ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה
במאמר זה
סיכום
תקציר
העשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, אלה שמתחת לתכולת הגידול של 20% בהתאם לשיטה, נדרשת כדי להפיק נתונים איכותיים באופן משוחזר עם בדיקות רבות במורד הזרם כגון ריצוף הדור הבא. כריתת רקמות אוטומטית היא מתודולוגיה חדשה שהופכת ומשפרת את העשרת הגידולים ברקמות הנפוצות והנמוכות הללו על ידי הפחתת חוסר הדיוק התלוי במשתמש של ניתוח מאקרו מסורתי ומגבלות זמן, עלות ומומחיות של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר על-ידי שימוש בשכבת-על של ביאור תמונה דיגיטלי על גבי שקופיות לא מוכתמות. כאן, ביאורים דיגיטליים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) משמשים כדי להתמקד באזורי גידול קטנים באמצעות להב בקוטר 250 מיקרומטר2 בפרפין קבוע פורמלין לא מוכתם משובץ (FFPE) או מקטעים קפואים טריים בעובי של עד 20 מיקרומטר להעשרת גידולים אוטומטית לפני מיצוי חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם (WES). כריתה אוטומטית יכולה לקצור אזורים מבוארים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מקטעים בודדים או מרובים למיצוי חומצות גרעין. הוא גם מאפשר לכידה של מדדי איסוף נרחבים לפני ואחרי הקציר תוך שיפור הדיוק, יכולת השכפול והגדלת התפוקה תוך ניצול של פחות שקופיות. הפרוטוקול המתואר מאפשר ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית על FFPE של בעלי חיים ו/או בני אדם או רקמות קפואות טריות עם תכולת גידול נמוכה ויכול לשמש גם לכל אזור העשרת עניין כדי להגביר את ההלימה ליישומי ריצוף במורד הזרם בתהליכי עבודה קליניים או מחקריים.
מבוא
ריצוף הדור הבא (NGS) מנוצל יותר ויותר הן לטיפול בחולים והן לחקר הסרטן כדי לסייע בהנחיית טיפולים ובהקלה על גילוי מדעי. רקמה היא לעתים קרובות מוגבלת ודגימות קטנות עם תוכן גידול משתנה משמשים באופן שגרתי. הלימות הגידול ושלמותו, אם כן, נותרו מחסום להשגת נתונים משמעותיים. דגימות עם אחוזי גידול נמוכים יותר עלולות לגרום לקושי להבחין בין וריאנטים אמיתיים לבין ממצאי ריצוף ולעתים קרובות אינן זכאיות ל- NGS1. העשרת גידולים של מקרים בעלי תכולת גידול נמוכה, אלה הנמוכים מ-20%, הוכחה כמסייעת להניב מספיק חומר על מנת לייצר נתוני ריצוף הניתנים לשחזור ולהבטיח שגרסאות בתדר נמוך לא יחמיצו 2,3. עם זאת, המגבלות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לפני תחילת העבודה, השג דגימות רקמות מתאימות על פי פרוטוקולי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של Genentech, Inc.
1. הכנת רקמות ושקופיות
- בחר בלוקי FFPE או רקמות קפואות טריות והשתמש בשיטת העיבוד המתאימה להלן.
- חותכים מקטעי בלוק רקמה לשקופיות זכוכית טעונות חיובית בעובי הרצוי. חתכו באופן סדרתי את רקמת ה-FFPE בסרטים עם קטע הייחוס הראשון שנחתך בעובי המתאים לצביעת H&E (כלומר, 4 מיקרומטר) ואחריו 1-4 מקטעים בעובי הנע בין 4-20 מיקרומטר בהתאם לצורך וזמינות הרקמה. אספו את חלקי הרקמה לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית טעונות חיובית.
הערה: יש להכתים באופן מיידי קט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נבחרו מקטעי כבד של עכברי FFPE ו-FF המכילים סרטן מעי גס גרורתי בנצרי קסנוגרפט. המקטעים הוכתמו ב-H&E (איור 1A,E,I) ונסרקו על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20. פתולוג ציין באופן דיגיטלי אזורי גידול מעניינים ומסכה נוצרה באמצעות תוכנה מסחרית ועוצבה כתמונת ייחוס דיגיטלית של png (איור 1B,F,J). שקופיות דגימה לא מוכתמות בעובי 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר הונחו על הבמה ונתיחה אוטומטית בוצעה כמתואר לעיל. רקמות קפואות טריות נאספו במאגר ל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מוצג כאן פרוטוקול ליישום של ביאור דיגיטלי וכריתה אוטומטית לנתח אזורי גידול מתכולת גידול נמוכה FFPE או רקמות קפואות טריות להעשרת הגידול והשימוש בו ב- WES. שילוב של ביאור דיגיטלי ויצירת מסכה עם דיסקציה אוטומטית מפחית באופן משמעותי את הזמן והמומחיות המעשיים הנדרשים הנפוצים בשיטות קלאסיות של העשרת גידולים, כולל מאקרודיסקציה ידנית ו-LCM. הפרוטוקול מדגים אפשרות העשרת גידולים בעלת פוטנציאל חשוב לטווח בינוני המאפשרת לא רק העשרה נמוכה של תכולת הגידול, אלא גם העשרה במקרים בהם קשה לנתח קיני גידול מבוזרים הרחק מהרקמה הנורמלית של הגי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
צ'ארלס א' האבנאר, אוליבר זיל, ג'ף איסטהאם, ג'פרי האנג, ג'ניפר גילטנן, ניקולס לונסברי, דניאל אורפר, סרג'אן סטורניו ואיימי א' לו הם עובדים ובעלי מניות של ג'ננטק ורוש ומאנה ג'אבי ועמנואל נאורי הם עובדים ובעלי מניות של רוש.
תודות
המחברים רוצים להודות לקרמינה אספיריטו ורובין א. טיילור על תמיכתם בפיתוח דיסקציה אוטומטית, כמו גם לצוות המעבדה המרכזית לפתולוגיה של Genentech שתמך בעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | מיקרו-צנטריפוגה |
| מאגר דגירה | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | מכתים אוטומטיים |
| שמן מינרלי בדרגה מולקולרית | סיגמא | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | מאגר עיכול |
| Qiagen AllPrep DNA / RNA מיני ערכת | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus מאגר | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ טעון חיובית | Thermo Scientific | 6776214 |
מקורות
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
