מאמר שיטה

שיטה כללית לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה באופן חופשי ויכולת נוגדת חמצון של דגנים וקטניות

DOI:

10.3791/62467

⸱

10 ביוני 2022

 ,  , 
1Department of Food and Human Nutritional Sciences, University of Manitoba, 2Richardson Centre for Functional Foods and Nutraceuticals, University of Manitoba

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומצות פנוליות הן פיטוכימיקלים חשובים הנמצאים בדגנים מלאים. יש להם תכונות ביו-אקטיביות כגון פונקציות הגנה נוגדות חמצון. עבודה זו נועדה לדווח על שיטה כללית לזיהוי HPLC, הערכת תכולה פנולית כוללת וקביעת היכולת נוגדת החמצון של חומצות פנוליות בדגנים וקטניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומצות פנוליות הן סוג של תרכובות אורגניות הנושאות הן קבוצה פנולית והן קבוצה קרבוקסילית. הם נמצאים בדגנים ומתרכזים בסובין של דגנים או בציפוי זרעים של קטניות. הם בעלי תכונות נוגדות חמצון שעוררו עניין מחקרי רב בשנים האחרונות, על תפקודי הבריאות המגנים הפוטנציאליים שלהם. עבודה זו מציגה שיטה כללית למיצוי של חומצות פנוליות מסיסות בחינם מדגנים מלאים וניתוח של יכולת נוגדת החמצון שלהם. נעשה שימוש בחמש דגימות מדגנים מלאים שכללו שני דגנים (חיטה ותירס צהוב) ושלוש קטניות (שעועית פרה, שעועית כליה וסויה). הדגנים נטחנו לקמח והחומצות הפנוליות המסיסות בחופשיות שלהם הופקו באמצעות מתנול מימי. לאחר מכן זוהו התרכובות באמצעות כרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (HPLC). שיטת Folin-Ciocalteu שימשה לקביעת התכולה הפנולית הכוללת שלהם, בעוד שיכולות נוגדות החמצון שלהם נקבעו באמצעות יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH, יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC) ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). החומצות הפנוליות שזוהו כללו חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרולית. חומצה ונילית זוהתה רק ב-cowpea בעוד שחומצה קפאית זוהתה רק בפולים בכליות. חומצה p-Coumaric זוהתה בתירס צהוב, פרה וסויה, בעוד שחומצה פרולית זוהתה בכל הדגימות. חומצה פרולית הייתה החומצה הפנולית השלטת שזוהתה. הריכוז הכולל של חומצות פנוליות בדגימות ירד בסדר הבא: פולי סויה > שעועית פרה > תירס צהוב = שעועית כליה > חיטה. היכולת נוגדת החמצון הכוללת (סכום הערכים של מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC) ירדה באופן הבא: פולי סויה > שעועית כליות > תירס צהוב = שעועית פרה > חיטה. מחקר זה הגיע למסקנה כי ניתוח HPLC, כמו גם מבחני DPPH, TEAC ו- ORAC מספקים מידע שימושי על הרכב החומצה הפנולית ועל התכונות נוגדות החמצון של דגנים מלאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חומצות פנוליות הן בין הפיטוכימיקלים החשובים ביותר שנחקרו בצמחים בשל התפקיד החיוני שהם ממלאים בהגנה על הצמחים מפני זיהום עשבוני ופטרייתי, כמו גם בשמירה על תמיכה מבנית ושלמות ברקמות הצמח 1,2. הם מצויים בשפע בסובין של דגנים ובמעיל זרעים של קטניות3. מבחינה מבנית, הם מחולקים לשתי קבוצות: החומצות ההידרוקסיבנזואיות (איור 1) וחומצות הידרוקסיצינמיות (איור 2). החומצות ההידרוקסיבנזואיות הנפוצות בדגנים ובקטניות כוללות חומצות גאליות, p-הידרוקסיבנזואיות, 2,4-דיהידרוקסיבנזואיות, פרוטוקאצ'ואיות, וניליות וסירינגיות, בעוד שהחומצות ההידרוקסיצינמיות הנפוצות כוללות חומצות קפאיות, p-קומרית, פרוליות וסינפיות3. לחומצות פנוליות יש גם תכונות נוגדות חמצון, שכן הן מסוגלות לטרוף רדיקלים חופשיים, הגורמים לעופש חמצוני בשומנים, וליזום ולהפיץ עקה חמצונית הנגרמת על ידי רדיקלים במערכות פיזיולוגיות 4,5. בשל תפקיד פיזיולוגי חיוני זה כמו נוגדי חמצון, הם הנושא של המחקר האחרון. הסיבה לכך היא שכאשר הם נצרכים כמרכיבים של מזונות צמחיים, הם יכולים להפעיל הגנה נוגדת חמצון.

דגנים ומוצרי דגנים הם מקורות מזון עיקריים לפחמימות עבור בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם6. דגנים כוללים חיטה, אורז, תירס (תירס), שעורה, טריטיקל, דוחן וסורגום. ביניהם, התירס הוא המנוצל ביותר, עם ניצול עולמי מוערך של 1,135.7 מיליון טון בשנת 2019/2020, ואחריו חיטה עם ניצול עולמי מוערך של 757.5 מיליון טון באותה תקופה7. מזונות דגנים הם מקורות אנרגיה נהדרים לצרכנים שכן הם מקורות עשירים של פחמימות. הם גם מספקים קצת חלבון, שומן, סיבים, ויטמינים ומינרלים6. בנוסף לערכם התזונתי, דגנים הם מקורות טובים לנוגדי חמצון פיטוכימיים, במיוחד חומצות פנוליות, שיש להן פוטנציאל להגן על המערכת הפיזיולוגית מפני נזקי חמצון הנגרמים על ידי רדיקלים3. קטניות הן גם מקורות טובים של חומרים מזינים והן בדרך כלל עשירות יותר בחלבון מאשר דגנים. הם מכילים גם ויטמינים ומינרלים ומשמשים להכנת מזונות שונים8. בנוסף, קטניות הן מקורות טובים למגוון נוגדי חמצון פיטוכימיים, כולל חומצות פנוליות, פלבנואידים, אנתוציאנינים ופרואנתוציאנידינים 9,10. זנים שונים של דגנים וקטניות עשויים להיות בעלי הרכב שונה של חומצה פנולית. לכן יש צורך לחקור את הרכב החומצה הפנולית של דגנים וקטניות ואת הזנים שלהם, על מנת לדעת את היתרונות הבריאותיים הפוטנציאליים שלהם ביחס לנוגדי חמצון פנוליים.

מספר בדיקות דווחו על מדידת כמות החומצות הפנוליות בדגנים ובגרגרי קטניות, וקביעת פעילותן נוגדת החמצון. שיטות הניתוח הנפוצות ביותר עבור חומצות פנוליות מדגנים מלאים הן ספקטרופוטומטריה וכרומטוגרפיה נוזלית11. מטרת עבודה זו הייתה להדגים שיטה כרומטוגרפית נוזלית כללית בלחץ גבוה לקביעת הרכב חומצה פנולית מסיסה חופשית, ושיטות ספקטרופוטומטריות לקביעת התכולה הפנולית הכוללת והיכולת נוגדת החמצון של חלק מדגנים מלאים וקטניות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סוג הדגימות

  1. השתמש בחמש דגימות דגנים מלאים, הכוללות שני דגנים (למשל, חיטת דורום ותירס צהוב) ושלוש קטניות (למשל, שעועית פרה שחורה, סויה ושעועית אדומה) לצורך מחקר זה.
  2. טוחנים 50 גרם של כל גרגר במשולש לקמח, באמצעות מטחנת קפה, ומעבירים אותם דרך מסננת של 500 מיקרומטר.
  3. אחסן אותם בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.

2. הכנת דוגמאות

  1. קביעת תכולת החומר היבש וביטוי בסיס משקל יבש
    הערה: קבע את תכולת החומר היבש של כל דגימת אבקה לפי השיטה של AOAC (2000)12.
    1. הפעילו תנור הסעה כפוי והגדירו את הטמפרטורה ל-130 מעלות צלזיוס.
    2. חומר מייבש יבש (ג'ל סיליקה) בתנור למשך 30 דקות עד שעה ומעביר את ג'ל הסיליקה המיובשת למייבש.
    3. שקלו במדויק 2 גרם מכל דגימה לתוך פחית אלומיניום נקייה, מיובשת מראש ושקולה.
    4. מייבשים את הדגימות השקולות בטמפרטורה של 130 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת בתנור הסעה מאולץ.
    5. מעבירים את הדגימה המיובשת למייבש ומאפשרים להתקרר לטמפרטורת הסביבה.
    6. שקלו את הדגימה המיובשת והמקוררת ותעדו את משקלה.
    7. חשב את תכולת החומר היבש של כל דגימה באופן הבא:
      figure-protocol-1
    8. ציין כל פרמטר שנמדד על בסיס משקל יבש באמצעות הנוסחה הבאה:
      figure-protocol-2
  2. מיצוי חומצה פנולית
    הערה: חלץ את התרכובות הפנוליות החופשיות המסיסות בדגימות הדגנים באמצעות שינוי השיטה של Y. Qiu et al.5 המאפשרת מיצוי פנולי מכמויות מיליגרם של דגנים מלאים.
    1. שקלו במדויק 100 מ"ג מדגימת הקמח המלא ישירות לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בצבע ענבר בקיבולת של 2 מ"ל. הצבע הכהה של הצינור מסייע למנוע חשיפה של התערובת לאור.
    2. הוסף 1 מ"ל של 80% מתנול מימי ברמת HPLC לכל אחד מהצינורות המכילים את הדגימות.
    3. מערבולת לזמן קצר כדי לערבב את תמיסת המתנול ואת הדגימות.
    4. Sonicate את הדגימות במשך 60 דקות כדי לחלץ את התרכובות הפנוליות המסיסות בחינם. שים כיסוי על הדגימות למשך הזמן של הסוניקציה להגנה נוספת מפני אור.
    5. לאחר הסוניקציה, צנטריפוגה של התערובת ב-20,000 × גרם למשך 5 דקות כדי להקדיש את השאריות המוצקות ולהשאיר את הסופרנאטנט למעלה. תרכובות פנוליות חופשיות יהיו קיימות בסופרנאטנט לאחר צנטריפוגה.
    6. מעבירים את ה-supernatant לתוך צינור מיקרו-סנטריפוג' נקי.
      הערה: יש לסנן את ה-supernatant לפני ההזרקה למכשיר ה-HPLC. כדי לסנן את המזרק, הסר את הבוכנה של מזרק 3 מ"ל והצמד מסנן מזרק. המסנן צריך להיות בגודל נקבובית של לא יותר מ 0.22 μm.
    7. פיפטה כ-0.4 מ"ל של ה-supernatant לתוך החלק העליון של המזרק. הכנס מחדש את הבוכנה ודחף את הנוזל דרך המסנן לתוך בקבוקון HPLC המכיל תוספת בקבוקון.
    8. לאחר שהמכשיר הוגדר להפעלת השיטה המתוארת בכתב היד לניתוח HPLC, טען את הבקבוקונים לתוך הקרוסלה כדי להתאים לרשימת הדגימות.
    9. קבל כרומטוגרמות HPLC ב- 320 ננומטר ו- 280 ננומטר המציגות פסגות נפרדות המייצגות תרכובות פנוליות שונות.
    10. באמצעות עקומות סטנדרטיות מתאימות, כימתו חומצות הידרוקסיצינמיות ב-320 ננומטר מכיוון שיש להן ספיגה מקסימלית באורך גל זה. על פי אותו עיקרון, לכמת חומצות הידרוקסיבנזואיות ב 280 ננומטר.
    11. אחסן את התמציות הנותרות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס לניתוחים אחרים.

3. הרכב פנולי

  1. השתמש בכרומטוגרף נוזלי בלחץ גבוה (טבלת חומרים) כדי לזהות ולכמת את התרכובות הפנוליות המופקות בדגימות, בהתבסס על השיטה של J. Xiang, F.B. Apea-Bah, V. U. Ndolo, M.C. Katundu ו- T. Beta 4.
  2. הכינו את תקני החומצה הפנולית (חומצה ונילית, חומצה קפאית, חומצה p-קומרית, חומצה פרולית וחומצה סינאפית) כדי לזהות ולכמת תרכובות פנוליות מרכיבות בתמציות.
  3. לשם כך, שקלו 1 מ"ג מכל תקן והתמוססו ב-1 מ"ל של 50% מתנול מימי כדי לייצר 1,000 מיקרוגרם/מ"ל מכל תקן.
  4. מערבבים נפחים שווים של כל חמשת התקנים בצינור צנטריפוגת ענבר של 2 מ"ל כדי לייצר קוקטייל של תקנים, שלכל אחד מהם יש ריכוז של 200 מיקרוגרם/מ"ל.
  5. מכינים דילולים סדרתיים של הקוקטייל הסטנדרטי על ידי לקיחת נפח לתוך צינור חדש ודילול בנפח שווה של ממס מתנול מימי.
  6. חזור על הדילולים הסדרתיים עד לריכוז של 3.125 מיקרוגרם/מ"ל.
  7. כמו כן, דיללו בנפרד כל תקן 40 פעמים עם הממס כדי לקבל ריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל של כל תקן.
  8. הגדר את טמפרטורת העמודה ל- 35 °C (85 °F) ואת טמפרטורת התנור לדוגמה ל - 15 °C (74 °F).
  9. כדי להכין פאזה ניידת A (0.1% חומצה פורמית מימית), מעבירים 1 מ"ל של חומצה פורמית לבקבוקון נפחי בקיבולת של 1 ליטר ומוסיפים מים ברמת HPLC לסימן 1 ליטר. לנער היטב כדי לערבב.
  10. כדי להכין פאזה B ניידת (0.1% חומצה פורמית במתנול), מעבירים 1 מ"ל של חומצה פורמית לתוך בקבוקון נפחי בקיבולת של 1 ליטר ומוסיפים מתנול ברמת HPLC לסימן 1 ליטר. לנער היטב כדי לערבב.
  11. התאם את אמצעי האחסון לסימן 1 L במידת הצורך.
  12. סנן את שני השלבים הניידים באמצעות מסנן הידרופילי של 0.45 מיקרומטר.
  13. לצורך הניתוח, הזריקו 10 μL מכל תמצית או תקן (תקני 25 מיקרוגרם/מ"ל והקוקטיילים הסטנדרטיים) לעמודת הפאזה ההפוכה.
  14. Elute עם השלבים הניידים על פי תוכנית השיפוע הליניארית למשך 25 דקות ריצה כדלקמן: 0-3.81 דקות, 9%-14% B; 3.81-4.85 דקות, 14%-15% B; 4.85-5.89 דקות, 15%-15% B, 5.89-8.32 דקות, 15%-17% B; 8.32-9.71 דקות, 17%-19% B; 9.71-10.40 דקות, 19%-19% B; 10.40-12.48 דקות, 19%-26% B; 12.48-13.17 דקות, 16%-28% B; 13.17-14.21 דקות, 28%-35% B; 14.21-15.95 דקות, 35%-40% B; 15.95-16.64 דקות, 40%-48% B; 16.64-18.37 דקות, 48%-53% B; 18.37-22.53 דקות, 53%-70% B; 22.53-22.88 דקות, 70%-90% B; 22.88-25.00 דקות, 90% B.
  15. השווה את זמני השמירה של פסגות כרומטוגרפיות שהתקבלו עבור הסטנדרטים האותנטיים של ריכוזים 25 מיקרוגרם/מ"ל, ב-280 ננומטר ו-320 ננומטר, עם אלה של התמציות, על מנת לזהות את התרכובות הפנוליות המרכיבות בדגימות.
  16. עקומות כיול התוויה עבור קוקטיילים סטנדרטיים של חומצה פנולית, עם ריכוז של התקנים על הציר האופקי, ושטח השיא על הציר האנכי
  17. השתמש בעקומות הכיול כדי להעריך את הריכוזים של התרכובות הפנוליות שזוהו, על ידי השוואת אזורי השיא בחלקה לאלה של התרכובות שזוהו ב-280 ננומטר ו-320 ננומטר כפי שצוין בסעיף הקודם.

4. סך הכל תוכן פנולי

הערה: קבע את התוכן הפנולי הכולל של התמציות באמצעות שיטת Folin-Ciocalteu המתוארת על ידי F.B. Apea-Bah et al.13.

  1. הכינו את תקני החומצה הפרולית וחומצה הגאלית בטווח הריכוזים של 0.025 עד 0.150 מ"ג/מ"ל כדי להתוות עקומות כיול בהשוואה, להערכת התוכן הפנולי הכולל.
  2. כדי לעשות זאת, שקלו במדויק 1 מ"ג כל אחד מהסטנדרטים של חומצה פרולית וחומצה גלית לצינורות צנטריפוגה בקיבולת של 2 מ"ל.
  3. הוסיפו 1 מ"ל של 50% מתנול מימי לכל תקן ומערבולת להתמוססות, והפיקו מלאי של 1 מ"ג/מ"ל מכל תקן.
  4. הכן סדרה של דילולים מכל פתרון מלאי בסך הכל 500 μL.
  5. פיפט 18.2 μL של כל תמצית או תקן לתוך באר נפרדת על לוחית מיקרו של 96 בארות.
  6. הוסף 36.4 μL של 10% (v/v) מגיב Folin-Ciocalteu מימי לכל תמצית או תקן.
  7. לאחר מכן, הוסף 145.4 μL של 700 mM נתרן פחמתי לכל תערובת תגובה.
  8. דגירה של תערובות התגובה בחושך בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס) למשך שעתיים.
  9. קרא את הספיגה בקורא מיקרו-לוחיות ב-750 ננומטר.
  10. התווה עקומות כיול של שינוי בספיגה כנגד ריכוז תקני החומצה הפנולית והשתמש בהן כדי להעריך את סך התוכן הפנולי.
  11. ציין את התוצאות כשווה ערך לחומצה פרולית מיליגרם לגרם של דגימה טחונה (mg FAE/g) וחומצה גאלית מיליגרם שווה ערך לגרם של דגימה טחונה (mg GAE/g) על בסיס משקל יבש.

5. מבחני נוגדי חמצון

הערה: קבע את הקיבולת נוגדת החמצון של תמציות הדגנים באמצעות שלושת המבחנים הבאים: 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידראזיל (DPPH) יכולת נבלה רדיקלית של 2,2-דיפניל-1-פיקריל-הידרזיל (DPPH); 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) יכולת נבלה רדיקלית (ABTS), הנקראת גם יכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC); ויכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC).

  1. הכנת תקני Trolox לקימורים סטנדרטיים
    1. השתמשו ב-Trolox, אנלוגיה מסיסה במים של ויטמין E, כסטנדרט כדי להעריך את היכולת נוגדת החמצון במבחנה של תמציות הדגנים המלאים.
    2. שוקלים במדויק 1 מ"ג של Trolox לתוך צינור 15 מ"ל. להמיס ב 4 מ"ל של 50% מתנול מימי. מערבולת להתמוסס כדי להכין תמיסת מלאי של 1 mM (1000 μM).
    3. הכינו שישה ריכוזים של Trolox, כלומר, 50, 100, 200, 400, 600 ו-800 μM כדי להתוות עקומות סטנדרטיות להערכת יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH ויכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC). באופן דומה, הכינו ריכוזים של 6.25, 12.5, 25 ו-50 מיקרומטר של Trolox להערכת יכולת ספיגת רדיקלי חמצן (ORAC). התאם את הנפח הכולל של כל ריכוז ל- 500 μL כפי שמוצג בטבלה 1.
  2. דילול תמציות דגימה
    1. דיללו את תמציות הדגימה עם מתנול לפני הניתוח. כאן, תמציות תירס צהובות ופרות דוללו פעמיים, החיטה ופולי הכליה דוללו חמש פעמים ואילו תמצית הסויה דוללה 10 פעמים עם מתנול.
  3. בדיקת יכולת נוגדת חמצון שוות ערך לטרולוקס (TEAC)
    1. מדוד את היכולת נוגדת החמצון המקבילה של Trolox (TEAC) של הדגימות בשיטה שתוארה קודם לכן על ידי F.B. Apea-Bah et al.14.
    2. שקלו 8.23 מ"ג של ABTS לתוך צינור צנטריפוגת ענבר נקי בקיבולת של 2 מ"ל.
    3. לאחר מכן, שקלו 1.62 מ"ג של אשלגן פרסולפט לצינור צנטריפוגת ענבר נקי נוסף בקיבולת של 2 מ"ל.
    4. מוסיפים 1 מ"ל מים מזוקקים לכל אחד מהם ומערבולת כדי להמיס אותם.
      הערה: התוצאה היא תמיסת מלאי ABTS של 16 mM עם תמיסת אשלגן פרסולפט מימית של 6 mM.
    5. הכן את תמיסת מלאי ABTS על ידי ערבוב תמיסות ABTS ואשלגן פרסולפט בכמויות שוות. הפתרון ישתנה מיד לצבע כהה.
    6. דגירה של תערובת הריאגנטים בחושך במשך 12-16 שעות.
    7. דיללו את תמיסת ה-ABTS 30 פעמים עם 200 mM פוספט עם מלח (PBS), כדי ליצור את תמיסת העבודה של ABTS. לשם כך, הוסף 58 מ"ל של 200 mM PBS ל-2 מ"ל של פתרון המניות ABTS. הפתרון העובד יכיל 0.27 mM ABTS ו 0.1 mM אשלגן persulfate.
    8. לצורך הניתוח, יש למקם 10 μL של כל תמצית מדוללת או Trolox לתוך מיקרו-פלטה של 96 בארות.
    9. מוסיפים 190 μL של תמיסת עבודה ABTS לכל באר ומדגרים את תערובות התגובה למשך 60 דקות.
    10. מודדים את הספיגה של תערובות התגובה ב-750 ננומטר בקורא מיקרו-פלטה.
    11. השתמש בתקני Trolox בריכוז הנע בין 100 ל-800 מיקרומול/ל' כדי להתוות עקומת כיול.
    12. הערך את יכולת הנבלה הרדיקלית של ABTS מעקומת הכיול.
    13. להביע את התוצאות כמיקרומול Trolox שווה ערך לכל גרם (μmol TE/g) דגימה על בסיס משקל יבש.
  4. בדיקת DPPH
    הערה: קבע את יכולת הנבלה הרדיקלית של DPPH של הדגימות בשיטה שתוארה קודם לכן על ידי F.B. Apea-Bah et al.13. הבדיקה נוגדת החמצון DPPH דורשת תרכובת יוצרת רדיקלים, DPPH (2,2-דיפניל-1-פיקריל הידרזיל).
    1. שקלו במדויק 1.2 מ"ג של DPPH לתוך צינור צנטריפוגה ריק בקיבולת של 50 מ"ל. ממיסים את ה-DPPH ב-30 מ"ל של מתנול כדי להכין תמיסת מתאנולית של 60 מיקרומול/ל'.
      הערה: בדיקת DPPH בודקת את היכולת של תמציות הדגימה לנטרל רדיקלים חופשיים המיוצרים על ידי DPPH.
    2. לצורך הניתוח, הוסף 5 μL של תמציות הדגימה או תמיסת Trolox לתוך בארות microplate.
    3. לאחר מכן, הוסיפו 195 μL של תמיסת 60 μmol/L DPPH methanolic ודגירה למשך 60 דקות.
    4. למדוד את הספיגה של תערובת התגובה ב 515 ננומטר.
    5. השתמש בתקני Trolox (50-800 μmol/L) כדי להתוות עקומת כיול, עם השינוי בספיגה על הציר האנכי וריכוזי Trolox על הציר האופקי.
    6. הערך את יכולת הנבלה של DPPH מעקומת הכיול.
    7. להביע את התוצאות כמיקרומול Trolox שווה ערך לכל גרם (μmol TE/g) דגימה על בסיס משקל יבש.
  5. יכולת ספיגת רדיקלי חמצן
    1. קבע את יכולת הספיגה של רדיקלי החמצן (ORAC) של הדגימות בהתבסס על השיטה של F.B. Apea-Bah et al.13.
    2. כדי להתחיל, הכינו את תקני Trolox בריכוזים 6.25, 12.5, 25 ו-50 μM מתמיסת מלאי סטנדרטית של 1,000 μM Trolox ב-75 mM אשלגן פוספט (K2HPO4/KH2PO4).
    3. כדי לעשות זאת, שקלו 1 מ"ג אבקת Trolox והתמוססו ב-4 מ"ל של תמיסת המאגר תחת סוניקציה כדי להכין תמיסת מלאי של 1,000 μM.
    4. לאחר מכן, קח 50 μL של תמיסת המלאי לתוך צינור צנטריפוגה בקיבולת של 2 מ"ל ודילל עם 950 μL של תמיסת buffer כדי להשיג 1,000 μL של תמיסת μM Trolox של 50 μM.
    5. Pipette 500 μL של תמיסת 50 μM לתוך צינור חדש ומדולל עם נפח שווה של חיץ כדי לקבל תמיסת 25 μM Trolox.
    6. חזור על הדילול הטורי של 25 μM כדי לקבל 12.5 μM, ולאחר מכן חזור באופן דומה על הדילול של 12.5 μM כדי לקבל 6.25 μM.
    7. הכן דילולים מתאימים של תמציות הדגימה.
    8. מדללים את תמציות התירס הצהוב והפרה 20 פעמים, את תמציות החיטה והשעועית הכליות 50 פעמים, ואת תמצית הסויה 100 פעמים עם תמיסת החיץ.
    9. העבר 200 μL של כל דגימה או תקן Trolox לתוך הבארות של מיקרו-לוח שחור של 96 בארות עבור צנרת אוטומטית.
    10. לאחר מכן, מלא את שלושת מיכלי הריאגנטים המסופקים עם ציוד ORAC, עם הדברים הבאים: (1) פתרון החיץ; (2) 0.816 ננומטר פלואורסצין במאגר; ו-(3) 153 מ"מ של 2,2′-אזוביס(2-אמידינופרופאן) דיהידרוכלוריד (AAPH) בחיץ.
    11. הניחו אותם בכלי הקיבול שלהם לצורך צנרת אוטומטית.
    12. הגדר את מכונת ORAC ואת מערכת הצינורות האוטומטית לניתוח, בהתבסס על נוהל ההפעלה הסטנדרטי.
    13. לצורך הניתוח, הגדר את מערכת הצינורות האוטומטית להעברת 25 μL של כל תמצית מדוללת או תקן לבארות של מיקרו-פלטה שחורה שקופה של 96 בארות.
    14. לאחר מכן, הוסף באופן אוטומטי 150 μL של 0.816 ננומטר פלואורסצין במאגר.
    15. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות במכונת ORAC.
    16. לאחר מכן, הוסף באופן אוטומטי 25 μL של AAPH לכל תערובת תגובה.
    17. דגירה אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות במכונת ORAC.
    18. הגדר את מכונת ORAC למדידת הדעיכה הפלואורסצנטית, במהלך תקופת הדגירה, באורכי גל של עירור ופליטה של 485 ננומטר ו-520 ננומטר, בהתאמה.
    19. לאחר המדידות, התווה עקומת תקן Trolox, עם Trolox (6.25-50 μM) על הציר האופקי ודעיכה פלואורסצנטית על הציר האנכי.
    20. הערך את יכולת הספיגה של רדיקלי החמצן של התמציות מהעקומה הסטנדרטית של Trolox.
    21. ציין את התוצאות כדגימת μmol TE/g על בסיס משקל יבש.
  6. ניתוח סטטיסטי
    1. הצג את כל התוצאות כאמצעי ± סטיית תקן של לפחות משולשים.
    2. בצע ניתוח של שונות (ANOVA) כדי לקבוע את ההשפעה של סוג גרגר על משתני התגובה.
    3. כאשר קיימים הבדלים משמעותיים ב- p < 0.05, השתמש בהפרש הכי פחות משמעותי (LSD) כדי להשוות את האמצעים.
    4. בצע ניתוח מתאם פירסון כדי להעריך את הקשר בין התוכן הפנולי ליכולות נוגדות החמצון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טבלה 2 מציגה את החומצות הפנוליות שזוהו בדגנים ובגרגרי הקטניות. בהתבסס על סטנדרטים אותנטיים זמינים, ארבע חומצות פנוליות זוהו בדגימות והן: חומצות וניליות, קפאיות, p-קומרית ופרוליות. חומצה ונילית היא חומצה הידרוקסיבנזואית ואילו שלוש האחרות הן חומצות הידרוקסיצינמיות. חומצה ונילית זוהתה רק בפולים של בלאק איי, בעוד שחומצה קפאית זוהתה רק בפולים בכליות. חומצה p-קומרית זוהתה בתירס צהוב, שעועית פרה וסויה. ריכוזו נע בין 7.57 ל-12.48 מיקרוגרם/גרם קמח על בסיס משקל יבש, כאשר לתירס הצהוב היה הערך הנמו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדגנים המלאים נבחרו כדגני דגנים וקטניות מייצגים שמוצאים שימושים נרחבים במזון ברחבי העולם. בעוד ששינויים עשויים להתקיים בין זנים של כל גרגר, מוקד המחקר הזה היה להדגים שיטה כללית למיצוי ואנליזה של חומצה פנולית בחינם עבור דגנים מלאים. שיטת המיצוי שונתה על ידי הפחתה משמעותית של כמויות הדגימות והממסים, על מנת להפחית את כמות הכימיקלים שישוחררו לסביבה כאשר ניסויים כאלה ייערכו. השינוי מאפשר גם מיצוי פנולי מכמויות מיליגרם של דגנים מלאים.

ניתוח HPLC מייצר כרומטוגרמה של החומצות הפנוליות המרכיבות בדגימה. ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים על היעדר ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בהכרת תודה על התמיכה הטכנית של גב ' אליסון סר וגב ' האנה אודורו-אובנג, כמו גם על התמיכה בעריכת וידאו על ידי גב 'ג'ניס פג'רדו ומר מיגל דל רוסאריו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים פלקוןפישר סיינטיפיק05-527-90
2 מ"ל זכוכית ענבר מזהה בקבוקון Surestop ThermoScientificC5000-2W
2 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה ענברVWR20170-084
2,2′-אזוביס (2-אמידינופרופאן) דיהידרוכלוריד (AAPH)סיגמא-אולדריץ'440914-100G
2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) (C18H18N4O6S4) ≥ 98%,סיגמא אולדריץ'A1888-2G
2,2-דיפניל-1pikrylhydrazyl (DPPH) (C18H12N5O6)Sigma AldrichD913-2
6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox) (C14H18O4), ≥ 98%Fluka Chemika56510
9 מ"מ Autosampler בקבוקון בורג הברגה מכסיםThermo Scientific60180-670
96 באר צלחות תחתונות שטוחותפישר סיינטיפיק12565501
Agilent BioTek ELx800 קורא מיקרופלייטפישר סיינטיפיקBT-ELX800NB
Agilent BioTek Precision 2000 96/384 מערכת צנרת מיקרופלייט אוטומטיתפישר ScientificN/A
Agilent BioTek FLx800 קורא פלואורסצנטי מיקרופלייטפישר סיינטיפיקN/A
איזון אנליטי SI-114Denver InstrumentSI-114.1
דגימה אוטומטית, ווטרס 717 פלוסווטרסWAT078900
BD 3 מ"ל מזרק Luer-Lok TipBD309657
מנקה קולי ברנסוניק, ברנסון 5510Millipore SigmaZ245143
Corning LSE מערבולת מיקסרקורנינג6775
מסנן Durapore (0.45 µ m PVDF ממברנה)Merck Millipore בע"מHVLP04700 
מסנני ממברנה Durapore (0.45 ומיקרו; m HV)Merck Millipore LtdHVHP04700
Eppendorf Research  פלוס, 0.5-10 ומיקרו; לאפנדורף3123000020
מחקר אפנדורף  פלוס, 0.5-5 מ"לEppendorf3123000071
Eppendorf Research  בנוסף, 100-1000 ומיקרו; לאפנדורף3123000063
מחקר אפנדורף  בנוסף, 10-100 ומיקרו; LEppendorf3123000047
אתיל אצטט, HPLC כיתהפישר כימיE195-4
חומצה פרולית סטנדרטיתסיגמא אולדריץ'128708-5G
פלואורסצאיןפישר AC119245000
פולין & מגיב פנול CiocalteuSigma AldrichF9252
חומצה פורמית, 99%Acros Organics, Janssen Pharmaceuticalaan 3a27048-0010
תקן חומצה גאליתSigmaG7384
כרומטוגרף נוזלי בעל ביצועים גבוהים (HPLC), מים 2695מים960402
מתנול, HPLC כיתהפישר כימיקלA452-4
קצות מיקרו פיפט, 0.5-10 ומיקרו; Lפישרברנד21-197-2F
מיקרוצנטריפוגה Sorvall Legend Micro 21 צנטריפוגהThermo Scientific75002435
מיקרופיפטה רב ערוצית, פרולין פלוס, 30-300 ומיקרו; LSartorius728240
גלאי מערך פוטודיודה, Waters 2996 Waters720000350EN
קצות פיפט, 1000 ומיקרו; LVWR83007-382
קצות פיפט, 1-5 מ"לVWR82018-840
אשלגן פרסולפט (K2S2O8), ≥ 99.0%סיגמא אולדריץ'216224-100 גרם
אשלגן פוספט דו-בסיסי נטול מים (K2HPO4)Fisher ScientificP288-500
אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)Fisher ScientificP285-500
PYREX 250 מ"ל בקבוק רותח עם צוואר קצר, קורנינג4321-250
שלב הפוך C18 טור אנליטי (100 x 3 מ"מ) Accucore aQThermo Scientific17326-103030
מאייד רוטו, IKA RV 10IKA 
נתרן פחמתי (NaCO3) נטול מיםFisher ChemicalS263-1
נתרן כלורי (NaCl)Mallinckrodt AR®7581
נתרן פוספט דו-בסיסי נטול מים (Na2HPO4)Fisher ScientificBP332-500
נתרן פוספט חד-בסיסי נטול מים (NaH2PO4)ביו-ריאגנטים של פישרBP329-500
קצות פיפט סטנדרטיזציה 0-200µ Lפישרברנד02-681-134
יחידת מסנן מונעת מזרק (0.22 ומיקרו; m)  Millex®-GVSLGVR04NL
הכנסת בקבוקון מיקרו-סרטים יעד (400 µ L)Thermo ScientificC4011-631
מים טהורים במיוחד (מערכת UV ישירה Q-3 עם משאבה)MilliporeZRQSVP030
תחתון עגול 0010005185

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitu, O., et al. Silicon, endophytes and secondary metabolites as grass defenses against mammalian herbivores. Frontiers in Plant Science. 5, 478(2014).
  2. Joshi, J. R., Burdman, S., Lipsky, A., Yariv, S., Yedidia, I. Plant phenolic acids affect the virulence of Pectobacterium aroidearum and P. carotovorum ssp. brasiliense via quorum sensing regulation. Molecular Plant Pathology. 17 (4), 487-500 (2016).
  3. Dykes, L., Rooney, L. W. Phenolic compounds in cereal grains and their health benefits. Cereal Foods World. 52 (3), 105-111 (2007).
  4. Xiang, J., Apea-Bah, F. B., Ndolo, V. U., Katundu, M. C., Beta, T. Profile of phenolic compounds and antioxidant activity of finger millet varieties. Food Chemistry. 275, 361-368 (2019).
  5. Qiu, Y., Liu, Q., Beta, T. Antioxidant properties of commercial wild rice and analysis of soluble and insoluble phenolic acids. Food Chemistry. 121 (1), 140-147 (2010).
  6. Beverly, R. L. Encyclopedia of Food Safety. Motarjemi, Y. 3, Academic Press. 309-314 (2014).
  7. FAO. Food Outlook - Biannual report on global food markets. Food and Agriculture Organization. , Rome, Italy. (2020).
  8. Erbersdobler, H. F., Barth, C. A., Jahreis, G. Legumes in human nutrition. Nutrient content and protein quality of pulses. Ernahrungs Umschau. 64 (9), 134-139 (2017).
  9. Dueñas, M., Hernández, T., Estrella, I. Assessment of in vitro antioxidant capacity of the seed coat and the cotyledon of legumes in relation to their phenolic contents. Food Chemistry. 98 (1), 95-103 (2006).
  10. Khang, D. T., Dung, T. N., Elzaawely, A. A., Xuan, T. D. Phenolic profiles and antioxidant activity of germinated legumes. Foods. 5 (2), 27(2016).
  11. Hefni, M. E., Amann, L. S., Witthöft, C. M. A HPLC-UV method for the quantification of phenolic acids in cereals. Food Analytical Methods. 12 (12), 2802-2812 (2019).
  12. AOAC. Official Methods of Analysis. 17th edn. , Association of Official Analytical Chemists. Gaithersburg, MD, USA. (2000).
  13. Apea-Bah, F. B., Head, D., Scales, R., Bazylo, R., Beta, T. Hydrothermal extraction, a promising method for concentrating phenolic antioxidants from red osier dogwood (Cornus stolonifer) leaves and stems. Heliyon. 6 (10), 05158(2020).
  14. Apea-Bah, F. B., Minnaar, A., Bester, M. J., Duodu, K. G. Sorghum-cowpea composite porridge as a functional food, Part II: Antioxidant properties as affected by simulated in vitro gastrointestinal digestion. Food Chemistry. 197, Pt A 307-315 (2016).
  15. Robbins, R. J., Bean, S. R. Development of a quantitative high-performance liquid chromatography-photodiode array detection measurement system for phenolic acids. Journal of Chromatography A. 1038 (1-2), 97-105 (2004).
  16. Singleton, V. L., Rossi, J. A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  17. Prior, R. L., Wu, X., Schaich, K. Standardized methods for the determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (10), 4290-4302 (2005).
  18. Ainsworth, E. A., Gillespie, K. M. Estimation of total phenolic content and other oxidation substrates in plant tissues using Folin-Ciocalteu reagent. Nature Protocols. 2 (4), 875-877 (2007).
  19. Waterhouse, A. L. Determination of total phenolics. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. 1, 1-8 (2002).
  20. Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (6), 1841-1856 (2005).
  21. Esterbauer, H., Wäg, G., Puhl, H. Lipid peroxidation and its role in atherosclerosis. British Medical Bulletin. 49 (3), 566-576 (1993).
  22. Esterbauer, H., Gebicki, J., Puhl, H., Jürgens, G. The role of lipid peroxidation and antioxidants in oxidative modification of LDL. Free Radical Biology and Medicine. 13 (4), 341-390 (1992).
  23. Apea-Bah, F. B., Serem, J. C., Bester, M. J., Duodu, K. G. Phenolic composition and antioxidant properties of Koose, a deep-fat fried cowpea cake. Food Chemistry. 237, 247-256 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Phenolic Acid CompositionAntioxidant CapacityWhole GrainsCereals LegumesHPLC AnalysisDPPH AssayTrolox EquivalentORAC AssayFree Soluble PhenolicsTotal Phenolic Content

מאמרים קשורים