פרוטוקול זה מתאר את איסוף המסתמים האאורטליים האנושיים המופקים במהלך הליכים כירורגיים להחלפת מסתם אבי העורקים או מרקמה קדבורית, ואת הבידוד, ההרחבה והאפיון שלאחר מכן של תאי אנדותל ותאי אינטרסטיציאליים ספציפיים למטופל. כלולים פרטים חשובים לגבי התהליכים הדרושים כדי להבטיח את הכדאיות של התא ואת הספציפיות הפנוטיפית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד תאי שסתום ראשוניים אנושיים למידול מחלות חוץ גופיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלת מסתם אבי העורקים (CAVD) קיימת בכמעט שליש מאוכלוסיית הקשישים. עיבוי, התקשות והסתיידות של מסתם אבי העורקים גורמים להיצרות אבי העורקים ותורמים לאי ספיקת לב ולשבץ. פתוגנזה של מחלות היא רב-גורמית, ולחצים כגון דלקת, שיפוץ מטריצה חוץ-תאית, זרימה טורבולנטית ולחץ מכני ומתח תורמים להתמיינות אוסטאוגנית של תאי אנדותל ומסתם אינטרסטיציאליים. עם זאת, הגורמים היוזמים המדויקים המניעים את המעבר האוסטיאוגני של תא בריא לתא מסתנן אינם מוגדרים במלואם. יתר על כן, הטיפול הנוכחי היחיד להיצרות אבי העורקים המושרה על ידי CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים, לפיה מסירים את המסתם המקורי (החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי, SAVR) או מוחדר מסתם חלופי הניתן לכיווץ מלא באמצעות קטטר (החלפת מסתם אבי העורקים, TAVR). הליכים כירורגיים אלה באים בעלות גבוהה ועם סיכונים חמורים; לפיכך, זיהוי מטרות טיפוליות חדשניות לגילוי תרופות הוא הכרחי. לשם כך, המחקר הנוכחי מפתח זרימת עבודה שבה רקמות שהוסרו בניתוח מחולים ורקמות של תורמים משמשות ליצירת קווים ראשוניים ספציפיים למטופל של תאים valvular עבור מודלים של מחלות חוץ גופיות. פרוטוקול זה מציג את השימוש בתמיסת אחסון קרה, המשמשת בדרך כלל בהשתלת איברים, כדי להפחית את הנזק הנגרם על ידי זמן הרכש הממושך לעתים קרובות בין כריתת רקמות לעיבוד במעבדה עם היתרון של ייצוב רב של התאים של הרקמה שנכרתה. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי תאי מסתמים מבודדים שומרים על יכולת ההתרבות שלהם ועל פנוטיפים אנדותליאליים ואינטרסטיציאליים בתרבית למעלה מכמה ימים לאחר הסרת המסתם מהתורם. השימוש בחומרים אלה מאפשר איסוף של תאי בקרה ו-CAVD, שמהם נקבעים קווי תאי בקרה וחולי.
מבוא
מחלת מסתם אבי העורקים קלציפית (CAVD) היא פתולוגיה כרונית המאופיינת בדלקת, פיברוזיס ומקרוקלציפיקציה של עלוני מסתם אבי העורקים. שיפוץ מתקדם והסתיידות של העלונים (המכונים טרשת אבי העורקים) עלולים להוביל לחסימת זרימת הדם (היצרות אבי העורקים) התורמת לשבץ מוחי ומובילה לאי ספיקת לב. כיום הטיפול היחיד ב- CAVD הוא החלפת מסתם אבי העורקים כירורגי או טרנסקטטר (SAVR ו- TAVR, בהתאמה). אין אפשרות לא ניתוחית לעצור או להפוך את התקדמות CAVD, וללא החלפת מסתם, שיעורי התמותה מתקרבים ל -50% תוך 2-3 שנים 1,2,3. הגדרת המנגנונים הבסיסיים המניעים פתולוגיה זו תזהה גישות טיפוליות חדשניות פוטנציאליות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל דגימות המטופלים נאספות מאנשים שנרשמו למחקרים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פיטסבורג בהתאם להצהרת הלסינקי. רקמות קדבוריות שהושגו באמצעות המרכז להתאוששות איברים וחינוך (CORE) אושרו על ידי הוועדה לפיקוח על מחקר והכשרה קלינית של אוניברסיטת פיטסבורג המערבת נפטרים (CORID).
1. אישור ובטיחות
- קבל אישור של מועצת הביקורת המוסדית (IRB) או תזכיר פטור לכל אוסף של דגימות מטופלים או רקמות קדבוריות בהתאם להצהרת הלסינקי.
- קח הכשרה מוסדית נדרשת כדי לעבוד עם רקמות אנושיות כגון אימון פתוגנים הנישאים בדם, מחקר ביו-רפואי בנושאים אנושיים, פרטיות ואבטחת מידע, והובלה ומשלוח של חומרים ביולוגיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקול הנ"ל מתאר את השלבים הדרושים לטיפול ברקמות שסתום אנושיות ולבידוד והקמת קווי תאים בני קיימא מרקמות אלה. עלונים של מסתם אבי העורקים מעובדים להטמעת פרפין, מוקפאים לאחסון לטווח ארוך לצורך ניתוח ביוכימי או גנטי ומתעכלים לבידוד של VECs ו-VICs (איור 1). בעוד שלדגימות כירורגיות תהיה ככל הנראה אבחנה קלינית של היצרות אבי העורקים והן עשויות להפגין גושים כבדים של הסתיידות שניתן לראות בעין בלתי, הסתיידות מסתם אבי העורקים קיימת במספר משמעותי של אנשים קשישים (בני >65)בני 32
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השגת שליטה ורקמות מחלה מבני אדם היא קריטית עבור מודלים של מחלות in vitro ו- ex vivo; עם זאת, בעוד שלעתים קרובות מדברים על האתגרים של גישור על הפער בין ספסל למיטה, הסדר ההפוך - מעבר מסוויטת הניתוחים לספסל - הוא לעתים קרובות לא פחות מרתיע. חיוני עבור מדען בסיסי כדי להשיג דגימות רקמות אנושיות ראשוניות הוא שיתוף פעולה עם מדען מנתח מושקע שיש לו צוות של אחיות, טכנאי כירורגיה, עוזרי רופא, סטודנטים לרפואה ומתמחים, ומנהלי פרוטוקולים קליניים שיכולים לרשום ולהסכים לחולים, להשתתף ולסייע בטיפול נכון ברקמות שנכרתו, ולתאם את הלוגיסטיקה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
דאע"ש מקבלת תמיכה מחקרית מוסדית מ-Atricure וממדטרוניק ומשמשת כיועצת עבור מדטרוניק וסקולרי. אף אחד מהקונפליקטים הללו אינו קשור לעבודה זו. לכל שאר הכותבים אין מה לחשוף.
תודות
ברצוננו להודות לג'ייסון דובינס על דיון מעמיק וקריאה ביקורתית של כתב יד זה. ברצוננו להודות למרכז לשיקום איברים וחינוך על עזרתם ותמיכתם ולהודות לתורמי רקמות ולמשפחותיהם על שאפשרו מחקר זה. כל דגימות המטופלים נאספות מאנשים שנרשמו למחקרים שאושרו על ידי ועדת הביקורת המוסדית של אוניברסיטת פיטסבורג בהתאם להצהרת הלסינקי. רקמות קדבוריות שהושגו באמצעות המרכז להתאוששות איברים וחינוך (CORE) אושרו על ידי הוועדה לפיקוח על מחקר והכשרה קלינית של אוניברסיטת פיטסבורג המערבת נפטרים (CORID).
כמה דמויות שנוצרו עם Biorender.com.
CSH נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם K22 HL117917 ו- R01 HL142932, איגוד הלב האמריקאי 20IPA35260111.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m filter | Thermo Scientific | 7211345 | הכנת צלחת עם ציפוי קולגן |
| 10 ס"מ צלחת תרבית תאים | Greiner Bio-One | 664160 | תרבית תאים/הרחבת קו תאים |
| 10 מ"ל פיפט סרולוגי | פישר | 14955234 | בידוד VEC/VIC, תרבית תאים, הרחבת קו תאים |
| 1000 μ טיפים לסנן L | VWR | 76322-154 | תרבית תאים/הרחבת קו תאים |
| 10XL טיפים לסנן | VWR | 76322-132 | תרבית תאים/הרחבת קו תאים |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים | Thermo Scientific | 339650 | אחסון רקמות, בידוד VIC/VEC |
| 16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 15710S | קיבוע רקמות ותאים |
| 190 הוכחה אתנול | דקון | 2801 | חיטוי |
| 1x DPBS: ללא סידן, ללא מגנזיום | Gibco | 14190250 | תמיסת מלח. בידוד VIC/VEC |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | תמיסת מלח. הכנת רקמות, בידוד VIC/VEC |
| 20 ו-mu; טיפים לסנן L | VWR | 76322-134 | תרבית תאים/הרחבת קו תאים |
| 200 הוכחה אתנול | Decon | 2701 | דגימות רקמה דה-פרפיניזציה |
| 2-פרופנול | פישר | A416P 4 | הכנת צלחות מצופות קולגן |
| 5 מ"ל פיפט סרולוגי | פישר | 14955233 | בידוד VEC/VIC, תרבית תאים, הרחבת קו תאים |
| 50 מ"ל צינורות חרוטיים | תרמו 339652 מדעי | אחסון רקמות, בידוד VIC/VEC | |
| צלחת 60 מ"מ | GenClone | 25-260 | בידוד VEC |
| צלחת תרבית תאים 6 בארות | Corning | 3516 | הרחבת תרבית תאים/קו תאים |
| חומצה אצטית, קרחון | פישר | BP2401 500 | הכנת צלחות מצופות קולגן |
| AlexaFluor 488 פלואידין | Invitrogen | A12379 | פלואורסצנטי f-actin כתמים נגד |
| Belzer UW פתרון השתלת אחסון קר | גשר לחיים | BUW0011L | פתרון אחסון רקמות |
| סרום בקר אלבומין, Fraction V - ללא חומצות שומן 25 גרם | Bioworld | 220700233 | אישור VEC עם נוגדן CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 | Abcam | ab46794 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי ל-VIC) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | איתות תאים | 3528 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי ל-VEC) |
| CD31+ אישור Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC עם CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי ל-VEC) |
| מסננת תאים עם 0.70 μ m נקבוביות קורנינג | 431751 | בידוד VIC | |
| קולגן 1, חלבון זנב עכברוש | Gibco | A1048301 | הכנת צלחות מצופות |
| קולגן קולגנאז II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | עיכול רקמות. הכנת רקמות, בידוד VIC/VEC |
| Conflikt תרסיס חיטוי מוכן לשימוש | דקון | 4101 | חיטוי |
| Countess II דלפק תאים אוטומטי | Invitrogen | A27977 | מונה תאים אוטומטי |
| Countess II כיסויי שקופיות לשימוש חוזר | Invitrogen | 2026h | מונה תאים אוטומטי נדרש כיסוי שקופיות |
| Coverslips | Fisher | 125485E | דגימות שסתום הרכבה |
| בקבוקונים קריוגניים | Olympus Plastics | 24-202 | הקפאת תאים/דגימות רקמות |
| אקונומיקה מחטא עם CLOROMAX - נוסחה מרוכזת | חיטוי קלורוקס | N/A | |
| DMEM | Gibco | 10569044 | אמצעי גידול. הרחבת VIC |
| EBM - מדיום תאי אנדותל, מדיום בסיסי, פנול אדום חופשי 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | מדיית גידול. הרחבת VEC |
| EGM-2 תא אנדותל בינוני-2 - ערכת 1 ערכת SingleQuot Lonza | Walkersville | CC4176 | תוסף מדיה לצמיחה. הרחבת |
| VEC EVOS FL Microscope | Life Technologies | מספר דגם: AME3300 | הדמיה פלואורסצנטית |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | הדמיית תאים במהלך הרחבת קו התאים |
| סרום בקר עוברי - Premium Select | R& D Systems | S11550 | הרחבת VIC |
| מספריים עדינים | כלי מדע עדינים | 14088-10 | הכנת רקמות, בידוד VIC / VEC |
| מגרדי תאים פישרברנד | פישר | 08-100-241 | הרחבת VIC |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | אנטי פטרייתי: הכנת רקמות, בידוד VIC / VEC |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | אנטיביוטיקה: הכנת רקמות, בידוד VIC/VEC |
| שקופיות זכוכית | גלובוס סיינטיפיק בע"מ | 1358L | דגימות שסתום הרכבה |
| עיזים נגד עכבר 488 | Invitrogen | A11001 | נוגדן משני פלואורסצנטי |
| עיזים נגד עכבר 594 | Invitrogen | A11005 | נוגדן משני פלואורסצנטי |
| עיזים נגד ארנב 488 | Invitrogen | A11008 | פלואורסצנטי נוגדן משני |
| עיזים אנטי ארנב 594 | Invitrogen | A11012 | נוגדן משני פלואורסצנטי |
| Invitrogen Countess II FL שקופיות לשימוש חוזר | Invitrogen | A25750 | מונה תאים אוטומטי נדרש שקופית |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM - 2X מדיה לשימור הקפאה עבור תאי גזע | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | אחסון תאים קפואים |
| הרכבה בינוני | פישר כימי Permount | SP15-100 | דגימות שסתום הרכבה |
| מר מיכל הקפאה קפוא מיכל | Nalgene | 51000001 | להקפאת מדגם מבוקרת |
| Mycoplasma-ExS ספריי | PromoCell | PK-CC91-5051 | חיטוי |
| פניצילין-סטרפטומיצין | Gibco | 15140163 | אנטיביוטי. הרחבת VIC |
| פלסמוצין | Invivogen | ANTMPT | אנטי-מיקופלזמה. בידוד והרחבה של VIC/VEC |
| נוגדן SM22a | Abcam | ab14106 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי ל-VIC) |
| מספריים בתבנית Sstandard | Fine Science Tools | 14001-14 | הכנת רקמות, בידוד VIC/VEC |
| ספוגית כותנה סטרילית | פוריטן | 25806 10WC | בידוד VEC |
| קלטת רקמות אנושיות Swingsette | Simport Scientific | M515-2 | מיכל הטמעת רקמות |
| מלקחיים טיילור (17 ס"מ) | Fine Science Tools | 11016-17 | הכנת רקמות, בידוד VIC/VEC |
| תמיסת טריפן כחולה, תמיסת | ספירת תאים | 15250061 | Gibco |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | פיצול VIC/VECs |
| ערכת Von Kossa | Polysciences | 246331 | צביעת קטעי פרפין ברקמות להסתיידות |
| פון ווילברנד פקטור נוגדן | Abcam | ab68545 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי VEC) |
| קסילנים | פישר כימיקל | X3S-4 | דגימות רקמה דפראפיניזציה |
| &אלפא;נוגדן SMA | Abcam | ab7817 | נוגדן ראשוני (כתם חיובי ל-VIC) |
מקורות
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
