מאמר שיטה

בידוד של תאי שסתום ביניים עכבר ללמוד את הסתיידות של שסתום אבי העורקים במבחנה

DOI:

10.3791/62419

⸱

10 במאי 2021

 , 
1Cardiovascular Research Center, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Diabetes, Obesity and Metabolism Institute, Department of Medicine, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Graduate School of Biomedical Sciences, The Icahn School of Medicine at Mount Sinai

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את הבידוד של תאי שסתום אבי העורקים עכבר על ידי הליך collagenase דו שלבי. תאי שסתום עכבר מבודדים חשובים לביצוע מבדקים שונים, כגון בדיקה זו של הסתיידות במבחנה, ולחקירת המסלולים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום אבי העורקים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסתיידות של תאי שסתום אבי העורקים הוא סימן ההיכר של היצרות אבי העורקים והוא קשור פיברוזיס סף שסתום. תאים ביניים שסתום (VICs) לשחק תפקיד חשוב בתהליך הסתיידות היצרות אבי העורקים באמצעות ההפעלה של תוכנית הדיפרנציאציה שלהם לתאים דמויי אוסטאובלסט. עכבר VICs הם כלי במבחנה טובה עבור ההבהרה של מסלולי איתות המניעים מינרליזציה של תא שסתום אבי העורקים. השיטה המתוארת כאן, בשימוש מוצלח על ידי מחברים אלה, מסבירה כיצד להשיג תאים מבודדים טריים. הליך קולגנאז דו-שלטי בוצע עם 1 מ"ג/מ"ל ו-4.5 מ"ג/מ"ל. השלב הראשון הוא חיוני כדי להסיר את שכבת התא אנדותל ולהימנע כל זיהום. הדגירה השנייה של קולגנאז היא להקל על נדידת אח"מים מהרקמה לצלחת. בנוסף, נדון הליך הכתמת אימונופלואורסצנטיות לאפיון הפנוטיפ של תאי שסתום העכבר המבודדים. יתר על כן, בדיקת הסתיידות בוצעה במבחנה באמצעות הליך מדידת ריאגנט סידן והכתמה אדומה alizarin. השימוש בתרבית הראשית של תאי שסתום העכבר חיוני לבדיקת מטרות פרמקולוגיות חדשות לעיכוב מינרליזציה של תאים במבחנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת שסתום אבי העורקים מסוידת (CAVD) היא מחלת הלב valvular הנפוצה ביותר באוכלוסיות המערביות, המשפיעה על כמעט 2.5% מהקשישים מעל גיל65 . CAVD משפיע על יותר משישה מיליון אמריקאים והוא קשור לשינויים בתכונות המכניות של העלונים הפוגעים בזרימת הדם הרגילה עד1,2. נכון לעכשיו, אין טיפול תרופתי כדי לעצור את התקדמות המחלה או להפעיל רגרסיה מינרלית. הטיפול היעיל היחיד לטיפול CAVD הוא החלפת שסתום אבי העורקים על ידי ניתוח או החלפת שסתום אבי העורקים transcatheter3. לכן חובה לחקור את המנגנונים המולקולריים המובילים מינרליזציה שסתום כדי לזהות מטרות פרמקולוגיות חדשות. אכן, היצרות בונ....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי בית הספר לרפואה איקאן בהר סיני הליבה המוסדית וועדת השימוש.

1. הכנה לפני בידוד תא שסתום מעכברים בוגרים

  1. נקו ועקרו את כל המכשירים הכירורגיים המוצגים באיור 1A באמצעות 70% v/v אתנול ולאחר מכן תעבדו אותם אוטומטית למשך 30 דקות. נקו את סביבת העבודה הכירורגית עם 70% אתנול.
  2. הוסף 500 μL של פניצילין-סטרפטומיצין ל 50 מ"ל של 10 מ"מ HEPES. הכן aliquot של 50 מ"ל של תמיסת מלח פוספט 1x חוצץ (PBS). שמור את הפתרונות על קרח.
  3. הכן 1 מ"ג / מ"ל ו 4.5 מ"ג / מ"ל פתרונות collagenase, ולהשתמש 5 מ"ל של כל פתרון בצינורות 15 מ"ל כדי לבצע את ההליך כולו. להכנת 5....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כמו שסתומי אבי העורקים מורין הם בדרך כלל 1 מ"מ קוטר, לפחות שלושה שסתומים חייב להיות מלומה כדי לאסוף מיליון תאים קיימא עבור הליכים ניסיוניים שונים. השלבים השונים של תהליך הבידוד של VIC מוצגים באיור 1 ובאיור 2. כפי שקשה לגרד באופן ידני את רקמת השסתום, עדיף להשתמש מתח גמירה שנוצר על ידי מערבולת כדי להסיר את VECs. ואכן, תוצאות הכתמת האימונופלואורסצנטיות של CD31 הראו היעדר זיהום תאי אנדותל(איור 3D). בנוסף, מחשבי מעכבר מבטאים וימנטין ו- α.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של בידוד תא שסתום עכבר עבור התרבות הראשית. שלושה שסתומי אבי העורקים מעכברים בני 8 שבועות אוגדו כדי להשיג מספר מספיק של תאים. בנוסף, פרוטוקול זה מתאר את האפיון של פנוטיפ VIC ואת in vitro mineralization assay. השיטה הותאמה מהפרוטוקול שתואר קודם לכן מאתיו ואח'7.

במהלך הבידוד של שסתומי אבי העורקים, יש לנקוט זהירות כדי למנוע את כל מקורות ההדבקה האפשרית כדי להגן על התאים מפני זיהום חיידקי או mycoplasma. ואכן, חיוני לכלכל את כל הכ.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3 מ"מ מספריים קצה חיתוךFST15000-00
אנטי אלפא שריר חלק נוגדן
נגד עכבר, Alexa Fluor 488 איתותתאים4412
סט מגיב Arsenazo-III POINTSCIENTIFICC7529-500ערכה למדידת ריכוז מספריים
סידן בוןFST14184-09
סידן הידרוקסידSIGMA -Aldrich 3121931219
CD31Novusbio
קולגנאז מסוג I  (125 יחידות/מ"ג)Thermofisher Scientific17018029
DMEMTthermofisher11965092
מלקחיים עדינים במיוחדF.S.T11150-10
FBSGibco 16000044
מלקחיים עדיניםF.S.T Dumont
HClSIGMA-ALDRICHH1758
HEPES 1 M תמיסתתאי גזע טכנולוגיות
L-גלוטמין 100xThermofisher ScientificA2916801
MycozapLanzaVZA-2011מגיב חיסול מיקופלזמה
PBS 10xSIGMA-ALDRICH
penecillin streptomycin 100xThermofisher Scientific10378016
נתרן פירובט 100 מ"מThermofisher Scientific
מלקחיים בתבנית סטנדרטית  FST11000-12
מספריים כירורגיים - חד-קההFST14008-14
טריפסין 0.05%Thermofisher Scientific25300054
Vimentinabcam
אקטין מצומד 11360070

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rostagno, C. Heart valve disease in elderly. World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).
  2. Stewart, B. F., et al. Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study. Journal of the Amer....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Aortic Valve CalcificationValve Interstitial CellsMouse Valve CellsCell IsolationCollagenase DigestionCalcification AssayImmunofluorescence StainingAlizarin Red StainingCalcium MeasurementAortic Stenosis

מאמרים קשורים