מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

סיכום

להלן פרוטוקולים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי תירס קדם-תאיים לצורך שינוי הגנום שלהם באמצעות עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 או להוספת אלמנטים מסומנים הניתנים להעברה באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט.

תקציר

צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק של תירס ווקטור של מספר נגיפי תירס. שיטות שפורסמו בעבר מתארות את הפעלת הפרעות RNA (RNAi) ב- P. maidis באמצעות מיקרו-הזרקה של RNA דו-גדילי (dsRNAs) לנימפות ולמבוגרים. למרות כוחו של RNAi, פנוטיפים הנוצרים באמצעות טכניקה זו הם חולפים וחסרים תורשה מנדליאנית ארוכת טווח. לכן, יש להרחיב את ארגז הכלים של P. maidis כך שיכלול כלים גנומיים פונקציונליים שיאפשרו ייצור זנים מוטנטיים יציבים, ויפתחו את הדלת לחוקרים להביא שיטות הדברה חדשות למזיק חשוב מבחינה כלכלית זו. עם זאת, שלא כמו dsRNA המשמשים עבור RNAi, הרכיבים המשמשים בעריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 וטרנספורמציה של קו הנבט אינם חוצים בקלות את קרום התא. כתוצאה מכך, דנ"א פלסמיד, רנ"א ו / או חלבונים חייבים להיות מוזרקים במיקרו לעוברים לפני שהעובר צלולריז, מה שהופך את תזמון ההזרקה לגורם קריטי להצלחה. לשם כך פותחה שיטת הטלת ביצים מבוססת אגרוז המאפשרת לקצור עוברים מנקבות P. maidis בפרקי זמן קצרים יחסית. להלן מוצגים פרוטוקולים מפורטים לאיסוף והזרקה זעירה של עוברי P. maidis קדם-תאיים עם רכיבי CRISPR (נוקלאז Cas9 שהורכב עם RNA מנחה), ומוצגות תוצאות של נוקאאוט גנטי מבוסס Cas9 של גן צבע עיניים P. maidis, לבן. למרות שפרוטוקולים אלה מתארים עריכת גנום CRISPR/Cas9 ב- P. maidis, הם יכולים לשמש גם לייצור P. maidis מהונדס באמצעות טרנספורמציה של קו הנבט פשוט על ידי שינוי הרכב תמיסת ההזרקה.

מבוא

צמח התירס, Peregrinus maidis, הוא מזיק חשוב מבחינה כלכלית של תירס ^1,2,3. הם גורמים נזק פיזי ישיר לצמח, הן בעת האכלה עם איברי הפה המוצצים הנוקבים שלהם, והן במהלך הרבייה כאשר הם מטילים את עובריהם ישירות לתוך רקמת הצמח ^2,4. למרות הנתיבים המרובים של נזק ישיר ליבולים, ההשפעה הגדולה ביותר שיש לחרקים אלה על בריאות היבול היא עקיפה, בכך שהם פועלים כווקטור של נגיף פסיפס תירס (MMV) ונגיף פס תירס ^5,6. MMV מסוגל להשתכפל בגוף וקטור P. maidis שלו, ומאפשר לנגיף להתמיד בחרקים בודדים לאורך כל חייהם, כך שהם יכולים להמשיך להפיץ את הנגיף לצמחים מארחים חדשים ^7,8. השיטות הנפוצות ביותר להדברת P. maidis, ובכך וירוסים זה וקטור, הם קוטלי חרקים.

למרבה הצער, ניהול כושל של מוצרים אלה גרם לפיתוח עמידות במזיק היעד כמו גם זיהום הסביבה⁹. לכן, יש צורך באסטרטגיות חדשות כדי להפחית את הפסדי היבול משילוב זה של חרקים/וירוסים-מזיקים. עבודות קודמות הראו כי הפרעות RNA (RNAi) יכולות להיות שיטת בקרה יעילה עבור P. maidis מכיוון שהם רגישים לירידה בוויסות בביטוי גנים אפילו בעת בליעת RNA דו-גדילי (dsRNA)¹⁰. עם זאת, הדרך היעילה ביותר לנהל dsRNA בשדה תהיה באמצעות הצמחים שהחרקים ניזונים מהם; לפיכך, יבולים עדיין יכולים להיות רגישים לכל וירוסים שהחרקים כבר נושאים. עם הופעת עריכת הגנום של CRISPR/Cas9, אסטרטגיות הדברה חדשות אפשריות, כולל כונן גנים מבוסס Cas9^11,12, שניתן להשתמש בו כדי להקטין את גודל אוכלוסיית המזיקים^, או להחליף את האוכלוסייה האמורה בפרטים עמידים לנגיפים שהם וקטור.

עם זאת, פיתוח ופריסה של כל סוג של מערכת דחיפת גנים ידרוש פיתוח של טכניקות טרנסגניות. שיטות כאלה לא היו נחוצות לביצוע ניסויי RNAi ב- P. maidis מכיוון ש- dsRNA ו / או siRNA נחשבים כמסוגלים לחצות את קרום התא בשל יעילות ה- RNAi ב- P. maidis^10,13. זה לא נכון לגבי הדנ"א ו/או החלבונים המשמשים בטרנסגנזה מסורתית או בעריכת גנים מבוססת Cas9, שכל אחד מהם יהיה סימן מקדים ליצירת חרקים הנושאים דחף גנטי. כדי לבצע עריכת גנים או צורות אחרות של טרנספורמציה של קו הנבט, דנ"א וחלבונים אלה מוזרקים באופן אידיאלי לעוברים בשלב הבלסטודרם הסינסיטיאלי, לפני שעובר החרק צלולריז. העיתוי הוא קריטי, מכיוון שהשלב הסינקטיאלי הוא החלק המוקדם ביותר של התפתחות^14,15. מכיוון שנקבות P. maidis מעדיפות להטיל את ביציהן ברקמת הצמח, חילוץ כמויות מספיקות של עוברים קדם-תאיים למיקרו-הזרקות יכול להיות עתיר עבודה וגוזל זמן. לכן, פותחו טכניקות חדשות לאיסוף מהיר ולהזרקה זעירה של עוברי P. maidis לפני הצלולריזציה.

פרוטוקול

1. גידול ברמת מושבה של מבוגרים P. maidis

1. שתול לפחות ארבעה עציצי תירס בשבוע בכל כלוב גידול, עם 3-4 זרעים בכל עציץ. לגדול בסביבה נטולת חרקים.
2. כאשר הצמחים הם ~ 5 שבועות, מניחים בתוך כלוב 30 ס"מ x 30 ס"מ x 60 ס"מ.
3. השג כמות מספקת של P. maidis בוגרים (~ 500) ממעבדת מחקר או מהטבע, והכנס לכלוב חסין חרקים עם 9-12 צמחי תירס (3-4 עציצים).
4. שמור על המושבה באינקובטור לגידול חרקים ב 25 ° C (± 1 ° C), עם לפחות 70% לחות ומחזור אור 14: 10.
5. כדי ליצור מושבה מכויילת לגיל, הוציאו את כל הבוגרים הראשונים לאחר ארבעה ימים של הטלת ביצים, ואפשרו לעוברים המוטלים בכלוב לבקוע ולהזדקן באופן טבעי.
6. העבירו חרקים בני 5 שבועות של P. maidis (בוגרים) לצמחי תירס טריים עבור תת-תרבות שבועית על-ידי איסוף עם שואף (איור 1). לאחר מכן, שחררו את הבוגרים לכלוב נקי עם צמחי תירס טריים. כדי לשמור על אספקה קבועה של צעירים למטרות ניסיוניות, הכינו כלובים טריים מכוילים לגיל מדי שבוע.
7. השקו את הסירים בכלובים פעמיים ביום. יש לגזור מעת לעת גבעולים, להסיר חומר צמחי נרקב ולהחליף בעציצי תירס טריים לפי הצורך.
   הערה: עם תחזוקה נאותה, מושבה יכולה להימשך ~ 5 שבועות (כלומר, מספיק זמן עבור עוברים שהונחו בכלוב כדי להפוך לבוגרים).

2. תא הטלת ביצים מבוסס אגרוז

1. הכינו כלים לאיסוף ביצים (אוביפוזיציה בינונית) על ידי מזיגה של 1% עם אגרוז במים לצלחות פטרי נקיות בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ. יש לאחסן את מדיום האוביפוזיציה בטמפרטורה של 4°C לאחר שהוא מתמצק.
2. הכינו תמיסת סוכרוז 10% עם V להאכלת המבוגרים. אחסנו את תמיסת הסוכרוז בטמפרטורה של -20°C למשך עד חודש.
3. צרו תא שיחזיק את המבוגרים על-ידי חיתוך חור בתחתית של אונקיה אחת (ראו טבלת חומרים) והדבקת מסך מעל החור לצורך החלפת אוויר (איור 2).
4. חותכים סרט שעוות פרפין פלסטיק לריבועים בגודל 5X5 ס"מ; מניחים בצד 2 ריבועים לכל.
5. אספו ~15 נקבות בוגרות בנות שבוע ממושבת P. maidis מכויילת גיל. כדי לבחור נקבות, בחנו את הצד הגחוני של הבטן, וחפשו את האוביפוזיטור, שהוא בדרך כלל כהה יותר משאר הבטן (איור 3). החזיקו בוגרים עד שעה בבקבוקון חרוטי של 15 מ"ל אם מקימים מספר תאי הטלת ביצים. מצננים את החרקים לזמן קצר על קרח לפני הסקס ומעבירים למיכל הבוגר.
   הערה: בדיקה זו יכולה להיעשות ללא מיקרוסקופ. נקבות בוגרות שהספיקו להאכיל ולהזדווג גם הן בדרך כלל בעלות בטן גדולה יותר מזכרים בוגרים והן צייתניות יותר; לפיכך, ניתן לבחור אותם בקלות רבה יותר מתוך אוכלוסיית כלובים.
6. העבירו את הנקבות למיכל בוגר, ואטמו את הכוס בשכבה אחת של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק על-ידי מתיחה אחידה של הכוס פי 3-4 מגודלה המקורי (איור 4A,B).
7. מרחו 400 μL של תמיסת סוכרוז 10% w/v על החלק העליון של אטם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והוסיפו שכבה שנייה של שכבת שעוות פרפין מפלסטיק, תוך מתיחת סרט שעוות הפרפין מפלסטיק בדיוק כפי שלמעלה (איור 4C,D).
   הערה: הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק מתוח לוחץ על תמיסת הסוכרוז, שהיא חשובה מאוד להאכלה בוגרת, אך לא תמנע מהנקבות לחדור את האוביפוזיטורים שלהן כל הדרך למדיום האוביפוזיציה.
8. הניחו את התא הבוגר על צלחת איסוף ביצים עם צד סרט שעוות פרפין מפלסטיק ישירות על מדיום האוביפוזיציה, ועטפו את כל תא הטלת הביצים בניילון נצמד מבלי לכסות את חורי האוויר, שכן אלה נדרשים להחלפת אוויר (איור 5).
9. יש לדגור על כל תא הטלת ביצים בטמפרטורה של 25°C עם 70% לחות ומחזור אור של 14:10.
10. החליפו את הכריך של סרט שעוות פרפין מפלסטיק ותמיסת סוכרוז 10% עם סוכרוז מדי יום, והוציאו את כל המים שהצטברו בתוך הכוס.

3. איסוף עוברים ויישורם בסביבה עם לחות גבוהה

1. הגדר מערכת מיקרו-הזרקה מבוססת סטריאומיקרוסקופ בחלל לח או מכסה מנוע (מכסה מנוע לח; איור 6) כדי להבטיח שסביבת העבודה תשיג לפחות 70% לחות לאורך כל תהליך המיקרו-הזרקה.
2. בדוק את מדיום oviposition עבור ביצים לאחר תקופת הטלת הביצים הרצויה. עשו זאת במכסה מנוע לח או בסביבה לחה אחרת.
   הערה: תקופת הטלת הביצים המשמשת בדרך כלל הייתה לילה, משעה 18:00 עד 10:00, ונמשכה ~ 16 שעות.
3. אם ביצים מוטלות באגרוז, השתמשו במלקחיים עדינים כדי לחפור אותן בזהירות, והניחו אותן על פני השטח של האגרוז כדי לשמור עליהן לחות (איור 7A).
4. החל רצועה של סרט דו-צדדי בגודל 1 מ"מ x 15 מ"מ על כיסוי בגודל 22 מ"מ x 30 מ"מ (איור 7B). הניחו את סרט הכיסוי כלפי מעלה על מדיום האוביפוזיציה (איור 7C).
5. הרימו כל ביצה בנפרד ממשטח האגר, ועברו לסרט הדו-צדדי בעזרת מברשת עדינה. הסר את כל הביצים כי הם לבנים לחלוטין או יש צבע שחור עליהם. ביצים בריאות יהיו שקופות למחצה.
6. הניחו את הביצים בצורת בננה על צידן, כשהקצה הגדול יותר תקוע על הסרט הדו-צדדי (איור 7D).
   הערה: יש לשמור תמיד את הביצים בסביבה עם לחות גבוהה, כגון צלחת פטרי יצוקה עם שכבה של 1% אגר בתחתית.

4. הכנת ריאגנטים CRISPR ומחטי הזרקה

1. משוך מחטי קוורץ באמצעות מושך מיקרופיפטה מסוג Flaming/Brown.
2. משופעים את מחטי הקוורץ באמצעות שיפוע מיקרופיפטה.
3. השתמשו בסרט דביק דו-צדדי כדי לאבטח מחטים שנמשכו במיכל שקוף, כגון צלחת פטרי, עד שהן מוכנות לשימוש.
4. הכן את תמיסת ההזרקה על ידי שילוב של 0.5 μL של חלבון Cas9 (תמיסת מלאי של 5 מיקרוגרם/μL) ו-0.5 μL של sgRNA (תמיסת מלאי של 4 מיקרוגרם/μL; ראה טבלת חומרים) עם 1 μL של חיץ אדום פנול בנפח סופי של 5 μL. כדי לזרז חלקיקים שעלולים לסתום את המחט, מערבלים את התמיסה לזמן קצר, וצנטריפוגה למשך 3 דקות במהירות מרבית.
5. ממלאים את מחט ההזרקה, דואגים להשאיר את תערובת ההזרקה ליד הקצה המחודד של המחט. הסר בועות, אם בכלל, מקצה המחט.
6. הניחו בזהירות את המחט הממולאת לאחור במחזיק המחט, והדקו את צווארון הנירוסטה כדי להחזיק את המחט בבטחה במקומה במהלך מיקרו-הזרקה.
7. צור זרימה אמינה של תמיסת הזרקה מהמחט על ידי ליטוף עדין של הקצה המשופע עם מברשת צבע עדינה ולחה, תוך העברת פרצי לחץ אוויר למחט באמצעות מערכת ההזרקה.
   הערה: המחט מוכנה להזרקה כאשר תערובת ההזרקה יכולה לעזוב את הקצה בכמויות קטנות.

5. מיקרו-הזרקה וטיפול לאחר הזרקה

1. הכינו משטח מיקרו-הזרקה על ידי מילוי צלחת פטרי נקייה בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ באגר 1% ליצירת שכבה שטוחה של אגר עם החלק העליון של המנה.
2. הניחו על מצע האגר פתק שהוכן מראש עם ~25 עוברים (איור 8A).
   הערה: כל שלבי ההזרקה חייבים להתבצע בתוך מכסה מנוע לח (~ 70% לחות).
3. בדוק את לחץ ההזרקה על ידי הנחת קצה המחט בטיפת מים והתחלת מחזור ההזרקה.
   הערה: כמות קטנה של תמיסת הזרקה אמורה להתפזר לתוך המים אם הגדרת הלחץ נכונה (איור 8B).
4. הכניסו את המחט לקצה הגדול יותר של העובר, כשהיא מתקרבת מצד שמאל של המכסה (איור 8C). העבירו את תמיסת ההזרקה לתוך הביצית, ושלפו את המחט במהירות.
5. לאחר הזרקת כל הביצים, הניחו את הכיסוי על פני צלחת אגר חדשה 1%, והעבירו את התבשיל לתא לחות (איור 9).

6. דגירה ובקיעה של עוברים

1. שים את תא הבקיעה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס למשך 6 ימים.
2. העבירו את כל העוברים ששרדו, בעזרת מים נקיים ומברשת עדינה, לצלחת פטרי בגודל 35 מ"מ x 10 מ"מ עם נייר פילטר לח במים המכסה את תחתית המנה. אטמו את צלחת הפטרי עם סרט שעוות פרפין מפלסטיק, והחזיקו בטמפרטורה של 25°C כדי לאפשר לעוברים לבקוע. התחל לבדוק את העוברים 6 ימים לאחר ההזרקה להישרדות.
   הערה: נימפות אינסטאר ראשונות יתחילו לבקוע בסביבות היום השמיני.
3. מעבירים נימפות, בעזרת מברשת עדינה, לצלחת פטרי המכילה גזירי עלים. מכסים את המנה, ואוטמים בסרט שעוות פרפין מפלסטיק.
4. לדגור על צלחת אטומה של אבקועים על ייחורי עלים במשך 48 שעות ב 25 ° C.
5. העבירו את כל הנימפות בנות היומיים מסבב זריקות לכלוב גידול עם צמחי תירס באמצעות מברשת עדינה. אם מזריקים עם פנוטיפ נראה לעין מתאוששים במספרים מספיקים, החזירו אותם בנפרד כדי למקסם את ההתאוששות של תכונת המטרה בדור הבא. אחרת, לבצע הזדווגות המונית של כל הזריקים.
   הערה: הניחו את האבקועים בעדינות במערבולת של צמח התירס כדי לספק מקלט ולהבטיח לחות נאותה של סביבתם הקרובה.
6. לגדל את החרקים בתנאים שתוארו לעיל, תוך הבטחת טמפרטורה נאותה, לחות, והעברות קבועות לצמחי תירס טריים.
7. צאצאי מסך לפנוטיפים צפויים. הכניסו אנשים המציגים את הפנוטיפ הרצוי לכלוב משלהם כדי ליצור קווים הומוזיגוטיים.

תוצאות

תא הטלת הביצים תוכנן במיוחד כדי לאפשר לנקבות P. maidis להיזון תוך כדי אוביפוזיטציה בתווך מגן שממנו ניתן היה לשחזר את ביציהן בקלות. באמצעות שיטה זו, כמויות מספיקות של עוברים קדם-תאיים נמצאו לצורך מיקרו-הזרקה עם DNA, RNA ו/או חלבונים. נקבות P. maidis בוגרות בדרך כלל מטילות ביצים בתוך רקמת העלים של צמחי התירס, מה שהופך את קבלת מספיק ביצים בזמן קצר לאתגר מכיוון שזה דורש הרבה דיסקציה של עלים. סביבת ההטלה המלאכותית מספקת פתרון להתגברות על בעיות אלו. כפי שניתן לראות בטבלה 1, 6,483 ביצים נאספו מ-645 נקבות בתוך 4 שבועות. הנקבות בדרך כלל מתחילות להטיל ביצים לאחר היום השני ומספקות את רוב הביצים מהיום הרביעי עד היום השישי. פעילות האוביפוזיציה הואטה ביום ה-9. כל תא ביצות הוקם ביום שישי ובדק ביצים מיום ראשון עד יום ראשון הבא. מעקב אחר לוח זמנים זה איפשר לאסוף את רוב הביציות למיקרו-זריקות במהלך שבוע העבודה.

היישום המעשי הראשון של מערכת הטלת ביצים זו היה לבחון את היעילות של נוקאאוט גנטי בתיווך Cas9, תוך שימוש באורתולוג P. maidis של הגן בצבע עיניים, לבן (Pmw), כמטרה. מוטציות בלבן ידועות כגורמות לאובדן משמעותי של פיגמנטציה בעין במינים אחרים של חרקים, ולבן הוא אוטונומי תאי, המאפשר גילוי מוטציות בפרטים מוזרקים^16,17. כדי להגדיל את הסיכוי שאפילו מוטציה קטנה תגרום לאובדן תפקוד, RNA מנחה תוכנן לחתוך בתוך האזור של קלטת קשירת ATP, אשר הכרחי עבור פונקציה לבנה¹⁶. לעוברי P. maidis הוזרקו 20% פנול אדום (חיץ הזרקה), חיץ הזרקה עם Cas9 בריכוז סופי של 800 ng/μL (בקרת Cas9), או Cas9 בחיץ הזרקה יחד עם שלושה RNA מנחים שנוספו בריכוז של 400 ng/μL כל אחד. השילוב של שלושה מדריכים בתמהיל הזרקה אחד נועד למקסם עוד יותר את הסיכויים ליצירת מוטנטים, הן על ידי יצירת מחיקה גדולה, והן על ידי פיצוי על האפשרות שמדריך אחד לא יהיה יעיל לחיתוך. שיעורי ההתפתחות בכל טיפול היו דומים (טבלה 2), כאשר 50-60% מהמוזרקים הראו סימני התפתחות. שיעורי הצוהר עבור פקדי החיץ וה-Cas9 היו דומים אף הם; עם זאת, שיעורי הבקיעה של פרטים שקיבלו את תערובת שלושת המדריכים היו נמוכים יחסית. בשלב זה, לא ברור אם ההישרדות המופחתת היא תוצאה של אובדן התפקוד הלבן או תוצאה של תוצאות לא מכוונות של תמהיל שלושת המנחים, כגון השפעות מחוץ למטרה (ראה פרק הדיון). עם זאת, אף אחד מהאנשים עם אובדן מוחלט של פיגמנטציה בעין (כלומר, נוקאאוט מוחלט) לא בקע, ואף אחד מצאצאי האנשים שהוזרקו לא היה בעל עיניים לבנות. היעילות הממוקדת של מוטגנזה מבוססת Cas9 אומתה בשתי דרכים. ראשית, המזרקים נבדקו לאיתור אובדן פיגמנטציה בעין.

מתוך 71 פרטים שהתפתחו בהזרקת הנחיה, 23 הראו מידה מסוימת של אובדן פיגמנט (איור 10), ו-9 מהפרטים האלה בקעו, מה שהביא לשיעור נוקאאוט של ≥32%. לא נצפה אובדן פיגמנט בעין בשני טיפולי הביקורת. שנית, מוטציות כרומוזומליות אושרו באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR)¹⁸ וריצוף¹⁹. מכיוון שלא ניתן היה לשחזר קו מוטנטי, דנ"א גנומי נותח ממאגרים של עוברים שהוזרקו להם תערובת שלושת המנחים או חיץ. תערובת שלושת המדריכים צפויה להסיר ~180 זוגות בסיסים מהלוקוס הלבן . ניתן לראות זאת בתוצרי PCR המוגברים מדנ"א גנומי שבודד מאנשים מוזרקים, כמו גם בנתוני הרצף הקשורים המופקים מאותם מוצרים (איור 11). ראיות משולבות אלה מצביעות על כך שהעוברים הוזרקו לפני שהתרחשה הצלולריזציה.

איור 1: שואף. ניתן להרכיב שואב יעיל החל מחיבור משאבת ואקום בכניסה, באמצעות צינורות פלסטיק, ועד לצינור חרוטי פלסטיק בנפח 15 מ"ל. כ 0.5 ס"מ יש להסיר בזהירות מתחתית הצינור החרוט. כדור צמר גפן צריך להיות ממוקם בתוך צינור חרוט, מעל הפתח של צינורות פלסטיק, כדי לתפוס מבוגרים P. maidis כפי שהם נאספים ולשמור אותם מחוץ משאבת ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: בניית מכולות בוגרות. (A) האספקה הדרושה (בכיוון השעון משמאל למעלה): מסך, אקדח דבק חם, סכין גילוח, מכל של אונקיה אחת. (B) יש לחתוך חור גדול בתחתית המיכל במשקל 1 אונקיות, ולחתוך ריבוע מסך גדול מספיק כדי לכסות את החור הזה. (C) לאחר מכן מדביקים את המסך מעל החור באמצעות דבק חם. (D) לאחר הגדרת הדבק, יש להסיר את עודפי הרשת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: Sexing P. maidis מבוגרים. הצדדים הגחונים של זכר (שמאל) ונקבה (ימין) P. maidis בוגרים מוצגים. האוביפוזיטור, הנראה מעל הבטן הנשית, הוא האינדיקטור הברור ביותר למינו של אדם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: איטום מבוגרים למכלים . (A) ריבוע של 5X5 ס"מ מפלסטיק של שעוות פרפין. (B) יש למתוח את היריעה באופן שווה עד פי 3-4 מגודלה המקורי. (C) לאחר הכנסת המבוגרים למיכל המבוגרים, יש להניח את הסרט המתוח מעל הפתח כדי לאבטח את המבוגרים. לאחר מכן יש להניח טיפה של 400 μL של תמיסת סוכרוז של 10% w/v על גבי היריעה. (D) כדי לספק לחץ הזנה הולם למבוגרים, יש למתוח באופן דומה ריבוע נוסף בגודל 5 ס"מ x 5 ס"מ של סרט פרפין מפלסטיק ולהניח אותו מעל טיפת סוכרוז. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: הגדרת תא אוביפוזיציה. (A) האספקה הדרושה (בכיוון השעון משמאל למעלה): ניילון נצמד, מיכל שלם למבוגרים (עם מבוגרים), וצלוחית פטרי עם 1% אגרוז (מדיום אוביפוזיציה). (B) יש להניח את המיכל הבוגר על האגרוז עם סרט פרפין מפלסטיק/'סנדוויץ' סוכרוז 10% המונח' ישירות על מדיום האוביפוזיציה. (C) ניילון נצמד משמש להצמדת המיכל הבוגר למדיום האוביפוזיציה. זה שומר על המדיום מלהתייבש מהר מדי. (ד) יש להקפיד להימנע מכיסוי המסך של המיכל הבוגר, כך שתחלופת האוויר עדיין עשויה להימשך. (E) תרשים של תא האוביפוזיציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: מכסה מנוע לח. מכסה מנוע המצויד במכשיר אדים הוצב סביב היקף ההזרקה כדי למזער את טיוטות האוויר ולשמור על לחות בזמן הטיפול בעוברים. ניתן לקפל דשים מעל הכניסה לאחר שהעובד נמצא במקומו, כדי לסייע בשמירה על רמות לחות נאותות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 7: איסוף עוברים לקראת זריקות . (A) עוברים שהופקדו בתווך הביציות. זוג מלקחיים עדינים משמשים לחילוץ עוברים מהמדיום והנחתם על פניו. (B) רצועה צרה של סרט דו-צדדי בגודל 1 מ"מ x 15 מ"מ על גבי כיסוי בגודל 22 מ"מ x 30 מ"מ. (ג) ניתן להניח את תלוש הכיסוי על מדיום האוביפוזיציה כדי להקל על העברת עוברים מפני השטח של התווך אל סרט הדבק שעל הכיסוי. (D) עוברי P. maidis הם בצורת בננה, כאשר קצה אחד צר יותר מהשני (קצה צר מסומן בראש חץ אדום; קצה רחב יותר מסומן בראש חץ צהוב בעובר לדוגמה). הקצה הרחב של העובר צריך להיות ממוקם על הקלטת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 8: הזרקה. (A) משטח ההזרקה הוא צלחת פטרי מלאה עד גדותיה באגר 1%. יש להניח את הכיסוי עם רצועת סרט המחזיק עוברים ישירות על פני משטח פלטפורמת ההזרקה. (B) יש לבדוק את לחץ ההזרקה לפני הזרקת עוברים על ידי "הזרקת" כמות קטנה של תמיסת הזרקה לטיפת מים. שיטה זו יכולה לשמש גם בכל עת במהלך תהליך ההזרקה כדי לבדוק את המחט עבור סתימות. (C) יש להזריק עוברים על-ידי החדרת המחט לקצה הגדול יותר של העובר. פתרון ההזרקה צריך להיות גלוי אם ההזרקה היתה מוצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 9: טיפול לאחר הזרקה . (A) לאחר הזרקת כל העוברים שעל תלוש הכיסוי, יש להניח את הכיסוי בכלי פטרי טרי המכיל 1% אגרוז. (B) צלחת הפטרי עם הכיסוי יכולה להישמר בתא לחות (כמו זה המוצג) עד שהעוברים בוקעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 10: פנוטיפ נוקאאוט של PMW . (A) קבוצת ביקורת תואמת גיל ו-(B) עוברי נוקאאוט של Pmw , עם עיניים מתפתחות המסומנות על ידי ראשי חץ שחורים. העובר ב-B הוא פסיפס, שכן ניתן לראות פס קטן של פיגמנטציה. (C) בקרה תואמת גיל ו-(D) אבקועי נוקאאוט של Pmw , עם כניסות המראות זווית שונה על העיניים. גם האבקוע ב-D הוא פסיפס. חץ לבן מצביע על אזור בתמונה הראשית המציג אובדן פיגמנטציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 11: רצף נוקאאוט של PMW . (A) מודל בקנה מידה של Pmw mRNA, המסומן במרווחים של 500 bp, עם מיקומים של אתרי קישור gRNA מסומנים: G1, כחול; G2, צהוב; G3, ורוד. כל מוטציה של שינוי מסגרת שתיווצר בשלב זה תשבש את רוב תוצר התרגום. (B) הקשר גנומי של אתרי gRNA, כולם באקסון אחד (טקסט מודגש באותיות רישיות). אתרי איגוד קווי עזר מסומנים באותם צבעים כמו A, ורכיבי PAM מסומנים בקו תחתון. טווח הוא ~ 300 bp. התרגום בתוך מסגרת של האקסון מוצג לעיל, כקיצורים של אות אחת בטקסט ריש. מסומנים שני מוטיבים ספציפיים למובילי פיגמנטים בעין. מוטיב CDEPT של התחום הפונקציונלי Walker B מסומן בארגמן, ומוטיב IHQP של תחום H-loop מסומן בירוק. שני התחומים קריטיים לתפקוד טרנספורטר ATP. (C) אזור היעד של מבט לתקשורת פלסטינית הוגבר באמצעות שני סבבי PCR. המוצר בסבב השני נבדק על גבי ג'ל לעדות לשינוי גודל עקב הסרה מוצלחת של האזור בין המדריכים. נתיבים: L = 100 bp סולם; 1 = בקרת מים PCR; 2 = ביצים מוזרקות חיץ; 3-4 = שתי קבוצות נפרדות של ביצים המוזרקות בתערובת תלת מדריכה. רק עוברים שקיבלו את תערובת שלושת המנחים הפיקו הן את רצועת WT (חץ אדום) והן את הרצועה כתוצאה מכריתה מלאה (חץ לבן). (D) כדי לאשר את זהותה של הרצועה התחתונה (חץ לבן), דנ"א זה טוהר, שוכפל ורוצף. הקו העליון הוא הרצף הפראי. שני הקווים האחרים הם רצפים משני שיבוטים. שלושה שיבוטים נוספים התאימו לרצף התחתון. סימון כחול מציין את אתר הכריכה של מדריך 1, ואילו סימון ורוד מציין את אתר הכריכה של מדריך 3. בשני האללים נמחק כל האזור שבין שני אתרי ההדרכה הללו. קיצורים: Pmw = הגן הלבן Peregrinus maidis ; gRNA = רנ"א מנחה; PAM = מוטיב סמוך פרוטוספייסר; ATP = אדנוזין טריפוספט; PCR = תגובת שרשרת פולימראז; WT = סוג פראי; KO = נוקאאוט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

הצית	# של כוסות	# של נקבות בכל	# של ביצים								סה"כ # של ביצים
			יום 2	יום 3	יום 4	יום 5	יום 6	יום 7	יום 8	יום 9
1	10	15	0	26	166	355	530	193	91	37	1398
2	15	15	22	238	489	699	520	379	203	58	2608
3	8	15	0	57	230	190	116	80	34	1	708
4	10	15	0	226	446	519	301	179	24	15	1710
סך	43	15	23	547	1331	1763	1467	831	352	111	6483

טבלה 1: אוספי ביצים מייצגים מסביבת ביצית מלאכותית. נתונים מארבעה סטים של כוסות איסוף ביצים מוצגים, כאשר טליות הביצים מתחילות ביום השני לאחר ההתקנה ונמשכות עד היום התשיעי.

טיפול בהזרקה	סה"כ הזרקה	סה"כ פותח	סה"כ בקע	קצב פיתוח (%)	שיעור בקיעה (%)
מאגר	39	20	12	51	31
צרפת	39	24	14	61	36
Cas9 +Pmw gRNA	121	71	28	59	28

טבלה2: שיעורי הישרדות ונוקאאוט מזריקות של 3 תערובות הזרקה שונות.

דיון

איכות ותזונה של הטלת ביצים
לאחרונה, חוקרים שעבדו עם מין קרוב, Nilaparvata lugens, השיגו את הביצים שבהן השתמשו למיקרו-הזרקות ישירות מהעלה, ושמרו את הביצים המוזרקות ברקמת העלה עד שבקעו¹⁷. בעוד שיטה מבוססת עלים זו סיפקה סביבה טבעית יותר להתפתחות עוברית, היא גם הגדילה את הסיכויים לזיהומים ולנזק לביציות במהלך תהליך ההסרה. מערכת האוביפוזיציה המלאכותית המוצגת כאן מספקת סביבה אחידה יותר ומפחיתה את הסיכוי לנזק לביצים מהטיפול. על ידי הצבת כוסות האוביפוזיט ביום שישי, רוב הביצים שנאספו במהלך שבוע עבודה טיפוסי, לטובת אלה שביצעו את עבודת המיקרו-הזרקה. אזהרה אחת לשיטה זו, עם זאת, היא כי חוסר חומרים מזינים בתזונה 10% תמיסת סוכרוז ישפיע בסופו של דבר על בריאותם של החרקים, והנקבות בכוסות בדרך כלל מתחילות למות לאחר 10 ימים בלבד. גם איכות הביצים מתחילה לרדת לאחר 6 ימים, כפי שמעידה עלייה בביצים מתות או לא בריאות למראה. כתוצאה מכך, חשוב להיות סלקטיביים של הביצים המשמשות microinjections ולא לשמור על הנקבות לאחר יום 6.

שיעור הישרדות ולחות
נראה כי שני גורמים הם קריטיים להישרדות העובר באמצעות תהליך המיקרו-הזרקה. ההיבט המאתגר ביותר בטיפול בעוברי P. maidis הוא שמירה עליהם מפני התייבשות לאחר הסרתם ממדיום האוביפוזיציה ולאורך מיקרו-הזרקה. מכיוון שהביצים מוטלות בדרך כלל בתוך רקמת הצמח, חסרה להן קליפה מספקת למניעת התייבשות. אפילו במכסה המנוע הלח אבדו סטים שלמים של ביצים בגלל התייבשות. עם זאת, לחות גבוהה מדי עלולה להשפיע גם על המיקרו-הזרקות אם הצטברו מים על הסרט הדו-צדדי או על ההיקף. למרבה הצער, בדרך כלל לא היה קל להבחין בהתייבשות ביצים במהלך תהליך המיקרו-הזרקה, ולעתים קרובות הן נראו נורמליות עד יומיים או שלושה לאחר מכן, כאשר הן הפכו שקופות לחלוטין, ולא הראו סימני התפתחות.

נראה כי גם איכות המחטים משחקת תפקיד חשוב בהישרדות. המחט צריכה להיות משופעת כדי למזער נזק מיותר לביצה. כאשר המחט חסומה, שימוש בפונקציית הניקוי על המזרק תוך ליטוף עדין של קצה המחט עם מברשת צבע רטובה (ראה שלב 4.7) בדרך כלל מחזיר את המחט למצב תפקודי. בכל מקרה, מומלץ להכניס רק כמויות זעירות של תמיסת הזרקה (~0.25 μL) לכל מחט ולעבור למחט חדשה כל כמה שקופיות (~ 50-60 ביציות) כדי להבטיח שמירה על איכות המחט לאורך כל תהליך ההזרקה.

דור מוצלח של פנוטיפ נוקאאוט
כדי להפוך בהצלחה את תאי הנבט, מיקרו-זריקות עובר בדרך כלל צריך להיעשות מוקדם ככל האפשר לפני צלולריזציה. בהתאם למיני החרקים, חלון הזמן להשלמת המיקרו-הזרקות נע בין כמה שעות בלבד ליום שלם^14,15,20. עדיין לא ברור מתי עוברים עוברי P. maidis בצלולריזציה. נוקאאוט בתיווך Cas9 נבדק על עוברים בני 4 שעות לאחר הטלת ביצים (pel) עד 16 שעות pel, והפנוטיפים הצפויים נצפו בכל הניסויים, מה שמרמז על כך שכל המיקרו-הזרקות בוצעו בחלון הפרה-צלוריזציה.

אורתוטיפ P. maidis של הגן בצבע עיניים, לבן, נבחר מכיוון שפנוטיפ הנוקאאוט היה צפוי להיות קל לסינון בהזרקות בשל אופיו האוטונומי התא. ואכן, כצפוי, הן פסיפס והן נוקאאוט מוחלט היו ניתנים לזיהוי בבירור בקרב עוברים שקיבלו את תערובת ההזרקה המכילה Cas9 ורנ"א מנחה. למרבה הצער, לא בקעו מזריקים עם נוקאאוט מוחלט, והזדווגות המונית של מזריקים ששרדו לא הצליחה ליצור צאצאים לבני-עיניים. עם זאת, קו מוטנטי נוצר מאוחר יותר בהצלחה על ידי התמקדות בגן אחר (Klobasa et al., בתהליך). זה עשוי להצביע על כך שהכישלון לבסס קו מוטנטי לבן נובע ככל הנראה מהשפעות מחוץ למטרה (כלומר, Cas9 חותך אזורים חשובים במקומות אחרים בגנום) המייצרות מוטציה קטלנית הקשורה קשר הדוק, או מתפקיד קריטי בלתי צפוי עבור לבן ב- P. maidis.

נתונים פנוטיפיים ומולקולריים (איור 8 ואיור 9) מאשרים כי נוצר נוקאאוט משמעותי בלוקוס הלבן בדגימה של עוברים מוזרקים, מה שיגרום לאובדן מוחלט של תפקוד הגנים. יתר על כן, בעוד מוטציות בלבן הן בנות קיימא במינים מסוימים, יש תקדים לכך שפעילות לבנה מופחתת מזיקה^21,22. עם זאת, לא ניתן לשלול לחלוטין השפעות מחוץ למטרה. חיזוי סביר של מטרות מחוץ למטרות דורש נתוני רצף גנום מדויקים²³, מה שהמצב הנוכחי של המשאבים הגנומיים ב- P. maidis אינו מאפשר לבצע בשלב זה. בכל מקרה, עם שיטות חדשות אלה, בדיקת גני מטרה אחרים יכולה להיעשות בביטחון, אפילו לנוע לעבר טרנסגנזה מסורתית יותר במאמץ להביא כלים גנטיים חדשים למזיק מזיק זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיכלים של 1 גרם	Dart	P100N	מיכל למבוגרים להגדרת הטלת ביצים
15 מ"ל צינורות חרוטיים	Olympus	Genesee 28-103	משמש כצינור איסוף על מערך שואב ואקום
15 מ"ל צינורות חרוטיים	Olympus	Genesee 28-106	להכנת תמיסת סוקורוז 10% ולהחזקת מבוגרים בעת קירור לפני ההקרנה
Aspirator	Bioquip	1135A	לטיפול בצמחים
שואב ואקום	פישר טכני	LAV-3	ואקום לשאיבת מספר גדול יותר של חרקים
אורות LED ספקטרום כחול	הום דיפו	GLP24FS/19W/LED	אורות גידול לצמחי תירס בעציצים הופרים ניזונים מ-Cas9
	TrueCut Cas9 חלבון v2	A36498	אנדונוקלאז לחיתוך גנים של צמחים
ויניל שקופים	הום דיפו	3/8 אינץ' תעודת זהות x 1/2 אינץ' OD x 10 רגל	מחבר צינור איסוף למשאבה במערך שואב ואקום
מטעי תירס	אוניברסיטת צפון קרוליינה	סטייט N/A	בקשה מהמעבדה של ד"ר אנה ויטפילד
כדורי כותנה	Genessee	51-101	משמש כמסנן/לוכד חרקים בצינור איסוף על הגדרת שואב ואקום
סרט דו צדדי	סקוטש סרט דו צדדי	NA	מחזיק ביצים להזרקת מיקרו
זרעי	פארק תירס זוהר מוקדם	05093-PK-N	תירס לגידול צמחים
epTIPS טיפים למיקרו-מעמיס	Eppendorf	C2554691	מילוי חוזר טיפים לטעינת מחט
מערכת מיקרו-הזרקה Femtojet	Eppendorf	5247	שולט בלחץ ההזרקה (12-20 psi, תלוי בגודל קידוח המחט)
Nutri-Fly Drosophila Agar	Genessee	66-103	מצע לכל דבר מלבד צלחת הטלת ביצים
מלקחיים	עדיניםBioquip	4731	טיפול בביצים
לשימוש כללי LE Agarose	Apex	20-102	מצע בצלחת הטלת ביצים (מדיום הטלה)
מדריך RNA 1 - GGUCAUCGCAAAAUAGCAG	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 ננומול)	מדריכי RNA למיקוד white gene
Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 ננומול)	מדריכי RNA למיקוד planthopper white gene
Guide RNA 3 - GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU	Synthego	CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 ננומול)	מדריכי RNA למיקוד planthopper white gene
humidifyer	Homedics	UHE-CM45	להענקת לחות במכסה המנוע הלח
תא לחות	Billups-Rothenberg	MIC-101	להחזקת עוברים מוזרקים עד לבקיעת
כלובי גידול חרקים	Bioquip (הזמנה מיוחדת)	קרוב ל-1450 ליטר (בעל חזית פלסטיק ודפנות בד רשת)	כלוב לצמחים על תירס
מושך מיקרופיפיט מבוסס לייזר	מכשירי סאטר	P-2000/G	להכנת מחטי הזרקה / חום = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160
Leica M165 FC סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי	Leica	M165 FC	הקרנת Planthopper
מיקרו הזרקה היקף	Leica	MZ12-5	מיקרו הזרקה היקף מצויד עם XY שלב
מיקרומניפולטור	Narishige	MN-151	למיקום מחט מיקרו-הזרקה
מיקרופיפטה beveler	Sutter Instruments	FG-BV10-D	לשיפוע מחטי הזרקה / צלחת מדורגת 'עדינה' משומשת ב-20° זווית
שלב מיקרוסקופ	AmScope	GT100 X-Y שולחן גלישה	למיקום והזזת עוברים תחת מיקרוסקופ
מברשת צבע מיניאטורי	#2 8733	נמכר ב 3 חבילות 281206	מברשות צבע עדינות לטיפול בעוברים
מחזיק מחט	Narishige	HI-7	להחזקת מחט הזרקת
מיקרו חממת Percival Percival		I41VLH3C8	גידול מזרקים עד בקיעת
כלי פטרי (100 x 15 מ"מ)	VWR	89038-968	הכנת צלחת אגר להטלת ביצים
pGEM-T מערכת וקטור קלה I ערכת שיבוט	Promega	A1360	שיבוט pm white אתר יעד
פנול אדום	סיגמא	143-78-8	מאגר מיקרו-הזרקה
שקופיות מיקרוסקופ רגיל או כיסוי	פישר סיינטיפיק	12-549-3	להחזיק ביצים למיקרו-הזרקה
פלסמיד DNA ערכת מידי	Zymo	D4200	טיהור של DNA פלסמיד מוכן להזרקה
סרט פרפין פלסטיק	Pechiney אריזות פלסטיק	PM-996	גודל גליל 4 אינץ' x 125 רגל
עטיפת פלסטיק	Glad ClingWrap	NA	עטוף את כל תא הטלת הביצים
פריימר - PmW בדיקת CRISPR F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA	IDT	25 nmole DNA Oligo	פריימר סיבוב ראשון להגברה על פני אתר היעד בתוך הגן Pm white
פריימר - בדיקת PmW CRISPR R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGT	IDT	25 nmole DNA Oligo	פריימר סיבוב ראשון להגברה על פני אתר היעד בתוך הגן Pm white
פריימר - בדיקת PmW CRISPR F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC	IDT	25 nmole DNA Oligo	פריימר סיבוב שני להגברה על פני אתר היעד בתוך הגן Pm white
פריימר - בדיקת PmW CRISPR R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA	IDT	25 nmole DNA Oligo	פריימר סיבוב שני להגברה על פני אתר היעד בתוך הגן Pm white
נימי קוורץ	סאטר	QF100-50-10	להכנת מחטי מיקרו-הזרקה / OD 1 מ"מ, תעודת זהות 0.7 מ"מ, אורך 10 ס"מ
מסך (בד אורגנזה לבן)	Joann Fabrics	16023889	לכיסוי המיכל למבוגרים
Sparkleen	Fisher Scientific	04-320-4	שטיפת כלים
סוכרוז	פישר סיינטיפיק	BP220-1	להכנת תמיסת סוקורוז 10%