בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

סיכום

מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.

תקציר

הסתיידות של תאי שסתום אבי העורקים הוא סימן ההיכר של היצרות אבי העורקים והוא קשור פיברוזיס סף שסתום. תאים ביניים שסתום (VICs) לשחק תפקיד חשוב בתהליך הסתיידות היצרות אבי העורקים באמצעות ההפעלה של תוכנית הדיפרנציאציה שלהם לתאים דמויי אוסטאובלסט. עכבר VICs הם כלי במבחנה טובה עבור ההבהרה של מסלולי איתות המניעים מינרליזציה של תא שסתום אבי העורקים. השיטה המתוארת כאן, בשימוש מוצלח על ידי מחברים אלה, מסבירה כיצד להשיג תאים מבודדים טריים. הליך קולגנאז דו-שלטי בוצע עם 1 מ"ג/מ"ל ו-4.5 מ"ג/מ"ל. השלב הראשון הוא חיוני כדי להסיר את שכבת התא אנדותל ולהימנע כל זיהום. הדגירה השנייה של קולגנאז היא להקל על נדידת אח"מים מהרקמה לצלחת. בנוסף, נדון הליך הכתמת אימונופלואורסצנטיות לאפיון הפנוטיפ של תאי שסתום העכבר המבודדים. יתר על כן, בדיקת הסתיידות בוצעה במבחנה באמצעות הליך מדידת ריאגנט סידן והכתמה אדומה alizarin. השימוש בתרבית הראשית של תאי שסתום העכבר חיוני לבדיקת מטרות פרמקולוגיות חדשות לעיכוב מינרליזציה של תאים במבחנה.

מבוא

מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD) היא מחלת הלב valvular הנפוצה ביותר באוכלוסיות המערביות, המשפיעה על כמעט 2.5% מהקשישים מעל גיל^{65 .} CAVD משפיע על יותר משישה מיליון אמריקאים והוא קשור לשינויים בתכונות המכניות של העלונים הפוגעים בזרימת הדם הרגילה עד^1,2. נכון לעכשיו, אין טיפול תרופתי כדי לעצור את התקדמות המחלה או להפעיל רגרסיה מינרלית. הטיפול היעיל היחיד לטיפול CAVD הוא החלפת שסתום אבי העורקים על ידי ניתוח או החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter³. לכן חובה לחקור את המנגנונים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום כדי לזהות מטרות פרמקולוגיות חדשות. אכן, היצרות בוני העורקים שאינה מטופלת יש כמה השלכות שליליות כגון תפקוד לקוי החדר השמאלי ואי ספיקת לב⁴.

שסתום אבי העורקים מורכב משלוש שכבות המכונות פיברוסה, ספונגיוסה, חדרית, אשר מכילים VICs כמו סוג התא השולט⁵. הפיברוסה וה חדרית מכוסים בשכבה של תאי אנדותל וסקולריים (VECs)⁵. VECs לווסת את החדירות של תאים דלקתיים, כמו גם אותות paracrine. מתח מכני מוגבר עשוי להשפיע על שלמות VECs ולהפריע הומאוסטזיס של שסתום אבי העורקים, המוביל לפלישה לתא דלקתי⁶. סריקת ניתוחי מיקרוסקופיה אלקטרונים הראתה אנדותל משובש בשסתום אבי העורקים מסויד אנושי⁷.

ניתוחים היסטולוגיים של רקמה מסוידת חושפים את נוכחותם של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. יתר על כן, הבחנה אוסטאוגנית של VICs נצפתה הן במבחנה והן ברקמת שסתום אנושי⁸. תהליך זה מתוזמר בעיקר על ידי גורם שעתוק הקשורים גונט 2 (Runx2) ואת חלבונים מורפוגנטי עצם (BMPs)^8,9.

פרוטוקול

הערה: כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה איקאן בהר סיני הליבה המוסדית וועדת השימוש.

1. הכנה לפני בידוד תא שסתום מעכברים בוגרים

1. נקו ועקרו את כל המכשירים הכירורגיים המוצגים באיור 1A באמצעות 70% v/v אתנול ולאחר מכן תעבדו אותם אוטומטית למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
2. הוסף 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין ל 50 מ"ל של 10 מ"מ HEPES. הכן aliquot של 50 מ"ל של תמיסת מלח פוספט 1x חוצץ (PBS). שמור את הפתרונות על קרח.
3. הכן 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל פתרונות collagenase, ולהשתמש 5 מ"ל של כל פתרון בצינורות 15 מ"ל כדי לבצע את ההליך כולו. להכנת 5 מ"ל של קולגנאז מ"ג/מ"ל, יש לערבב 5 מ"ג קולגנאז עם 2.5 מ"ל של מדיום הנשר המעודכן (DMEM), סרום בקר עוברי (FBS) ללא) ו-2.5 מ"ל של 10 מ"ר HEPES בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין משלב 1.2). סנן את הפתרונות באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי להסיר כל זיהום.
   הערה: שמור את הפתרונות על הקרח כדי להגן על האנזימים.
4. חמם את פתרון DMEM ל- 37 °C (70 °F) לפני השימוש בכל השלבים המתוארים להלן. הכן מדיום מלא על ידי שכשהם DMEM עם 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1% נתרן פירובט, 5 מ"ל של 200 מ"ל L-גלוטמין, 1 מ"ל של ריאגנט חיסול מיקופלסמה (ראה טבלת החומרים),ו -10% FBS.

2. בידוד של תאי שסתום

1. כדי להשיג 10⁶ תאים לניסוי, השתמש בחמישה עכברים בני 8 שבועות (מינימום שלושה). מניחים את העכבר בתא אינדוקציה יחד עם פיסת נייר טישו קטנה ספוגה ב-1 מ"ל של איזופלוראן, אך אל תאפשרו מגע עם הרקמה. כדי לאשר כי החיה היא מרדים לחלוטין; בדוק אם יש רפלקס צביטת בוהן, ולאחר מכן להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם. השתמש isoflurane כדי להקל על כל כאב לפני פריקת צוואר הרחם כמו ההליך המתואר להלן הוא סופני.
2. הנח את העכבר על פלטפורמת ניתוח, ותקן את כפות הרגליים עם קנולס כדי להחזיק אותו במקומו. לנקות את החזה ואת הבטן עם אתנול; פתח את הבטן ואת החזה עם מספריים. עם מספריים כירורגיים קטנים, לחתוך בין האטריום השמאלי לחדר השמאלי כדי לחתוך את העכבר. לטפטף את הלב עם 10 מ"ל של PBS 1x קר כדי להסיר דם מהלב.
3. חותכים את הלב ושומרים על 3 מ"מ מאב העורקים העולה כפי שמוצג באיור 1B. לנתח את שסתום אבי העורקים תחת סטריאוטימיקורוסקופ. חותכים את הלב אופקית באמצע החדרים(איור 1C). חותכים את החדר השמאלי לכיוון אבי העורקים, וניתחו בזהירות את שסתום אביהעורקים (איור 1D-F). איחדו את השסתומים בצלחת תרבית רקמות קטנה של 35 מ"מ.
4. לשטוף את השסתומים המבודדים בצלחת תרבית תאים 75 מ"מ עם 5 מ"ל של HEPES קר (10 מ"מ) בתוספת אנטיביוטיקה (1% פניצילין-סטרפטומיצין) כדי להסיר דם(איור 2). הכן שני צינורות 15 מ"ל של collagenase 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל כפי שתואר לעיל בשלב 1.3.
   הערה: לאחר הניתוח, לתפעל את השסתומים המבודדים במכסה בטיחות ביולוגית סטרילי כדי למזער את הזיהום.
5. לדגור את השסתומים בסוג קולגנאז I (1 מ"ג/מ"ל) למשך 30 דקות ב 37 °C עם רעד מתמשך(איור 2). צנטריפוגות הצינור במשך 5 דקות ב 150 × גרם,לשטוף את הכדור פעם אחת עם 2 מ"ל של HEPES (10 מ"מ), ומערבולת עבור 30 s במהירות גבוהה. יוצקים את התוכן של צינור זה לתוך צלחת תרבות 35 מ"מ, ולהעביר בזהירות את שברי הרקמה באמצעות פינצטה דקה לתוך צינור חדש.
   הערה: בשלב זה, VICs עדיין לא מנותקים מהרקמה, והכדור מכיל חתיכות של רקמה. כדי למנוע זיהום עם תאי אנדותל, לא צנטריפוגה לאחר מערבולת בשלב 2.5.
6. לדגור את הכדור בצינור 15 מ"ל עם 5 מ"ל של קולגנאז סוג I (4.5 מ"ג / מ"ל) ב 37 °C תחת תסיסה מתמשכת במשך 35 דקות. להשעות מחדש את התאים עם פיפטה של 1 מ"ל כדי להפריד את התאים, וצנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
7. השלך את supernatant, ולהשעות מחדש את הכדור ב 2 מ"ל של DMEM מלא. צנטריפוגה ב 150 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F). חזור על שלב זה פעמיים כדי לנקות את התאים.
   הערה: לכדור עדיין יהיו כמה שברי רקמה.
8. להשעות מחדש את הכדור ב 1 מ"ל של מדיום מלא, צלחת את התאים בבאר אחת של צלחת תרבית תאים 6-well בכמות מינימלית של מדיום כדי להקל על ההתקשרות שלהם לצלחת התרבות. השאירו את התאים, ללא הפרעה, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
9. לאחר 3 ימים, בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאמת צמיחה טובה קרוב לפסולת הרקמה. ברגע ש-1,000 תאים נראים מתחת למיקרוסקופ, הסירו בזהירות את פסולת הרקמות עם פינצטה אוטומטית, ושנו את המדיום.
   הערה: אין להפריע לצלחת; אם לא נצפו מספר התאים הנדרש, הנח את צלחת תרבית התא בחזרה לאינקובטור למשך יומיים נוספים.
10. כאשר התאים הם 70% confluent (2.5 × 10⁵), טריפסיניזציה ולאחר מכן להעביר אותם צלחת תרבית רקמות 75 מ"מ.

3. ניתוח זהות התא והמורפולוגיה

הערה: כתמי אימונופלואורסצנטיות שימשו לחקר מורפולוגיה של תאים וזיהום תאי אנדותל.

1. נקה את מכסה המנוע עם 70% v / v / אתנול. מניחים כיסויים סטריליים (22 מ"מ x 22 מ"מ) בלוחות 6-well.
   הערה: כדי לעקר את כיסויים, לשטוף אותם עם 70% אתנול, ולשמור אותם בשכונה לילה תחת אור אולטרה סגול.
2. זרע 100,000 תאים לבאר בצלחת 6-בארות. לאחר 24 שעות, לשטוף את התאים פעמיים ב 1x PBS, ולתקן אותם ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות. לשטוף את התאים שוב פעמיים עם 1x PBS.
   הערה: בשלב זה, התאים יכולים להישמר PBS ב 4 °C (70 °F) עד תחילת הליך הכתם.
3. כדי לאמת את טוהר ה- VICs, השתמש באקטין שרירים חלק אלפא (αSMA), וימנטין ואשכול של בידול 31 (CD31) כדי לזהות זיהום עם VECs.
4. הכן aliquot של חיץ חסימה על ידי ערבוב 500 μL של סרום רגיל (אותו מין כמו הנוגדן המשני), 9.5 מ"ל של 1x PBS, ו 30 μL של טריטון X-100. לדגור על התאים ב 2 מ"ל של מאגר חסימה עבור 1 שעות.
5. הכן את מאגר דילול הנוגדנים המכיל 30 μL של טריטון X-100, 10 מ"ל של 1x PBS, ו 0.1 גרם של אלבומין סרום בקר (BSA).
6. קח קופסת טיפים ריקה, מלא חצי מהקופסה במים כדי ליצור תא לח. מכסים את מחזיק הקצה ברקמה רטובה ולאחר מכן עם גיליון של parafilm.
7. קח 1 μL של הנוגדן העיקרי, ולערבב אותו עם 100 μL של מאגר דילול מוכן בשלב 3.5. מניחים 50 μL של הנוגדן מדולל על parafilm. קח את כיסויים מן בארות, להפוך אותם, ומניחים אותם על החלק העליון של טיפות של נוגדן; לדגור על התאים בן לילה עם הנוגדן.
8. הוסף 1 מ"ל של PBS בצלחת 6-טוב. מוציאים בזהירות את כיסויי המכסה מהפרפילם, הופכים אותו ומניחים אותו בבאר. לשטוף את התאים עם עצבנות עדינה מתמשכת במשך 5 דקות. החלף את ה-PBS ב-PBS טרי; לשטוף את התאים 3 פעמים.
9. לדגור על התאים עם הנוגדן המשני מדולל (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) עבור 1 שעה. הוסף 1 μL של הנוגדן המשני ל 500 μL של מאגר דילול הנוגדנים (מוכן בשלב 3.5). מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום. לשטוף את התאים 3 פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS עם תסיסה מתמשכת.
10. הר את כיסויי עם 50 μL של 4′,6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) הרכבה בינונית, ולצפות בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לנתח את המורפולוגיה של תאים וזיהום VEC.

4. במבחנה הסתיידות

1. נקה את מכסה המנוע עם 70% אתנול, חמם את ה- DMEM בינוני עד 37 °C (77 °F).
2. זרע 100,000 תאים /מצב לתוך לוחות 6-בארות ב- DMEM מלא, ותרבות עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F).
3. הכן את המדיום הסתיידות על ידי ערבוב 2 mM של NaH₂PO_4,10^-7 M אינסולין, ו 50 מיקרוגרם / מ"ל חומצה אסקורבית ב- DMEM עם 5% FBS. עבור 93 מ"ל של DMEM, להוסיף 5 מ"ל של FBS, 1 מ"ל של אנטיביוטיקה (ריכוז סופי 1%), 1 מ"ל של נתרן פירובט (100 mM), 27.5 מ"ג של NaH₂PO_4, 5.8 μL של אינסולין, ו 5 מ"ג של חומצה אסקורבית.
   הערה: סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
4. לאחר 24 שעות, להחליף את המדיום supernatant עם מדיום הסתיידות. לדגור על התאים במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F). ביום^{השלישי,} להחליף עם מדיום הסתיידות טרי, ומניחים את הצלחת בחזרה בחממה כדי להשלים את 7 ימי הטיפול.
5. לאחר 7 ימים, להסיר את המדיום, לשטוף את התאים פעמיים עם 2 מ"ל של 1x PBS. לדגור על התאים 1 מ"ל של 0.6 N חומצה הידרוכלורית (HCl) עבור 24 שעות ב 37 °C (7 °F). לאסוף את HCl בצינור 1.5 מ"ל, ולאדות אותו מאיד סיבובי. להשעות מחדש את התוכן של כל הצינורות ב 60 μL של HCl.
   הערה: הליך הייבוש חשוב לרכז את הפתרון ולהשתתפות באותו נפח עבור כל תנאי.
6. השתמש בצלחת 96 באר כדי למדוד ריכוז סידן באמצעות ריאגנט Arsenazo III, זמין בערכה מוכנה לשימוש (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים נוספים).
7. הכן פתרון סטנדרטי סידן של 10 מ"ג / ד"ל ריכוז. שוקלים 10 מ"ג סידן הידרוקסיד (Ca(OH)₂) ומתמוססים ב-100 מ"ל של מים מזוקקים.
8. בצלחת ברורה של 96 באר, צינור 2 μL של פתרון ריק (HCl, 0.6 N), הפתרון הסטנדרטי, המדגם לבאר (10 מ"ג / ד"ל), ואת הדגימות. בצע את הניסוי במשולש כדי לאמת את השונות בצינורות. הוסף 200 μL של ריאגנט עבור כל תנאי.
   הערה: דגימות מעל 15 מ"ג / ד"ל צריך להיות מדולל 1:1 עם מלוחים, re-assayed, ואת התוצאה מוכפלת על ידי שניים.
9. לדגור על התגובה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: התגובה יציבה במשך 60 דקות.
10. קרא ותיעד את ספיגת הצלחת ב 650 ננומטר. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את כמות הסידן בדגימות:
    סידן (מ"ג/מ"ל) = (ספיגה של מדגם/ספיגה של תקן) × ריכוז סטנדרטי

תוצאות

כמו שסתומי אבי העורקים מורין הם בדרך כלל 1 מ"מ קוטר, לפחות שלושה שסתומים חייב להיות מלומה כדי לאסוף מיליון תאים קיימא עבור הליכים ניסיוניים שונים. השלבים השונים של תהליך הבידוד של VIC מוצגים באיור 1 ובאיור 2. כפי שקשה לגרד באופן ידני את רקמת השסתום, עדיף להשתמש מתח גמירה שנוצר על ידי מערבולת כדי להסיר את VECs. ואכן, תוצאות הכתמת האימונופלואורסצנטיות של CD31 הראו היעדר זיהום תאי אנדותל(איור 3D). בנוסף, מחשבי מעכבר מבטאים וימנטין ו- α...

דיון

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של בידוד תא שסתום עכבר עבור התרבות הראשית. שלושה שסתומי אבי העורקים מעכברים בני 8 שבועות אוגדו כדי להשיג מספר מספיק של תאים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את האפיון של פנוטיפ VIC ואת in vitro mineralization assay. השיטה הותאמה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן מאתיו ואח^'7.

במהלך הבידוד של שסתומי אבי העורקים, יש לנקוט זהירות כדי למנוע את כל מקורות ההדבקה האפשרית כדי להגן על התאים מפני זיהום חיידקי או mycoplasma. ואכן, חיוני לכלכל את כל הכ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
3 מ"מ מספריים קצה חיתוך	FST	15000-00
אנטי אלפא שריר חלק נוגדן
נגד עכבר, Alexa Fluor 488 איתות	תאים	4412
סט מגיב Arsenazo-III POINT	SCIENTIFIC	C7529-500	ערכה למדידת ריכוז מספריים
סידן בון	FST	14184-09
סידן הידרוקסיד	SIGMA -Aldrich 31219	31219
CD31	Novusbio
קולגנאז מסוג I  (125 יחידות/מ"ג)	Thermofisher Scientific	17018029
DMEM	Tthermofisher	11965092
מלקחיים עדינים במיוחד	F.S.T	11150-10
FBS	Gibco 16000044
מלקחיים עדינים	F.S.T Dumont
HCl	SIGMA-ALDRICH	H1758
HEPES 1 M תמיסת	תאי גזע טכנולוגיות
L-גלוטמין 100x	Thermofisher Scientific	A2916801
Mycozap	Lanza	VZA-2011	מגיב חיסול מיקופלזמה
PBS 10x	SIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100x	Thermofisher Scientific	10378016
נתרן פירובט 100 מ"מ	Thermofisher Scientific
מלקחיים בתבנית סטנדרטית	FST	11000-12
מספריים כירורגיים - חד-קהה	FST	14008-14
טריפסין 0.05%	Thermofisher Scientific	25300054
Vimentin	abcam