מאמר שיטה

ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

DOI:

10.3791/62457

⸱

1 באפריל 2021

 ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Medicine (Hepatology), Albert Einstein College of Medicine, 3Einstein-Mount Sinai Diabetes Research Center, Albert Einstein College of Medicine, 4Marion Bessin Liver Research Center, Albert Einstein College of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סרטן הכבד הוא כיום הגורם השלישי המוביל למוות הקשור לסרטן ברחבי העולם, וקרצינומה הפטוצלולרית (HCC) מהווה 75-90% מכלל מקרי סרטן הכבד. עם כניסתם של טיפולים יעילים למניעה וטיפול בהפטיטיס B/C, מחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), והצורה האגרסיבית יותר הידועה בשם סטאטוהפטיטיס לא אלכוהולית (NASH), הופכים במהירות לגורמי הסיכון מספר אחת לפתח HCC בחברות מודרניות. כדי להבין טוב יותר את התפקיד שיש ל-NASH בפיתוח HCC, עיצבנו דג זברה HCC הקשור ל-NASH. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי דגי הזברה הופכות אותם למודל מושך ורב עוצמה לחקר המיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון באמצעות הדמיה חיה פלואורסצנטית לא פולשנית. פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש במודל דגי זברה HCC הקשור ל-NASH כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול במיקרו-סביבה של הכבד ואת השפעתו על הרכב תאי מערכת החיסון בשלבים המוקדמים של המחלה. ראשית, אנו מזינים זחלי HCC (s704Tg), המבטאים בטא-קטנין פעיל ספציפי להפטוציטים, עם תזונה של 10% כולסטרול גבוה במשך 8 ימים כדי לפתח מודל HCC הקשור ל-NASH. כאן נתאר כיצד לעשות שימוש בקווים מהונדסים שונים כדי להעריך מספר תכונות ממאירות מוקדמות בכבד על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית, כגון אזור הכבד, התא והמורפולוגיה הגרעינית (אזור הפטוציטים, אזור גרעיני, יחס גרעיני:ציטופלסמי (יחס N:C), מעגליות גרעינית, ניקוד מיקרו-גרעיני/פריצה גרעינית) ואנגיוגנזה. לאחר מכן, באמצעות קווים מהונדסים עם תאי חיסון מתויגים (נויטרופילים, מקרופאגים ותאי T) אנו מראים כיצד לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בכבד בזחלי HCC הקשורים ל-NASH. הטכניקות המתוארות שימושיות להערכת מיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון בשלבים מוקדמים של הפטוקרצינוגנזה, אך ניתן גם לשנות אותן כדי לחקור תכונות כאלה במודלים אחרים של מחלות כבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קרצינומה הפטוצלולרית (HCC) היא סרטן אגרסיבי עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות. נמצא כי למעלה מ-30% מכלל החולים עם HCC סובלים מהשמנת יתר וסובלים מ-NASH, צורה אגרסיבית של NAFLD 1,2,3,4. צריכת דיאטות עשירות בקלוריות מגדילה באופן דרסטי את זמינות חומצות השומן הגורמת לשינויים מטבוליים מקומיים ומערכתיים ומעוררת סטאטוזיס, פגיעה בהפטוציטים, דלקת ופיברוזיס - כולם מאפיינים מרכזיים של NASH. התקדמות NASH ל-HCC כרוכה בהצטברות של שומנים בכבד, מה שמעורר דלקת ושינוי בהרכב תאי מערכת החיסון 5,6,7. מעניין וחשיבות מיוחדת להבין כיצד המיקרו-סביבה של הכבד ונוף תאי מערכת החיסון משתנים במהלך התקדמות מחלת הכבד, וכיצד היא משתנה עקב גורמים אטיולוגיים מסוימים. כדי לזהות טוב יותר את ההשפעה שיש לעודף כולסטרול על מיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון, פיתחנו מודל ייחודי של דגי זברה הקשורים ל-HCC הקשור ל-NASH. השימוש במודל זה נתן לנו הבנה טובה יותר של ההשפעה של תזונה ותזונת יתר על מיקרו-סביבה של הכבד ועל התקדמות מחלות כבד.

מודלים של יונקים, כגון עכברים ודגימות רקמות אנושיות, היו חיוניים להבנת הפתוגנזה של סטאטוהפטיטיס וסטאטוזיס8. עכברים הם המודל המועדף למחלות כבד וסרטן, אך הם חסרים בהירות אופטית ברמה התאית, בעוד שדגימות רקמה אנושיות חסרות לעתים קרובות את הסביבה התלת-ממדית שמודלים של בעלי חיים מסוגלים לחקות. מכשולים אלה הפכו את דג הזברה למודל רב עוצמה בקהילת המחקר. לדגי זברה יש קווי דמיון מדהימים לבני אדם, עם לפחות 70% שימור גנים. הם שומרים על מיקרו-סביבה של הכבד, הרכב תאי הכבד, תפקוד, איתות ותגובה לפציעות 9,10. באמצעות תזונה עתירת כולסטרול (HCD) בשילוב עם מודל מבוסס של דגי זברה מהונדסים של HCC, פיתחנו מודל דגי זברה של HCC הקשור ל-NASH.

כאן אנו מציגים פרוטוקול המסביר כיצד ליצור מודל דג זברה HCC הקשור ל-NASH וכיצד לחקור את המיקרו-סביבה של הכבד ולטפל בתכונות ממאירות מוקדמות in vivo. באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית לא פולשנית בשילוב עם קווים מהונדסים של דגי זברה עם קרום וגרעין הפטוציטים המתויגים באופן פלואורסצנטי, אנו יכולים לטפל בתכונות ממאירות מוקדמות על ידי ניתוח מורפולוגיה של הכבד (שטח, נפח ושטח פנים), מורפולוגיה של תאים וגרעינים (אזור הפטוציטים, שטח גרעיני, יחס N:C, מעגליות גרעינית, ניקוד מיקרו-גרעיני/פריצה גרעינית) ואנגיוגנזה (צפיפות כלי דם). מיקרו-סביבה של תאי מערכת החיסון היא גם תכונה חשובה בהפטוקרצינוגנזה 11,12,13,14, ולכן אנו גם מראים כיצד לנתח את הרכב תאי מערכת החיסון בכבד בזחלי HCC הקשורים ל-NASH, תוך שימוש בקווי דגי זברה מהונדסים עם תאי חיסון מתויגים (נויטרופילים, מקרופאגים ותאי T). הטכניקות המתוארות הן ייחודיות למודל ושימושיות ביותר להערכת מיקרו-סביבה של הכבד והרכב תאי מערכת החיסון בהתקדמות מחלות כבד.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים בבעלי חיים מתבצעים בהתאם להליכים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה. למתכונים עבור מאגרים ופתרונות המשמשים בפרוטוקול עיין בטבלה משלימה 1.

1. הכנת 10% תזונה מועשרת בכולסטרול לעודפי כולסטרול חריפים.

  1. שקלו 2 x 4 גרם של דיאטת פנינת הזהב 5-50 ננומטר כדורים פעילים (GPAS) בשתי כוסות זכוכית של 25 מ"ל - אחת לתזונה הרגילה (ND) והשנייה לדיאטת 10% כולסטרול גבוה (HCD).
    הערה: ניתן להשתמש בכל תזונת מזון יבש מסחרית עבור זחלי דגי זברה.
  2. שוקלים 0.4 גרם כולסטרול בכוס זכוכית של 10 מ"ל. מכסים את הכוס בנייר כסף.
  3. מדוד 5 מ"ל של אתר Diethyl באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 גרם. לאחר מכן, מוסיפים את אתר Diethyl לכוס ND ומיד מערבבים אותו עם המזון היבש באמצעות מרית.
    אזהרה: אתר דיאתיל גורם לגירוי בעיניים, בעור ובדרכי הנשימה. יש להשתמש רק במכסה אדים כימיים.
  4. למדוד שוב 5 מ"ל של אתר Diethyl באמצעות מזרק 10 מ"ל עם מחט 20 גרם ולהוסיף אותו 10 מ"ל עם כולסטרול, לערבב מיד שאיפה למעלה ולמטה עם המזרק.
  5. מוסיפים במהירות את תמיסת הכולסטרול לכוס ה-HCD ומערבבים אותה מיד עם מרית עד שהתמיסה אחידה.
  6. השאירו כוסות במכסה המנוע למשך עד 24 שעות כדי להתאדות לחלוטין את אתר ה-Diethyl. למחרת, טחנו את דיאטות ה-GPAS לחלקיקים עדינים באמצעות הדברה וטיט.
    הערה: טחינת הדיאטות היא צעד מכריע, הזחלים לא יוכלו לאכול חלקיקים הגדולים מ-50 ננומטר.
  7. מעבירים כל דיאטה לשקית ניילון קטנה עם תווית או לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

2. אינדוקציה של NASH עם הזחלים לטווח קצר הניזונים מתזונה מועשרת בכולסטרול - תנאים סטטיים.

  1. קבעו קווי דגים מהונדסים ביום -1 (טבלה 1). למחרת בבוקר (יום 0), לאחר שהדגים השריצו, אספו ביצים במסננת רשת.
  2. באמצעות בקבוק שטיפה עם מי עובר (E3), שטפו את הביצים ביסודיות והעבירו בזהירות את הביציות לכלי פטרי בקוטר 10 ס"מ עם מדיום E3.
  3. נקו את הצלחות מכל הפסולת שאולי הצטברה בתיבות הרבייה, כולל ביצים מתות או לא מופרות.
    הערה: שטיפת הביצים וניקוי הצלחות חיוניים כדי למנוע גידול בלתי מבוקר של מיקרואורגניזמים ופגמים כתוצאה מכך בהתפתחות הזחלים.
  4. מחלקים ביצים בצפיפות של 70/80 לכל 10 ס"מ צלחות פטרי (ב 25 מ"ל של E3). ביום הראשון, תחת היקף נתיחה המצויד בבסיס טרנס-תאורה, בדקו ונקו עוברים מתים או עוברים עם פגמים התפתחותיים.
    הערה: השתמש במצב שדה כהה בסיס טרנס-תאורה כדי לזהות עוברים עם השפעות התפתחות ולבדוק אם יש צמיחה של מיקרואורגניזמים בלוחות. למתקנים שונים יש תפוקת מיקרואורגניזמים שונים במערכות שלהם. שנו את מדיום E3 ו/או מנות במידת הצורך, כדי למנוע השפעות שליליות.
  5. ביום 5, ערבבו זחלים מכל הכלים בתבנית פטרי בקוטר 15 ס"מ, הוסיפו E3 ללא מתילן כחול. לאחר מכן, חלקו את הזחלים בתיבות ההאכלה באופן הבא (טבלה 2).
    הערה: בתנאי בקרה, כדי לייצר זחלים בריאים מבלי לעורר דלקת כרונית מערכתית, יש להאכיל את הזחלים בכ-0.1 מ"ג מזון לזחלים ליום. שימו לב שכמות המזון הכוללת (טבלה 2) מתחלקת שווה בשווה בשתי האכלות ביום.
  6. יש לשמור את הזחלים באינקובטור בטמפרטורה של 28 מעלות צלזיוס, במחזור של אור כהה (למשל, מחזור בהיר של 14 שעות/10 שעות), ולהאכיל זחלים פעמיים ביום מיום 5 עד יום 12.
  7. שאפו מדי יום כל פסולת מזון, כמו גם 90-95% מהמדיום באמצעות מערכת ואקום המחוברת לקצה פיפטה של 1 מ"ל. לאחר מכן יש למזוג בזהירות E3 חדש ללא מתילן כחול לפינה אחת של תיבת ההזנה כדי למנוע פגיעה בזחלים.
    הערה: ניקוי יומי של קופסאות ההזנה הוא חיוני כדי למנוע צמיחה בלתי מבוקרת של מיקרואורגניזמים.

3. איסוף של 13 יום לאחר ההפריה זחלים מקופסאות האכלה.

  1. ביום ה-13 הכינו מנות איסוף בהתאם למספר תנאי הניסוי שהוקמו. עם עט טוש קבוע לעשות סימן בצד הכלים (מכסה ותחתית) כדי למנוע החלפת דגימות, למשל פס שחור אחד לתזונה רגילה (ND) ושני פסים שחורים עבור HCD.
  2. יוצקים מספיק E3 ללא מתילן כחול כדי לכסות את החלק התחתון של כל מנה. בזהירות באמצעות מערכת ואקום לשאוף את המים מקופסאות האכלה, לנסות לשאוף כל פסולת או זחלים מתים מלמטה כדי למנוע העברת חומרים אלה לכלי האיסוף.
  3. כאשר מפלס המים מתחיל לרדת, הרימו באיטיות את תיבת ההזנה כדי לגרום לזחלים לשחות לאחת הפינות, ואז שאפו בכיוון ההפוך.
    הערה: יש להשתמש בפיפטה של 1 מ"ל עם קצוות חתוכים, בגבהים שונים, כדי לאפשר קטרים שונים בעת שאיפת המים. החליפו בין הגדלים השונים, התחילו בקוטר גדול יותר, והחליפו לקוטר קטן יותר ככל שנפח המים מצטמצם וצפיפות הזחלים גדלה.
  4. ברגע שיש רק כ 20-30 מ"ל של נוזל, בזהירות להצהיר זחלים לתוך צלחת פטרי אוסף מוכן בשלב 1. מניחים את הסרט המסומן מקופסת ההאכלה על מכסה המנה.
  5. חזור על שלבים 3.2-3.4 עבור כל קופסאות ההזנה.

4. בדיקת בקרה עבור סטאטוזיס בכבד המושרה בתזונה - שמן אדום O (ORO) מכתים, הדמיה וניקוד.

  1. בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, מעבירים 15-20 זחלים לצינור תחתון עגול של 2 מ"ל ומניחים על הקרח למשך כ-15-30 דקות. הסר את רוב המדיה מהצינור.
  2. יש להוסיף 2 מ"ל של 4% מהפארפורמלדהיד (PFA) כדי לתקן זחלים ולדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. למחרת בבוקר, הסר תמיסת 4% PFA ושטוף זחלים שלוש פעמים עם 2 מ"ל של PBS אחד.
  4. הכינו צלחת של 12 בארות (איור 2A) לכל תנאי עם תוספת אחת של באר רשת.
  5. באמצעות פיפטה זכוכית, להעביר זחל מן צינור 2 מ"ל כדי להוסיף בעבר ממוקם בבאר, להוסיף 5 מ"ל של 1x PBS. שמור את צינורות 2 מ"ל לאחסון דגימה לאחר הכתמה.
    אזהרה: הזחלים דביקים מאוד בשלב זה אין להשתמש בפיפטות פלסטיק.
  6. להעביר עם זחלים לבאר אחרת עם 5 מ"ל של 60% תמיסת איזופרופנול. דגירה זחלים במשך 30 דקות טמפרטורת החדר (RT).
  7. בינתיים, הכינו O אדום שמן של 0.3% בתמיסת איזופרופנול של 60%. סנן את התמיסה האדומה בשמן 0.3% פעמיים באמצעות מסנן מזרק בגודל 0.45 מיקרומטר.
    הערה: יש להכין 5 מ"ל תמיסה לכל באר על ידי ערבוב של 3 מ"ל של 0.5% O אדום שמן באיזופרופנול עם 2 מ"ל מים מזוקקים. יש להכין את תמיסת O אדום ב-60% איזופרופנול עם 0.3% שמן.
  8. לאחר מכן, להעביר את תוספת הרשת עם זחלים לבאר אחרת עם 5 מ"ל של 0.3% שמן אדום טרי בתמיסת 60% איזופרופנול. זחלים דגירה במשך 3 שעות ב- RT עם נדנדה עדינה.
  9. לאחר צביעת ORO, יש לשטוף את הזחלים על ידי העברת התוסף לבאר אחרת עם 60% איזופרופנול. יש לשטוף זחלים פעמיים ב-60% איזופרופנול במשך 30 דקות בכל פעם על ידי העברת התוסף ברצף לבארות עם 60% איזופרופנול.
  10. לשטוף זחלים שלוש פעמים במשך 5 דקות ב 1x PBS-0.1% Tween על ידי העברת הכנסה ברצף לבארות עם 1x PBS-0.1% Tween.
  11. מעבירים זחלים לצינורות 2 מ"ל. יש להסיר PBST, להוסיף 1 מ"ל של 80% גליצרול ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד להדמיה.
  12. להדמיה טובה יותר, העבירו זחלים ל-1x PBS-0.1% Tween ותחת היקף דיסקציה נתחו כבדים על ידי משיכה זהירה של רקמות באמצעות שני מלקחיים #55.
    הערה: אם משתמשים בהדמיית רקע של קספר ניתן לבצע באמצעות הזחלים השלמים.
  13. באמצעות פיפטה זכוכית, מעבירים בזהירות את הכבדים לבאר של צלחת ספוט מחרסינה עם 50% גליצרול. מקם כבדים באמצעות כלי קטן כדי לתפעל זחלים (לדוגמה, כלי ריסים - איור 2B). כבדי תמונה בסטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמה צבעונית.
  14. ציון סטאטוזיס בכבד (ללא צביעת ORO = אין; צביעת ORO אדומה בהירה = קלה; צביעת ORO אדומה-כהה אדומה = בינונית/חמורה).

5. הדמיה קונפוקלית לא פולשנית באמצעות מכשיר הפציעה והלכידה של דגי זברה לגדילה והדמיה(zWEDGI).

  1. הכינו צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ עם 15-20 מ"ל של 1x Tricaine-E3, מספיק כדי לכסות את החלק התחתון.
    הערה: ניתן להשיג תמיסת עבודה אחת של Tricaine-E3 (0.16 מ"ג/מ"ל) על-ידי דילול 2 מ"ל של תמיסת מלאי של 25x Tricaine (4 מ"ג/מ"ל) ב-48 מ"ל של E3. ריכוז הטריקאין לא יעלה על 0.16 מ"ג/מ"ל מכיוון שהזחלים רגישים מאוד להרדמה בשלב התפתחות זה.
  2. מעבירים 15-20 זחלים עם פיפטה פסטר מפלסטיק לצלחת פטרי המכילה 1x Tricaine-E3 ומרדימים זחלים למשך 5 דקות.
  3. הכינו צלחת 6 בארות עם 2-3 מ"ל של E3 ללא מתילן כחול לכל באר.
  4. בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, מסננים את הזחלים המורדמים עבור סמנים פלואורסצנטיים רצויים (טבלה 1). העבירו זחלים מסוננים בכמות המינימלית של טריקאין ב-E3 ותנו להם להתאושש בצלחת 6 הבאר עד שהגיע הזמן לצלם.
    הערה: הקרנה של זחלים מהונדסים כפולים, משולשים ומרובעים לוקחת זמן, מקם זחלים ב- E3 ושנה מדיה מצלחת 6 הבאר לעתים קרובות כדי להפחית חשיפה מיותרת לטריקאין. כמו כן, הזחלים בשלב התפתחותי זה צפים ולכן יש להשתמש בכלי ריסים כדי למקם את הזחלים להקרנה מבלי לגרום נזק לרקמות.
  5. לאחר ההקרנה, להכין צלחת פטרי 10 ס"מ עם 25 מ"ל של 1x Tricaine-E3. מעבירים 15-20 זחלים עם פיפטה פסטר מפלסטיק לצלחת הפטרי המכילה 1x Tricaine-E3 ומרדימים זחלים למשך 5 דקות.
  6. בינתיים, תחת הסטריאומיקרוסקופ להוסיף 1x Tricaine-E3 לתוך התאים של מכשיר הפציעה והמלכודת (למשל, zWEDGI)15,16. הסר בועות אוויר מהתאים ומהמנהרה המרסנת באמצעות מיקרו-פיפטה P200. הסר את כל העודפים של 1x Tricaine-E3 והשאר רק נפח מספיק כדי למלא את התאים.
  7. העבירו זחל מורדם לתא ההעמסה של ה-zWEDGI, ומקמו אותו באמצעות כלי ריסים מתחת לסטריאומיקרוסקופ. בעדינות, טפחו על ראש הזחלים ודחפו אותו כך שהזנב ייכנס למנהרה המרסנת. בנוסף, באמצעות micropipette להסיר 1x Tricaine-E3 מתא הפצע כדי לעזור לזחלים להיכנס למנהרה. ודא כי הזחל ממוקם כראוי להדמיה של האונה השמאלית - מיקרוסקופ הפוך: צד שמאל פונה כלפי מטה; מיקרוסקופ זקוף: צד שמאל פונה כלפי מעלה.
    הערה: אם zWEDGI אינו זמין, ניתן להרכיב דגים ולמקם אותם בנקודת התכה נמוכה של 1% אגרוז ב-1x Tricaine-E3, עם זאת, ניתן להשתמש בטבילת אגרוז רק להדמיה מהירה (עד 15 דקות).
  8. לניתוח הפטוציטים ומורפולוגיה גרעינית, כבדי תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות מטרת אוויר פי 40 וערימות z של מקטעים אופטיים של 2 מיקרומטר. עבור מורפולוגיה של הכבד, אנגיוגנזה וגיוס תאי מערכת החיסון בודקים כבדי תמונה באמצעות מטרת אוויר של פי 20 וערימות z של חתכים אופטיים של 5 מיקרומטר. עבור זחלים עם כבדים גדולים, יש לצלם תמונות אריחים בגודל 2 x 2 כדי להבטיח הדמיה של כל הכבד והסביבה של 75 מיקרומטר.
  9. לאחר ההדמיה, השתמש פיפטה מפלסטיק פסטר עם 1x Tricaine-E3 כדי למשוך זחלים מהמנהרה המרסנת ולהעביר לצלחת פטרי עם E3 ללא מתילן כחול.

6. ניתוח וריאציות מורפולוגיות בכבד.

הערה: השלבים המפורטים להלן מבוצעים עבור שטח הפנים של הכבד וכימות נפח:

  1. פתח תוכנת הדמיה. הוסף תיקייה המכילה קובצי תמונה לניתוח לזירה תוך בחירה בסמל התיקייה Observe . לאחר מכן, על ידי לחיצה ימנית על תמונות ממוזערות בחר המר לפורמט קובץ Imaris מקורי כדי להמיר קבצים לפורמט ( .ims).
  2. בתפריט המשנה Surpass, התאם את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ. לאחר מכן, צור משטח מהכבד לחיצה על הכחול הוסף משטחים חדשים לחצן.
  3. לאחר מכן, בלוח יצירת פני השטח בחר פלח רק אזור עניין כדי ליצור באופן ידני משטח של הכבד.
  4. לחץ על דלג על יצירה אוטומטית | האפשרות 'ערוך ידנית' . בחרו ' קו מתאר ' ובטלו את הבחירה באפשרות 'עוצמת קול' בחלונית הסצנה.
    הערה: יש לבטל את הבחירה באפשרות תצוגת אמצעי אחסון, אחרת לא ניתן יהיה לבחור את אזור העניין בערימות z שונות.
  5. נווט בין z-stacks וצייר אזור עניין בכל מישור על-ידי בחירה באפשרות Mode, בחר את מצב הציור המועדף עליך. כדי להתחיל לצייר שינוי מצביע למצב בחירה ולא ניווט, לחץ לאחר מכן על צייר והתחל לגרור את המצביע דרך הכבד כדי לצייר החזר השקעה.
  6. לאחר בחירת ROI במישורי המוקד השונים, בחר צור משטח כדי למזג את כל ה- ROI שנבחרו וליצור משטח כבד.
  7. לאחר מכן, באמצעות המשטח החדש שנוצר ליצור מסכה של אות hepatocytes. לחץ על המשטח ומתחת לכרטיסייה עריכה (העיפרון) בחר מסיכת הכל. בחלון שמופיע, בחר את הערוץ שברצונך להסוות שישמש לכימות נפח הכבד ושטח הפנים. לאחר מכן, בחר הגדר voxels מחוץ למשטח ל- 0 וסמן את האפשרות שכפל ערוץ לפני החלת מסיכה.
  8. השתמש בשטח הפנים של הכבד ובערכי נפח הכבד מתפריט הניתוח הסטטיסטי לצורך ניתוח.

הערה: בצע את השלבים הבאים לכימות אזור הכבד.

  1. פתח את תוכנת פיג'י. בתפריט תוספים, בחר ביו-פורמטים ואחריו יבואן פורמטים ביו, סמן את האפשרות פיצול ערוצים כדי לפתוח קובץ תמונה.
  2. בתפריט תמונה, בחר מאפיינים כדי לבדוק שהתמונה כוללת את גודל הפיקסלים ואת עומק הווקסל הנכונים, אם לא את הערכים הנכונים. לאחר מכן, עבור אל תפריט תמונות, לחץ על התאם ואחריו בהירות וניגודיות, התאם את בהירות התמונה ואת הניגודיות.
  3. לאחר מכן, באמצעות ערוץ hepatocytes ליצור הקרנה בעוצמה מקסימלית של הכבד. עבור אל תפריט תמונות, לחץ על ערימות ואחריו פרויקט Z. בחר הקרנה בעוצמה מרבית.
  4. באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית, צור באופן ידני אזור מתעניין (ROI) סביב כבד הזחל. לאחר מכן, בתפריט ניתוח לחץ על מדידה כדי לקבל שטח כבד. שמור תוצאות כגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

7. הפטוציטים וניתוח מורפולוגי גרעיני.

  1. פתח את תוכנת פיג'י. בתפריט תוספים, בחר ביו-פורמטים ואחריו ביו-פורמטים יבואן סמן באפשרות פיצול ערוצים כדי לפתוח קובץ תמונה.
  2. בתפריט תמונה, בחר מאפיינים כדי לבדוק שהתמונה כוללת את גודל הפיקסלים ואת עומק הווקסל הנכונים, אם לא את הערכים הנכונים. לאחר מכן, עבור לתפריט תמונות, לחץ על התאם ואחריו בהירות וניגודיות, התאם את בהירות התמונה ואת הניגודיות.
  3. בתפריט ' נתח' , בחר 'הגדר מדידות ' סמן את כל הפרמטרים שברצונך לנתח (לדוגמה, מתארי שטח, היקף וצורה). בחר תעלת פלואורסצנט של קרום הפטוציטים. בניווט דרך Z, השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר החזר השקעה מושלם סביב הפטוציט אחד. לאחר מכן, בתפריט ניתוח לחץ על מדידה כדי לחשב את שטח הפטוציטים.
  4. חזור על שלב 7.3 עבור 15-30 hepatocytes. שמור תוצאות כגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
  5. לאחר מכן, בחר ערוץ פלואורסצנטי גרעין. ניווט דרך Z, השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לצייר החזר השקעה מושלם סביב גרעין הפטוציטים. לאחר מכן, בתפריט נתח לחץ על מידה כדי לחשב שטח גרעיני ומעגליות.
  6. חזור על שלב 7.5 עבור 15-30 hepatocytes. שמור תוצאות כגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף, כולל כימות של יחס גרעיני:ציטופלסמי.
  7. ניקוד דגימות לנוכחות של מיקרו-גרעינים ופריצות כמפורט להלן (טבלה 3).

8. ניתוח אנגיוגנזה.

  1. צור באופן ידני משטח לכבד כמתואר בסעיף 6 של פרוטוקול זה. קרא למשטח זה בשם "משטח כבד".
  2. צרו מסכה לאות תאי האנדותל בתוך הכבד. לחץ על המשטח ומתחת לכרטיסיית העריכה (העיפרון) בחר מסיכת הכל. בחלון שמופיע, בחר את תעלת תאי האנדותל כדי לבודד אותות כלי דם רק מהכבד. בחרו באפשרות 'הגדר voxels מחוץ למשטח ל-0' וסמנו את האפשרות ' שכפל ערוץ ' לפני החלת 'מסיכה'.
  3. שנה את השם של תאי אנדותל חדשים במסווה ערוץ כמו כלי דם בכבד.
  4. כדי למדוד את נפח כלי השיט ואת שטח הפנים ליצור משטח שני. לחץ על הכחול הוסף משטחים חדשים כפתור. בשלב הראשון של יצירת המשטח, ודא שכל האפשרויות לא נבחרו כדי ליצור משטח באופן אוטומטי.
  5. בשלב השני בחר ערוץ כלי דם בכבד כדי ליצור משטח מעל. בטלו את הבחירה באפשרות החלקה כדי לזהות פרטים רבים ככל האפשר מכלי השיט ואפשרו חיסור רקע באפשרות הסף.
  6. כוונן את הסף כדי להבטיח שהמשטח שזוהה הוא קולוקליזציה עם אות כלי הדם בכבד. השתמש בערכי שטח פנים ונפח מתפריט הניתוח הסטטיסטי. חישוב מדד צפיפות כלי השיט באמצעות המשוואות הבאות:
    מדד צפיפות כלי הדם (על ידי כבד μm 2) = (שטח פנים כלי (μm 2)) / (שטח פנים כבד (μm2))
    מדד צפיפות כלי הדם (על ידי כבד μm 3) = (נפח כלי (μm 3)) / (נפח כבד (μm3))

9. ניתוח גיוס תאי מערכת החיסון.

  1. פתח את תוכנת פיג'י. בתפריט תוספים, בחר ביו-פורמטים ואחריו ביו-פורמטים יבואן סמן באפשרות פיצול ערוצים כדי לפתוח קובץ תמונה.
  2. בתפריט תמונה, בחר מאפיינים כדי לבדוק שהתמונה כוללת את גודל הפיקסלים ואת עומק הווקסל הנכונים, אם לא את הערכים הנכונים. לאחר מכן, עבור לתפריט תמונות, לחץ על התאם ואחריו בהירות וניגודיות, התאם את בהירות התמונה ואת הניגודיות (למשל, מקרופאגים - mCherry או dTomato; נויטרופילים - BFP; תאי T - EGFP; הפטוציטים - EGFP או mCherry).
  3. לאחר מכן, צור הקרנות בעוצמה מרבית לכל ערוץ.
  4. כמתואר בסעיף 6 (שלבים 6.9-6.12), ליצור ROI סביב כבד הזחל ולמדוד את אזור הכבד. צור ROI שני הכולל את אזור הכבד ואזור 75 מיקרומטר שמסביב ("אזור הגיוס").
  5. לאחר מכן, בתפריט עריכה בחר באפשרות בחירה ולאחר מכן הוסף למנהל. בחירת ערוץ תא חיסוני מולד הקרנה בעוצמה מרבית, לחץ על החזר ההשקעה של הכבד מחלון מנהל ההחזר על ההשקעה כדי להגדיר את אזור הגיוס.
  6. בתפריט תוספים, בחר באפשרות נתח ולאחר מכן מונה תאים וספור תאים חיסוניים בתוך אזור הגיוס. רשום את מספר תאי מערכת החיסון שגויסו לאזור הכבד בגיליון אלקטרוני.
  7. חשב את צפיפות הנויטרופילים, המקרופאגים ותאי ה-T על-ידי נרמול מספר תאי מערכת החיסון לכל אזור בכבד.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

על ידי החדרת דיאטה קצרת טווח של כולסטרול גבוה לתוך מודל דגי זברה של קרצינומה הפטוצלולרית (HCC), אשר מבטא יתר על המידה צורה פעילה ספציפית של הפטוציטים של בטא-קטנין (s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17, אנו מסוגלים ליצור מודל של בעלי חוליות שאינם יונקים של HCC הקשור ל-NASH. ניתן לעקוב אחר התקדמות מחלת כבד בשלב מוקדם על-ידי מדידת סטאטוזיס בכבד, גודל הכבד, הפטוציטים, מורפולוגיה גרעינית, אנגיוגנזה וחדירת תאי מערכת החיסון (איור 1).

זחלי HCC הניזונים מתזונה רגילה אינם מראים כי סטאטוזיס כבד עדין, הנמדד על ידי צביעת שמן אדום O. עם זאת, זחלי HCC הניזונים מתזונה עתירת כולסטרול מראים עלייה משמעותית בסטאטוזיס בכבד (איור 2).

סמן ידוע של מחלת כבד הוא hepatomegaly17. כדי להעריך את גודל הכבד, זחלי HCC יכולים להיות גלויים עם קו מהונדס המבטא באופן ספציפי סמן פלואורסצנטי על הפטוציטים, כגון Tg(fabp10a:H2BmCherry). כדי להעריך hepatomegaly, הערכה של שטח הכבד (2D), שטח הכבד, ואת נפח הכבד (3D) מבוצעים. לאחר 8 ימים של חשיפה לעודף כולסטרול, נצפתה עלייה בכבד בזחלי HCC (איור 3).

באמצעות הדמיה חיה לא פולשנית, ניתן להשתמש בקווי דגים מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בקרום הפטוציטים (כגון Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) ובגרעיני הפטוציטים (כגון Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) כדי להעריך שינויים במורפולוגיה התאית והגרעינית הקשורים לממאירות בהפטוציטים. שטח ההפטוציטים גדל ב-HCC הקשור ל-NASH (איור 4A,B,D), כמו גם בשטח הגרעיני (איור 4C,E) וביחס גרעיני:ציטופלסמי (איור 4F). ירידה משמעותית במעגליות הגרעינית נצפתה גם בקבוצת HCD+HCC (איור 4G). ליפוטוקסיות גורמת נזק לדנ"א, תכונה של קרצינוגנזה בנוכחות מיקרו-גרעינים. באמצעות הסמן H2B-mCherry ראינו שכיחות גבוהה יותר של מיקרו-גרעינים בזחלי HCC שניזונו מתזונה עתירת כולסטרול (איור 4H).

ניתן להעריך בקלות את כלי הדם בכבד במודלים של דגי זברה באמצעות קו מתויג מהונדס, כגון Tg (kdrl:mCherry או Tg(fli:EGFP), המתייגים כלי דם. עלייה משמעותית בצפיפות כלי הדם נצפתה בזחלי HCC+HCD (איור 5).

כדי לבחון את התגובה הדלקתית המופעלת בשלב מוקדם ב-HCC הקשור ל-NASH, קו דגים מהונדסים המבטא חלבונים פלואורסצנטיים במקרופאגים ובנויטרופילים, כגון Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP), הוצף עם הקו המהונדס HCC. חדירה של נויטרופילים ומקרופאגים מתרחשת הן ב-HCC והן ב-HCC המוזנים ב-HCD, אשר הוערך על ידי כימות המספר והצפיפות של נויטרופילים/מקרופאגים בכבד ובסביבתו (הסביבה עד 75μm) (איור 6A-H). אף על פי כן, HCC+HCD הציג עלייה משמעותית במספר ובצפיפות הנויטרופילים (איורים 6F-H). ב 13 ימים לאחר ההפריה, מערכת החיסון הנרכשת כבר מתפקדת. שימוש בקו דגים מהונדסים המבטא חלבון פלואורסצנטי בתאי T, כגון Tg(lck:EGFP), ובשילוב עם הקו המהונדס HCC; הערכנו את ההשפעה של עודף כולסטרול על גיוס תאי T לכבד. ירידה משמעותית בצפיפות תאי ה-T ובמספרם הכולל נצפתה בזחלי HCC שניזונו מ-HCD (איור 6I-K).

קווי דגי זברה מהונדסיםחומר עזר של ZFINבדיקת מעבדה
קספררועיא9; מיטפהW2סטיאט כבדosis
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus / fabp10a:H2B-mCherry )s704Tg / uwm41Tgמורפולוגיה של הכבד
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tgהפטוציטים ומורפולוגיה גרעינית
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)s704Tg / y1Tgאנגיוגנזה
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:ונוס;  mfap4:עגבניות-CAAX; lyzC:BFP)s704Tg / xt6Tg / zf2171Tgגיוס מקרופאגים ונויטרופילים
Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)s704Tg / cz1Tgגיוס תאי T

טבלה 1: קווי דגי זברה מהונדסים לשימוש במבחנים שונים.

מספר הזחליםגודל תיבת האכלהכמות המזון ליום (מ"ג)נפח E3 (מ"ל)
30-40קופסת רבייה קטנה3-4200
60-80קופסת גידול קטנה/גדולה6-8400
100-150קופסת רבייה גדולה10-15500

טבלה 2: הגדרת תנאים של תיבות האכלה.

פנוטיפשיטת הניקוד
ללאגרעינים תקינים, ללא מיקרו-גרעינים או פריצות
מתוןמספר נמוך של מיקרו-גרעינים (פחות מ-5 לכל שדה ראייה) ו/או פריצה
בינוני/ חמורמספר בינוני עד גבוה של מיקרו-גרעינים (יותר מ-5 לכל שדה ראייה) ו/או פריצה

טבלה 3: ניקוד מיקרו-גרעינים ופריצות גרעיניות.

figure-results-1
איור 1: דיאגרמת פרוטוקול המסכמת את שלבי הניסוי העיקריים ואת גישת הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2
איור 2: בדיקת בקרה עבור סטאטוזיס בכבד - צביעת ORO. זחלי HCC הוזנו בתזונה רגילה או עתירת כולסטרול, וצביעת שמן אדום O (ORO) בוצעה כדי להעריך סטאטוזיס בכבד. (A) דיאגרמה של לוח 12 הבאר לביצוע צביעת ORO רציפה באמצעות תוספות באר הרשת. (B) תמונה של כלי ריסים המשמש למניפולציה של זחלים. (C) תמונות מייצגות של כבדים מוכתמים באדום שמן; זחלי HCC ו-HCC+HCD. (D) גרף צ'י-ריבועי המציג את אחוז הזחלים עם ניקוד שונה של סטאטוזיס בכבד. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-3
איור 3: תמונות מייצגות מגודל הכבד. זחלי HCC מהונדסים המבטאים סמן כבד (Tg(fabp10a:H2B-mCherry)) צולמו בשידור חי ולא פולשני, במיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב הפוך באמצעות zWEDGI. (A) שחזורים תלת-ממדיים מייצגים של כבדים בזחלי HCC ו-HCC+HCD. (ב-ד) גרף המציג שינויים מורפולוגיים בכבד, כולל אזור הכבד (B) שטח הפנים של הכבד (C) ונפח הכבד (D) בזחלי HCC ו-HCC+HCD. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4
איור 4: תמונות מייצגות מהפטוציטים ומורפולוגיה של גרעינים. צולמו קווי HCC מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בקרום הפטוציטים (Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) ובגרעיני הפטוציטים (Tg(fabp10a:H2B-mCherry). (א-ג) שחזורים תלת-ממדיים מייצגים של גרעיני F-אקטין והפטוציטים של זחלי HCC ו-HCC+HCD. ראשי חץ פתוחים מראים גרעינים מוגדלים; ראשי חץ לבנים מראים גרעין עם צורה שונה; וחצים אדומים מראים מיקרו-גרעינים ופריצות גרעיניות. (ד-ג) גרפים המציגים ממוצעים של פרמטרים של תאים וגרעינים בזחלים בני 13 יום ו-HCC+HCD. (D) אזור הפטוציטים. (ה) אזור גרעיני. (ו) יחס גרעיני:ציטופלסמה. (ז) מעגליות גרעינית. כל נקודה מייצגת ממוצעים לזחל. חלקות נקודה מראות גרפים ריבועיים ממוצעים של ±SEM (H) Chi המציגים אחוז זחלים עם ניקוד שונה של מיקרו-גרעינים ופריצות גרעיניות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-5
איור 5: תמונות מייצגות מכלי דם בכבד. קווי HCC מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בגרעיני הפטוציטים (Tg(Fabp10a:H2B-mCherry) ובתאי האנדותל (Tg)fli:EGFP)). (A) שחזורים תלת-ממדיים מייצגים של כלי דם בכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD. (ב-ג) גרף המציג את מדד צפיפות כלי הדם לפי שטח הפנים של הכבד (B) נפח (C) בזחלי HCC ו-HCC+HFCD. עלילות נקודה מראות ממוצע ±SEM. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-6
איור 6: תמונות מייצגות מנוף תאי מערכת החיסון בכבד. קו HCC מהונדס המבטא חלבונים פלואורסצנטיים במקרופאגים ובנויטרופילים (Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) או בתאי T (Tg(lck-EGFP). (א,ג,ו) שחזורים תלת-ממדיים מייצגים של כבדים וגיוס לויקוציטים לאזור הכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD בני 13 יום. (B) דיאגרמה של אזור הכבד המצולם. (ד-ה) גרף המציג את צפיפות המקרופאגים (D) והמספר (E) באזור הכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD. (ז-ה) גרף המציג צפיפות נויטרופילים (G) ומספר (H) באזור הכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD. (G) שחזורים תלת-ממדיים מייצגים של גיוס תאי T לאזור הכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD. (ח-י) גרף המציג את צפיפות תאי T (H) ומספר (I) באזור הכבד בזחלי HCC ו-HCC+HCD. עלילות נקודה מראות ממוצע ±SEM. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה 1: טבלת מאגרים ופתרונות אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם שכיחות מוגברת של HCC, במיוחד HCC המושרה על ידי NASH, יש חשיבות רבה למודלים יעילים יותר לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים המעורבים ב- HCC הקשור ל- NASH. פירוק של אינטראקציות בין תאים בכבד הוא חיוני כדי להבין טוב יותר את התקדמות מחלת הכבד ואת ההפטוקרצינוגנזה. הגישה המתוארת בפרוטוקול זה מציעה דרך ייחודית לנתח את התקדמות מחלת הכבד in vivo ולא פולשנית.

הכנת דיאטה היא קריטית להצלחה של הקמת מודל HCC הקשור ל-NASH. חשוב לתת לאתר דיאתיל להתאדות לחלוטין בתוך מכסה האדים כדי למנוע השפעות מזיקות, תוך הכנת דיאטות לדגי זברה. כדי להשתמש בדיאטות אלה עם זחלים (5-12 ימים לאחר ההפריה), חשוב מאוד לטחון את הדיאטות לחלקיקים עדינים כדי להבטיח את צריכת המזון על ידי הזחלים. ניתן להשתמש באנלוגים של חומצות שומן המתויגות באופן פלואורסצנטי כדי להעריך את צריכת המזון בזחלים.

לפני הכנסת הזחלים לתיבות הרבייה והתחלת הליך ההאכלה, חשוב לוודא שהדגימה הניסיונית אחידה על ידי ערבוב זחלים מצלחות שונות. שלב זה חשוב מאחר שמיקרו-סביבה שונה, החל מיום 0, מקודמת בכל אחת מהצלחות ועלולה להשפיע על התגובה הדלקתית.

צעד חשוב נוסף הוא לספור את הזחלים, כדי לדעת כמה מזון נדרש עבור כל קופסת האכלה. אם כמות המזון אינה מספקת למספר הזחלים הנמצאים בכל קופסה, יתרחש אחד משני התרחישים: 1) הזחלים יהיו בתת-תזונה; 2) הזחלים יהיו overfed. האכלה לא מדויקת תוביל למצבים לא בריאים הקשורים לתת תזונה או תזונת יתר, כגון דלקת, אשר תשפיע באופן דרסטי על המיקרו-סביבה של הכבד. אם מתרחשת האכלה לא מדויקת, הזחלים יראו בעיות תנועה. בשלב התפתחות זה, הזחלים צריכים לשחות באופן אינטנסיבי, ולכן אם מבחינים בבעיות תנועה הזחלים גודלו בתנאים לא בריאים (תת תזונה או חשיפה למינונים רעילים של כולסטרול עקב האכלת יתר). מסיבה זו, נהלי האכלה צריכים להיות מבוקרים היטב עבור דיאטות, נורמלי כולסטרול מועשר. ניתן לבצע כמה בדיקות כדי לטפל במהירות בדיוק ההזנה והבריאות של הזחלים כולל נוכחות של hepatomegaly (גודל הכבד) ודלקת של רקמות ואיברים, במיוחד כבד ומעי (חדירה מוגברת גלויה של נויטרופילים ומקרופאגים).

ניקוי יומי והחלפה של 95% מ-E3 הוא חיוני כדי להפחית את הצמיחה של מיקרואורגניזמים בקופסאות ההזנה ולשפר את בריאות הזחלים והישרדותם. לחלופין, ניתן למקם את הזחלים במערכת ארון תקשורת עצמאית. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש למקם 60-80 זחלים במיכל של 3 ליטר. שמור על זרימת מים ברמה המינימלית על ידי התאמת הזרימה למצב טפטוף מהיר והאכלת זחלים 3-4 מ"ג פעמיים ביום (AM ו- PM). יש לבדוק את זרימת המים באופן קבוע כדי להבטיח זרימה נכונה בכל מיכל. במעבדה שלנו, שיטה זו נותנת לנו 95-100% הישרדות עם הזנה לטווח קצר של 10% HCD. בנוסף, שיטה זו הפחיתה מאוד את עומס העבודה הטמון בניקוי היומיומי ובהחלפת המים הדרושים בפרוטוקול ההזנה הסטטית המתואר.

אמנם השתמשנו בתזונה מועשרת ב-10% כולסטרול כדי לגרום ל-NASH בחשיפה קצרת טווח (5 ימים מספיקים כדי לגרום לסטאטוהפטיטיס), אבל ניתן לבצע שינויים בתזונה ולהרחיב אותם כדי להשתמש בפרוקטוז 18, חומצות שומן (כגון חומצה פלמיטית)19, או פרוטוקולי הזנה שניתן להרחיב באמצעות תזונה מועשרת ב-4% בכולסטרול20. נכון לעכשיו, יש מעט מטרות טיפוליות מוצלחות עבור HCC ואף אחת מהן עבור NASH. השימוש במודלים של דגי זברה מציע הזדמנות ייחודית להרחיב את הידע שלנו על הפטוקרצינוגנזה, אך גם מערכת בעלי חוליות שאין דומה לה לביצוע בדיקות סמים בתפוקה גדולה. הטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה יאפשרו ממצאים עתידיים ומטרות טיפוליות למחלות כבד והפטוקרצינוגנזה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מבקש להודות לטכנאי מתקן הליבה של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה של דגי זברה קלינטון דה-פאולו וספרטק קלינין על סיוע ותחזוקה של קווי דגי הזברה שלנו. FJMN נתמך על ידי המכון לחקר הסרטן וקרן פיברולמלר לסרטן.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
כולסטרולסיגמאC8667-25Gמתפרק בקלות. חנות -20 מעלות צלזיוס.
ערכת מנשא קורנינג נטוולס 15 מ"מפישר07-200-223
קורנינג נטוולס מוסיףפישר07-200-212
דיאתיל אתרפישר60-046-380נדיף מאוד.
מלקחיים דומונט #55 דומוסטארפישרNC9504088
פישרברנד פסטר פיפטס 5.75 אינץ'פישר22-183624
4% פרפורמלדהיד (PFA)מדע מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
דיאטת פנינת הזהב 5– 50 ננומטר כדורים פעיליםשרימפס מלח ישיר-ניתן להשתמש בכל מזון אבקה יבש מסחרי לזחלים.
צנרת העברה מדורגתפישר22-170-404
איזופרופנולפישרBP26181
PBS, pH7.4, 10X, 10 חבילותקריסטלגן221-1422-10
צלחות פטרי 100X20 מ"מפישר08-747D
טריקאיןסיגמאA-5040
טווין 20פישרBP337-500
תמיסת O אדומה שמן 0.5% איזופרופנולSigmaO1391-500ML
טריקאיןסיגמאA-5040
Tween 20FisherBP337-500
VactrapVWR76207-630מערכת ואקום לאיסוף זחלים
<חזק>מיקרוסקופים
סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטיLeicaM205 FCA THUNDER Imager דגם אורגניזם
מיקרוסקופ קונפוקליניקון ניקוןCSU-W1
סטריאומיקרוסקופLeicaS9i עם בסיס
<חזק>תוכנה
Fijiתוכנית עיבוד תמונה Java בקוד פתוח.
אימאריס 9.6ביטפליין; אוקספורד אינסטרומנטס.
דיסק מסתובב גדול מואר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic Fatty Liver Disease-Related Hepatocellular Carcinoma: A Problem of Growing Magnitude. Seminals in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
  2. El-Serag, H. B., Kanwal, F. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in the United States: where are we? Where do we go. Hepatology. 60 (5), 1767-1775 (2014).
  3. Estes, C., et al. Modeling NAFLD disease burden in China, France, Germany, Italy, Japan, Spain, United Kingdom, and United States for the period 2016-2030. Journal of Hepatology. 69 (4), 896-904 (2018).
  4. Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease. Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).
  5. Meli, R., Mattace Raso, G., Calignano, A. Role of innate immune response in non-alcoholic Fatty liver disease: metabolic complications and therapeutic tools. Frontiers in Immunology. 5, 177(2014).
  6. Ganz, M., et al. Progression of non-alcoholic steatosis to steatohepatitis and fibrosis parallels cumulative accumulation of danger signals that promote inflammation and liver tumors in a high fat-cholesterol-sugar diet model in mice. Journal of Translational Medicine. 13, 193(2015).
  7. Ma, C., et al. NAFLD causes selective CD4(+) T lymphocyte loss and promotes hepatocarcinogenesis. Nature. 531 (7593), 253-257 (2016).
  8. Reimer, K. C., Wree, A., Roderburg, C., Tacke, F. New drugs for NAFLD: lessons from basic models to the clinic. Hepatology International. 14 (1), 8-23 (2020).
  9. Wrighton, P. J., Oderberg, I. M., Goessling, W. There is something fishy about liver cancer: Zebrafish models of hepatocellular carcinoma. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 8 (3), 347-363 (2019).
  10. Goessling, W., Sadler, K. C. Zebrafish: An important tool for liver disease research. Gastroenterology. 149 (6), 1361-1377 (2015).
  11. Huo, X., et al. Transcriptomic profiles of tumor-associated neutrophils reveal prominent roles in enhancing angiogenesis in liver tumorigenesis in zebrafish. Science Reports. 9 (1), 1509(2019).
  12. Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-associated neutrophils and macrophages promote gender disparity in hepatocellular carcinoma in zebrafish. Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).
  13. Capece, D., et al. The inflammatory microenvironment in hepatocellular carcinoma: A pivotal role for tumor-associated macrophages. Biomed Research International. 2013, 187204(2013).
  14. de Oliveira, S., et al. Metformin modulates innate immune-mediated inflammation and early progression of NAFLD-associated hepatocellular carcinoma in zebrafish. Journal of Hepatology. 70 (4), 710-721 (2019).
  15. Huemer, K., et al. Long-term live imaging device for improved experimental manipulation of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340(2017).
  16. Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and entrapment device for imaging live zebrafish larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
  17. Evason, K. J., et al. Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).
  18. Sapp, V., Gaffney, L., EauClaire, S. F., Matthews, R. P. Fructose leads to hepatic steatosis in zebrafish that is reversed by mechanistic target of rapamycin (mTOR) inhibition. Hepatology. 60 (5), 1581-1592 (2014).
  19. Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish. Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).
  20. Progatzky, F., et al. Dietary cholesterol directly induces acute inflammasome-dependent intestinal inflammation. Nature Communication. 5, 5864(2014).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zebrafish ModelImmune Cell CompositionConfocal MicroscopyHigh Cholesterol DietHepatic SteatosisTransgenic ZebrafishSingle Cell RNA

מאמרים קשורים