המלא שלו, גדיל ה"נעילה". עם הוספת גדיל הנעילה, גדיל הנעילה הכבול מוסר ממבנה סיכת השיער, מוחק את אות המתח המאוחסן ומאפס את סיכת הראש בחזרה למצב בזמן אמת.

figure-introduction-1
איור 1: סכמה של גשושיות המתח המולקולרי החדישות. (A) תכנון כללי של גשושית מתח מולקולרית בזמן אמת, (B) גדילים למבנה גשושית מתח מבוססת DNA, ו-(C) גשושיות מתח מהונדסות-מבוססות DNA והמעבר שלהן בין מצב בזמן אמת למצב נעול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הפרוטוקול העיקרי מורכב מארבעה חלקים עיקריים - הכנת אוליגונוקלאוטידים, הכנת פני שטח, הדמיה וניתוח נתונים. פרוטוקול זה הודגם בהצלחה על ידי המעבדה שלנו ואחרים בתאי T נאיביים ומופעלים OT-1 CD8+, תאי OT-II CD4+, כמו גם היברידיות, וניתן ליישם אותו כדי לחקור קולטנים שונים של תאי מערכת החיסון, כולל קולטן תאי T, קולטן מוות תאי מתוכנת (PD1) וכוחות אנטיגן 1 הקשורים לתפקוד לימפוציטים (LFA-1). תאי T נאיביים OT-1 CD8+ משמשים כקו תאים לדוגמה במאמר זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

העכברים הטרנסגניים OT-1 שוכנים במתקן המחלקה למשאבי בעלי חיים באוניברסיטת אמורי. כל הניסויים אושרו ובוצעו תחת פרוטוקול הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הכנת אוליגונוקלאוטיד

  1. להמיס את הדנ"א של גדיל הליגנד במים (התנגדות של 18.2 MΩ, בשימוש לאורך כל הפרוטוקול). מערבלים ומסובבים את התמיסה עם צנטריפוגה שולחנית. כוונן את נפח המים כך שהריכוז הסופי הוא 1 mM. לאמת את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפות כדי למדוד את הבליעה ב 260 ננומטר ולקבוע את הריכוז הסופי בהתבסס על מקדם ההכחדה של האוליגונוקלאוטידים.
    הערה: לגדיל הליגנד יש שינוי בכל טרמינוס, 5' אמין ו-3' ביוטין, כדי להצמיד את הפלואורופור ולהציג את הליגנד הביוטינילציה. קבוצת האמין בגדיל הליגנד צריכה להיות מצומדת עם פלואורופור. צבע Cy3B משמש לצמידות זו בשל בהירותו הגבוהה ויציבות האור, אך הוא אינו מוצע בדרך כלל באופן מסחרי ודורש צימוד פנימי. בהתאם לכך, החלק הבא מתאר את הצמידות בין אמינים לצבעי אסטר של NHS. עבור משתמשי קצה שאין להם גישה למתקנים או משאבים לשינוי חומצות גרעין, ניתן לרכוש במקום זאת חומצות גרעין שעברו שינוי מספקי סינתזת DNA מותאמים אישית המציעים צבעים בהירים וניתנים לצילום, כגון משפחת הצבעים Alexa ו-Atto.
  2. הכן פתרונות 10x PBS ו- 1 M NaHCO3 . יש לערבב 10 μL של תמיסת גדיל ליגנד אמין 1 mM (10 nmol) עם 10 μL של 10x PBS, 10 μL של 1 M NaHCO3 ו-60 μL של H2O. יש להמיס 50 מיקרוגרם של אסטר Cy3B NHS ב-10 μL של DMSO מיד לפני השימוש ולהוסיף לתערובת לקבלת נפח תגובה כולל של 100 μL. הוסף את Cy3B NHS ester אחרון. יש לאפשר להגיב בטמפרטורת החדר למשך שעה או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. הכינו את גדיל הנעילה Atto647N על ידי הצמדת גדיל נעילת האמין עם אסטר Atto647N NHS. הכן פתרון 10x PBS ו- 1 M NaHCO3 . יש לערבב 10 μL של תמיסת גדיל נעילת אמין 1 mM (10 nmol) עם 10 μL של 10x PBS, 10 μL של 1 M NaHCO3 ו-60 μL של H2O. יש להמיס 50 מיקרוגרם של Atto647N NHS ester ב-10 μL של DMSO מיד לפני השימוש ולהוסיף לתערובת לקבלת נפח תגובה כולל של 100 μL. הוסף Atto647N NHS ester אחרון. יש לאפשר להגיב בטמפרטורת החדר למשך שעה או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  4. לאחר התגובות, הסירו תוצרי לוואי, עודפי צבע ומלחים על ידי סינון ג'ל התפלה P2. לדלל את תערובת התגובה עם H2O לנפח כולל של 300 μL, אשר מתאים לשלב הטיהור HPLC הבא. הוסף 650 μL של ג'ל P2 לח להתקן צנטריפוגלי וסחרור כלפי מטה ב 18,000 x גרם במשך דקה אחת. הסר את הנוזל בתחתית המכשיר, הוסף את תערובת התגובה לעמודה המכילה ג'ל P2, סובב כלפי מטה ב- 18,000 x גרם למשך דקה אחת ואסוף את תערובת התגובה בתחתית המכשיר.
    הערה: ג'ל P2 צריך להיות hydrated לפחות 4 שעות לפני השימוש עם H2O.
  5. לטהר את תערובת התגובה המותפלת עם HPLC באמצעות עמודת C18 המיועדת לטיהור אוליגונוקלאוטידים, עם ממס A: 0.1 M TEAA ב- H2O ו- B: ACN כשלב הנייד לפליטת שיפוע ליניארי 10-100% B במשך 50 דקות בקצב זרימה של 0.5 מ"ל/דקה. הזריקו את תערובת התגובה המותפלת ב-HPLC בפאזה הפוכה עם לולאת הזרקה של 500 μL לטיהור. אספו את המוצר שיש לו שיא ספיגה עבור הדנ"א (260 ננומטר) ושיא ספיגה עבור הפלואורופור (560 ננומטר עבור Cy3B ו-647 ננומטר עבור Atto647N) וייבשו אותם ברכז ואקום צנטריפוגלי למשך הלילה (ראו איור 2A).
  6. הרכיבו מחדש את מוצר צבע האוליגו המיובש ב-100 מיקרוליטר מים. קבע את הריכוז של גדיל ליגנד Cy3B וגדיל נעילה Atto647N באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפות. ודא שיחס סימון הצבע קרוב ל-1:1. נכון לספיגה של 260 ננומטר של הצבע במידת הצורך בעת קביעת ריכוז האוליגונוקלאוטידים.
  7. יש לאמת את המוצר המטוהר עם MALDI-TOF-MS באמצעות 3-HPA כמצע ב-50% ACN/H2O עם 0.1% TFA ו-5 מ"ג/מ"ל אמוניום ציטראט באמצעות 0.5 μL של המוצר ב-1-5 מיקרומטר להכנת דגימת MALDI-TOF-MS. דוגמה לספקטרום מסות ניתן למצוא באיור 2B.
  8. ממיסים את גדיל סיכת הראש ואת גדיל העוגן המרווה במים ומוודאים שריכוז תמיסות הציר הוא בין 50 ל-100 מיקרומטר.
    הערה: גדיל סיכת השיער אינו שונה וניתן לסנתז אותו ישירות מספק. גדיל העוגן כולל קבוצת עיגון תיול ומרווה BHQ2 וניתן לסנתז אותו ישירות מספק.
  9. Aliquot כל האוליגונוקלאוטידים. לשימוש ואחסון לטווח קצר, אחסנו אוליגונוקלאוטידים אלה בטמפרטורה של 4°C. לאחסון לטווח ארוך, יש להקפיא ולשמור אותם בטמפרטורה של -20°C. בשלב זה, כל האוליגונוקלאוטידים מוכנים להרכבת בדיקת מתח הדנ"א.
    הערה: מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים אינם בעייתיים עבור אוליגונוקלאוטידים.

2. הכנת פני השטח

הערה: הכנת מצעי בדיקת מתח סיכת שיער DNA אורכת יומיים. בדיקת המתח של סיכת השיער DNA תתפקד על כיסויי זכוכית.

  1. יום 1
    1. הניחו את הכיסויים בקוטר 25 מ"מ על מדף פוליטטרה-פלואוראתילן בכד של 50 מ"ל. כל מדף יכול להכיל עד 8 כיסויים. שטפו את הכיסויים על ידי טבילה במים שלוש פעמים.
    2. הוסיפו 40 מ"ל של תמיסת אתנול מעורבבת עם מים ביחס של 1:1 (v:v) לכד המכיל את המתלה והכיסויים, ואטמו את הכד באמצעות סרט פרפין.
    3. סוניק את הכד למשך 15 דקות בשואב אולטרסאונד (תדר הפעלה 35 קילוהרץ) כדי לנקות את הכיסויים. לאחר הסוניקציה, יש להשליך את הנוזל ולשטוף את הכד עם המתלה ולכסות בו במים לפחות 6 פעמים כדי להסיר את שאריות הממס האורגני.
    4. הכינו תמיסת פיראנה טרייה על ידי ערבוב חומצה גופרתית ומי חמצן ביחס של 3:1. כדי להפוך 40 מ"ל של פתרון פיראנה, להוסיף 30 מ"ל של חומצה גופרתית נקי 50 מ"ל הראשון ולאחר מכן לאט להוסיף 10 מ"ל של H 2 O2. תמיסת פיראנה תתחמם ותבעבע במהירות עם הוספת H 2O2. מערבבים בעדינות את הפיראנה בעזרת קצה פיפטה מזכוכית.
    5. לאחר מכן, העבירו את המתלה שמחזיק את הכיסויים לכוס המכילה תמיסת פיראנה מעורבת בעדינות לחריטה (איור 3A). תנו לתמיסת פיראנה לעבור הידרוקסילאט ונקו את הכיסויים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חריטת פיראנה, מעבירים את המדף באמצעות פינצטה מפלדה או פוליטטרה-פלואוראתילן לכוס נקייה של 50 מ"ל במים ושוטפים שוב במים לפחות 6 פעמים.
      זהירות: כמויות גדולות של חומרים אורגניים עלולות להגיב במרץ עם תמיסת פיראנה ועלולות לגרום לפיצוץ. היזהר ותמיד עבוד עם פתרון פיראנה במכסה אדים. הקפידו ללבוש מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי מגן. לעולם אל תאחסנו תמיסת פיראנה טרייה בכלי אטום.
      הערה: יחס מי חמצן לחומצה גופרתית צריך להישמר מתחת ל-1:2 (v:v) ולעולם לא יעלה על 1:1. כאשר שוקעים את המדף עם כיסויים בתמיסת פיראנה, מניחים אותם בתמיסה לאט ובזהירות. אין להשליך את התמיסה מיד לאחר התחריט, מכיוון שהיא עדיין פעילה וחמה. השאירו אותו בכוס למשך הלילה לפני ששפכו אותו למיכל פסולת החומצה.
    6. טבלו את המתלה המחזיק את הכיסויים בכוס 50 מ"ל עם אתנול 40 מ"ל כדי להסיר מים. השליכו את האתנול וחזרו על הפעולה 3 פעמים כדי לוודא שהמים הוסרו.
    7. לאחר מכן טבלו את המדף ב-3% אמינופרופיל טריאתוקסי סילאן (APTES) (v/v) ב-40 מ"ל אתנול כדי להגיב עם ה-OH על החלקות במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 3B).
      הערה: אתנול יכול להיות מוחלף על ידי אצטון.
    8. יש לשטוף את המשטחים 6 פעמים על ידי טבילתם באתנול במינון 40 מ"ל, ולאחר מכן לייבש בתנור בטמפרטורה של 80°C למשך 20 דקות. לאחר הקירור, אחסנו את הכיסויים המיובשים שעברו שינוי אמין בטמפרטורה של -20°C לשימוש עתידי (עד 6 חודשים).
    9. מכסים את הצד הפנימי התחתון של צלחות פטרי פלסטיק בקוטר 10 ס"מ בסרט פרפין. סרט הפרפין מונע מהכיסויים להחליק בתוך צלחת הפטרי ומסייע לשמור על התמיסה לשלבים הבאים של התפקוד להישאר על הכיסויים. הניחו את כיסויי האמין המקוררים בצלחות הפטרי. הצד שצריך להיות פונקציונלי צריך להיות עם הפנים כלפי מעלה.
    10. כדי לשנות את קבוצות האמינים על תלושי הכיסוי, הוסיפו 300 μL של 0.5% w/v חומצה ליפואית PEG NHS (LA-PEG-SC) ו-2.5% w/v mPEG NHS (mPEG-SC) ב-0.1 M NaHCO3 על כל כיסוי, ודגרו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (איור 3C). עבור כל כיסוי בקוטר 25 מ"מ, יש לשקול 1.5 מ"ג LA-PEG-SC ו-7.5 מ"ג mPEG-SC. להמיס את ריאגנטים NHS מיד לפני הוספת המשטחים, כפי שיש להם מחצית חיים קצרה (~ 10 דקות) בתמיסה מימית בטמפרטורת החדר. לאחר התגובה, יש לשטוף את המשטחים 3 פעמים במים.
      הערה: תגובת NHS יכולה להתבצע ב 4 °C בן לילה. ריאגנטים NHS יש מחצית חיים ארוכה יותר לפני הידרוליזה ב 4 ° C, אשר סביב 4-6 שעות. התוצאה תהיה הליך הכנת משטח של שלושה ימים.
    11. הוסף 100 μL של 0.1 M NaHCO3 המכיל 1 מ"ג / מ"ל של אצטט sulfo-NHS לקבוצה של כיסויי "סנדוויץ'" (שני כיסויים הפונים זה כלפי זה עם חיץ תגובה ביניהם). אפשר לפסיבציה להתרחש במשך 30 דקות לפחות. כדי לשמור מגיב, שלב זה יכול להיעשות עם 50 μL של 1 מ"ג / מ"ל sulfo-NHS אצטט. יש לשטוף במים שלוש פעמים לאחר פסיבציה.
    12. הוסיפו 0.5 מ"ל של ננו-חלקיקי זהב (AuNP, 8.8 ננומטר, חומצה טאנית, 0.05 מ"ג/מ"ל) לכל כיסוי ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 3D). כדי להציל את המגיב, שלב זה יכול להיעשות על ידי סנדוויץ' שני כיסויים גם כן. ודא שאין מלחים במערכת מהשלבים הקודמים כדי למנוע הצטברות של ננו-חלקיקי זהב. אין להשאיר את הכיסויים להתייבש לאחר שלב זה.
    13. בינתיים, טרום הכלאה של סיכת ראש 4.7 pN, גדיל ליגנד Cy3B וגדיל עוגן BHQ2 היוצרים את גשושיות מתח הדנ"א בונות ביחס של 1.1:1:1 ב-1 M NaCl ב-300 ננומטר בצינור PCR. אנאל את הגדילים על ידי חימום התמיסה עד 95 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן בהדרגה לקרר על ידי הפחתת הטמפרטורה ל 20 ° C במשך 30 דקות במחזור תרמי.
    14. שטפו את הכיסויים במים שלוש פעמים לאחר 30 דקות דגירה עם ננו-חלקיקי זהב. הוסף גדיל עוגן BHQ2 נוסף (ממלאי של 100 מיקרומטר) לתמיסת ה- DNA המחושלת כדי להפוך את היחס בין גדיל העוגן BHQ2 לגדיל ליגנד Cy3B ל- 10:1. בשלב זה, תמיסת הדנ"א צריכה להכיל 300 ננומטר של מבנה בדיקת מתח וגדיל BHQ2 של 2.7 מיקרומטר. הוסיפו 100 מיקרוליטר לכל שני כיסויים כדי ליצור את ה"כריך" (איור 3E).
    15. מניחים בזהירות כדור רקמת מעבדה רטוב בצלחת הפטרי (הרחק מכיסויים) ואוטמים את הכלי בסרט פרפין כדי למנוע מהתמיסה להתייבש. מכסים את התבשיל בנייר כסף ודגרים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. יום 2
    1. שטפו את הבדיקות העודפות מהכיסויים עם 1x PBS. בדוק את איכות פני השטח של בדיקת מתח DNA תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
    2. הכינו 40 מק"ג/מ"ל של סטרפטאווידין ב-PBS 1x ודגרו על כיסויים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 3F). בדרך כלל, 100 μL מספיק עבור כיסוי 25 מ"מ. יש לשטוף עם PBS 3 פעמים לאחר הדגירה כדי לשטוף את הכמות העודפת של סטרפטווידין.
    3. הכינו 40 מיקרוגרם/מ"ל נוגדן/ליגנד ביוטינילציה ב-1x PBS. הוסיפו 50-100 מיקרוליטר לכריך ודגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (איור 3G). יש לשטוף עם PBS שלוש פעמים לאחר הדגירה כדי לשטוף את הכמות העודפת של נוגדן/ליגנד ביוטינילציה.
    4. הרכיבו בזהירות את תאי ההדמיה הנקיים עם המשטחים. משטחים יכולים להיסדק בקלות בעת הידוק החדרים. הוסיפו 0.5-1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לתאי ההדמיה ושמרו אותם מוכנים להדמיה עם תאים (איור 3H).

3. הדמיה של כוחות קולטן התא

  1. הכינו תאי חיסון בעלי עניין בHBSS ב 1-2 x 106 תאים / מ"ל.
    הערה: תאים נאיביים OT-1 CD8+ משמשים כדוגמה במאמר זה. לטהר תאי T נאיביים OT-1 CD8+ A מטחול של עכברים שהוקרבו באמצעות ערכת בידוד תאי CD8+ T של עכבר MACS עם מפריד MACS בהתאם להוראות היצרן. בודד והעשיר את תאי CD8+ T על ידי הסרת כל תאי T שאינם CD8+ כי קוקטייל נוגדנים מדלדל מגנטית קשור. יש להשהות מחדש תאי T נאיביים OT-1 CD8+ מטוהרים ב-HBSS ב-2 x 106 תאים/מ"ל ולשמור על קרח לפני השימוש.
  2. בדוק את האיכות של משטח בדיקת מתח סיכת שיער DNA תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (100x מטרה) לבקרת איכות לפני הוספת ליגנדות או תאי ציפוי. צלם וכמת את עוצמת הרקע הממוצעת בערוץ Cy3B של משטח בדיקת מתח של סיכת שיער DNA מלפחות 5 מיקומים שונים ו-3 עותקים משוכפלים. שמרו על עקביות בתנאי רכישת ההדמיה כך שניתן יהיה להשתמש בערך זה כסמן אמין של איכות פני השטח וצפיפות הגשושית (איור 4C).
    הערה: כמת את מספר גדילי הדנ"א לכל ננו-חלקיק זהב ואת מספר חלקיקי הזהב למיקרומטר2 בפעמים הראשונות של הכנת פני השטח על פי ספרות12, אשר יכול לשמש סמן אמין נוסף של איכות פני השטח.
  3. צלחת ~ 4 x 10 4 - 10 x 104 תאים על כל בדיקת מתח DNA מתפקדת כיסוי ולאפשר להם להתחבר ולהפיץ במשך ~ 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. כאשר תאים מצופים על גשושיות המתח של סיכת השיער של הדנ"א ומתחילים להתפשט, דמיינו את אותות הפלואורסצנטיות שנוצרים בערוץ Cy3B עם המטרה של פי 100 (איור 3I).
  5. לאחר שתאים מתחילים לייצר אות מתח בזמן אמת על משטח בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א בערוץ Cy3B, רכשו תמונות הן בערוצי Cy3B והן בערוצי Atto647N (מיקרוסקופ TIRF נותן יחס אות לרעש טוב יותר מאשר אפיפלואורסצנציה). לאחר מכן, הוסף גדיל Atto647N לתאי ההדמיה בריכוז סופי של 200 ננומטר לצורך הכלאה סלקטיבית מכנית.
  6. לאחר 10 דקות של דגירה, הסירו במהירות ובעדינות את החיץ המכיל את גדיל הנעילה הפלואורסצנטי Atto647N והוחלפו במלחים מאוזנים טריים של האנק. תמונה בשני ערוצי Cy3B ו- Atto647N שוב ולקבוע את מקדם המתאם של פירסון עם תוכנת פיג'י15.
  7. בנקודת העניין של החקירה, הציגו גדיל נעילה שאינו פלואורסצנטי לתאים בתא ההדמיה כדי לאחסן את אות המתח. מכינים מלאי גדילי נעילה (100 מיקרומטר) ומוסיפים לתאים בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. פיפטה עדינה לערבוב. משך הנעילה יכול להשתנות אך 10 דקות הוא הזמן המומלץ.
  8. רכשו סרטים בהילוך מהיר או תמונות של נקודות קצה באפיפלואורסנציה הן למיפוי מתח איכותי והן לניתוח כמותי לפי הצורך (איור 3J ואיור 5).
    הערה: אם יש צורך במדידת מתח במספר נקודות זמן, התחל למחוק אותות מתח מאוחסנים על-ידי הוספת גדיל פתיחת נעילה. כדי להימנע משטיפה עודפת, משתמשים בריכוז סופי גבוה יותר של גדיל פותח ב-2 מיקרומטר כדי להתחיל תגובת תזוזה בתיווך גדיל הבוהן עם גדיל הנעילה למשך 3 דקות, אשר מוחקת את האותות המאוחסנים (איור 3J). שטפו בעדינות את עודפי האוליגונוקלאוטידים עם HBSS. בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א עולה על פני השטח והתאים מוכנים לסבב נוסף של אחסון ומיפוי מתח. פתיחת אותות מתח אינה הכרחית אם רק נקודת זמן אחת מעניינת במחקר.

4. ניתוח נתונים

הערה: ניתוח התמונה מתבצע באמצעות תוכנת פיג'י, והניתוח הכמותי מתבצע באמצעות תוכנת ניתוח.

  1. תקן כל סטייה במהלך רכישת תמונה באמצעות הפקודה ' תקן סטייה תלת-ממדית ' ב'רישום ' בתפריט ' תוספים' .
  2. הסירו את רקע המצלמה של התמונה באמצעות הפקודה ' הפחת ' בתפריט 'תהליך '.
  3. קבע את מקדם המתאם של פירסון עם הפונקציה Colocalization תחת תפריט ניתוח .
  4. ממוצע וחסר את הרקע הפלואורסצנטי שנוצר על ידי הגשושיות שלא נפתחו משלושה אזורי רקע מקומיים שונים. ציירו ROI של תאים על תמונות שהוחסרו ברקע או על תמונות RICM (מיקרוסקופ ניגודיות של הפרעות השתקפות) בעזרת הכלי בחירות חופשיות של Image J. מדוד כל מדד מעניין של החזר ההשקעה, לדוגמה, עוצמת פלואורסצנטיות משולבת ותפוסת מתח באמצעות כלי מדידה תחת תפריט ניתוח (איור 6).
  5. ייצא את המדידות לניתוח כמותי באמצעות תוכנת ניתוח.
  6. התווה את הנתונים עם כל תוכנת ניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן אנו מציגים תמונות מייצגות של בקרת איכות פני השטח (איור 4). משטח באיכות גבוהה צריך להיות בעל רקע נקי בערוץ RICM (איור 4B), ועוצמת פלואורסצנטיות אחידה בערוץ Cy3B (איור 4C). עם אותו ציוד הדמיה ותנאי רכישת דימות פלואורסצנטיים זהים, עוצמת פלואורסצנטיות הרקע צריכה להיות עקבית וניתנת לשחזור בכל פעם בעת ביצוע ניסויים עם בדיקות DNA. אנו ממליצים להשתמש בו כסמן לבקרת איכות פני השטח לפני כל קבוצה של ניסויים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעזרת ההליכים המפורטים המובאים כאן, ניתן להכין מצעי בדיקת מתח של DNA כדי למפות ולכמת את מתח הקולטן המיוצר על ידי תאי מערכת החיסון. כאשר תאים מצופים על מצע בדיקת המתח של סיכת השיער של הדנ"א, הם נוחתים, מתחברים ומתפשטים כאשר הקולטנים חשים את הליגנדות הן מבחינה כימית והן מבחינה מכנית, האחרונה שבהן מזוהה על ידי הגשושיות שלנו. עם זאת, במקרים מסוימים תאים עלולים להיכשל בהתפשטות (איור 7A) או לא מצליחים לייצר אות מתח. זה לעתים קרובות תוצאה של בעיות כימיה פני השטח דורש פתרון בעיות (טבלה 1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01GM131099, NIH R01GM124472 ו- NSF CAREER 1350829. אנו מודים למתקן טטרמר NIH עבור ליגנדות pMHC. מחקר זה נתמך, בחלקו, על ידי Emory Comprehensive Glycomics Core.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  3-חומצה הידרוקסיפיקולינית (3-HPA)Sigma56197maldi-TOF-MS matrix
  mPEG-SCBiochempegMF001023-2Kהכנת משטח
(3-אמינופרופיל) triethoxysilaneAcrosAC430941000הכנת משטח
10x מאגר ליזה של תאי דם אדומיםBiolegend00-4333-57מאגר
8.8 ננומטר ננו-חלקיקי זהב, חומצה טאניתNanocomposixהכנת משטחבהזמנה מותאמת אישית
Atto647N NHS esterSigma18373-1MG-Ffluorophore, oligo prep
Attofluor Cell Chamber, למיקרוסקופיהThermo Fisher ScientificA7816הדמיית
מזרקי BD רק עם Luer-LokBD bioscience309657תאים
ביוטיניליים נגד עכבר CD3eebioscience13-0031-82נוגדן/ליגנד
ביוטינילציה pMHC ovalbumin (SIINFEKL)NIH Tetramer Core Facility באוניברסיטת אמורינוגדן NA / ליגנד
סרום בקר אלבומיןסיגמא735078001לחסום אינטראקציות לא
ספציפיות מסנני תאיםBiologix15-1100תאים
Coverslip Mini-Rack, טפלוןתרמו פישר סיינטיפיקC14784הכנת משטח
Cy3B NHS esterGE HealthcarePA63101פלואורופור, הכנה
אוליגותמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) Corning21-031-CMמאגר
אתנולסיגמא459836הכנת פני השטח
Hank' מלחים מאוזנים (HBSS)SigmaH8264מאגר
מי חמצןSigmaH1009הכנת פני השטח
LA-PEG-SCBiochempegHE039023-3.4K
ערכת הפעלה Midi MACS (LS)Miltenyi Biotec130-042-301תאים
עכבר CD8+ ערכת בידוד תאיT Miltenyi Biotec130-104-075תאים
Nanosep MF מכשירים צנטריפוגלייםמעבדה Pall ODM02C35הכנת אוליגו
מס '2 כיסויי זכוכית עגוליםVWR48382-085הכנת משטח
NTA-SAMDojindo Molecular TechnologiesN475-10הכנת משטח
P2 ג'לביו-ראד1504118אוליגו הכנה
חומצה סופריתEMD Millipore CorporationSX1244-6הכנת משטח
Sulfo-NHS אצטטThermo Fisher Scientific26777הכנת משטח
<חזק>ציוד
Agilent AdvanceBio Oligonucleotide C18 עמודה, 4.6 x 150 מ"מ, 2.7 μ m653950-702הכנת אוליגונוקלאוטידים
מערכת טיהור מים ננו-טהורים Barnsteadמים תרמו פישר
CFI Apo 100& NA 1.49 אובייקטיביניקוןמיקרוסקופיה
Cy5 קובייתCHROMAמיקרוסקופיה
להתפתח מכשיר מצמד מטען מכפיל אלקטרונים (EMCCD)מיקרוסקופיה פוטומטריתמיקרוסקופיה
כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים Agilent1100הכנת אוליגונוקלאוטידים
מקור אפיפלואורסצנטי אינטנסילי אורניקוןמיקרוסקופיה
ספיחה/יינון לייזר בסיוע מטריקס ספקטרומטר מסה של זמן טיסה (MALDI-TOF-MS)הכנת אוליגונוקלאוטידיםשל Voyager STR
Nanodrop 2000 ספקטרופוטומטר UV-Visהכנת אוליגונוקלאוטידיםתרמו פישר
Eclipse Ti מיקרוסקופ הפוךמיקרוסקופ ניקון
פוקוס מושלמתשל ניקוןמיקרוסקופיה
NIS Elements תוכנהניקוןמיקרוסקופיה
מרובע פס TIRF 405/488/561/647 קובייתCHROMAמיקרוסקופיה
RICMCHROMAמיקרוסקופיה
TIRF עם 488 ננומטר (50 mW), 561 ננומטר (50 mW)ומיקרוסקופיהקוהרנטית
קוביית TRITCמיקרוסקופיה CHROMAמיקרוסקופיה
<חזק>שם אוליגו<חזק>5' שינוי / שינוי 3'<חזק>רצף (5' עד 3')<חזק>השתמש
15mer גדיל נעילת אמין<חזק>5' שינוי: ללא שינוי
<חזק>3' שינוי: /3AmMO/		AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACCTA נעילת אות מתח בזמן אמת
15mer Atto647N גדיל נעילה<חזק>5' שינוי: Atto647N
<חזק>3' שינוי: /3AmMO/		AAA AAA CAT TTA TAC CCT ACC TAנעילת אות מתח בזמן אמת
15mer גדילנעילה לא פלואורסצנטי<שינוי חזק>5': ללא שינוי
<חזק>3' שינוי: ללא שינוי		A AAA AAC ATT TATAC נעילת אות מתח בזמן אמת לניתוח כמותי
4.7 pN גדיל סיכת ראש<חזק>5' שינוי: ללא שינוי
<חזק>3' שינוי: ללא שינוי		GTGAAATACCGCACAGATGCGT
TTGTATAAATTTTTTTTTCATAT
ACTTTAAGAGCGCCACGTAGCC
בדיקת סיכת ראש CAGC
גדיל אמין ליגנד<חזק>5' שינוי: /5AmMC6/
<חזק>3' שינוי: /3Bio/		CGCATCTGTGCG GTA TTT CACבדיקת סיכת ראש
BHQ2 גדילעוגן<שינוי חזק>5': /5ThiolMC6-D/
<חזק>3' שינוי: /3BHQ_2/		TTTGCTGGGCTACGTGGCGCTCTT      בדיקה סיכת ראש
Cy3B גדיל ליגנד<חזק>5' שינוי: Cy3B
<חזק>3' שינוי: /3Bio/		CGCATCTGTGCG GTA TTT CAC TTTבדיקת סיכת ראש
פתיחת גדיל<חזק>5' שינוי: ללא שינוי
<חזק>3' שינוי: ללא שינוי		TAG GTA GGG TAT AAA TGT TTT TTT Cפתיחת אות מתח מצטבר
ניקון מערכת משגר 640 ננומטר

מקורות

  1. Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221 (1), 77-89 (2008).
  2. Spillane, K. M., Tolar, P. B cell antigen extraction is regulated by physical properties of antigen-presenting cells. Journal of Cell Biology. 216 (1), 217-230 (2017).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (39), 8204-8213 (2017).
  4. Hong, J., et al. A TCR mechanotransduction signaling loop induces negative selection in the thymus. Nature Immunology. 19 (12), 1379-1390 (2018).
  5. Basu, R., et al. Cytotoxic T cells use mechanical force to potentiate target cell killing. Cell. 165 (1), 100-110 (2016).
  6. Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2241-2246 (2014).
  7. Ma, V. P. Y., Salaita, K. DNA nanotechnology as an emerging tool to study mechanotransduction in living systems. Small. 15 (26), 1900961(2019).
  8. Liu, Y., Yehl, K., Narui, Y., Salaita, K. Tension sensing nanoparticles for mechano-imaging at the living/nonliving interface. Journal of the American Chemical Society. 135 (14), 5320-5323 (2013).
  9. Glazier, R., et al. DNA mechanotechnology reveals that integrin receptors apply pN forces in podosomes on fluid substrates. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
  10. Galior, K., Liu, Y., Yehl, K., Vivek, S., Salaita, K. Titin-based nanoparticle tension sensors map high-magnitude integrin forces within focal adhesions. Nano Letters. 16 (1), 341-348 (2016).
  11. Zhang, Y., Ge, C., Zhu, C., Salaita, K. DNA-based digital tension probes reveal integrin forces during early cell adhesion. Nature Communications. 5, 5167(2014).
  12. Liu, Y., et al. DNA-based nanoparticle tension sensors reveal that T-cell receptors transmit defined pN forces to their antigens for enhanced fidelity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (20), 5610-5615 (2016).
  13. Zhang, Y., et al. Platelet integrins exhibit anisotropic mechanosensing and harness piconewton forces to mediate platelet aggregation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (2), 325-330 (2018).
  14. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464 (7290), 932-936 (2010).
  15. Ma, R., et al. DNA probes that store mechanical information reveal transient piconewton forces applied by T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16949-16954 (2019).
  16. Hui, E., et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 355 (6332), 1428-1433 (2017).
  17. Whitley, K. D., Comstock, M. J., Chemla, Y. R. Elasticity of the transition state for oligonucleotide hybridization. Nucleic Acids Research. 45 (2), 547-555 (2016).
  18. Brockman, J. M., et al. Live-cell super-resolved PAINT imaging of piconewton cellular traction forces. Nature Methods. 17 (10), 1018-1024 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

חיישני מתח מולקולרייםכוחות תאי מערכת החיסוןמכנו-טרנסדוקציהמיקרוסקופיה פלואורסצנטיתנעילת סיכת ראש (Hairpin Locking)ננו-חלקיקי זהבTCR Peptide MHCדימוג אפי-פלואורסצנציהכוחות מכניים חולפים
בדיקות מתח DNA כדי למפות את כוחות קולטן פיקוניוטון חולפים על ידי תאים חיסוניים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.