מאמר שיטה

ניתוח מתמיד של האביב המולקולרי על ידי ספקטרוסקופיית בדיקה כוח Biomembrane

DOI:

10.3791/62490

⸱

20 בנובמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גשושית כוח ביו-מברן (BFP) היא טכניקה של ספקטרוסקופיית כוח דינמית (DFS). BFP יכול לשמש כדי למדוד את קבוע האביב של אינטראקציות מולקולריות על תאים חיים. פרוטוקול זה מציג ניתוח מתמיד באביב עבור קשרים מולקולריים שזוהו על ידי BFP.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בדיקה כוח biomembrane (BFP) הופיע לאחרונה כמו פני תא יליד או ספקטרוסקופיה כוח דינמית במקום (DFS) ננו-אמול שיכול למדוד קינטיקה מחייבת מולקולרית אחת, להעריך תכונות מכניות של אינטראקציות קולטן ליגנד, לדמיין שינויים קונפורמציה דינמית חלבון ומרגש יותר לפרטנרציה של תאים מיושרים קולטן. לאחרונה, BFP שימש למדידת קבוע האביב של קשרים מולקולריים. פרוטוקול זה מתאר את ההליך שלב אחר שלב לביצוע ניתוח DFS קבוע קפיץ מולקולרי. באופן ספציפי, שני מצבי פעולה BFP נדונים, כלומר מצבי חרוז-תא וחרוזים. פרוטוקול זה מתמקד בהפקת קבועי האביב של הקשר המולקולרי והתא מנתונים גולמיים של DFS.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כניקת DFS של תאים חיים, BFP מהנדסת תא דם אדום אנושי (RBC; איור 1) לתוך מתמר כוח רגיש במיוחד וטונה עם טווח קבוע קפיץ תואם ב 0.1-3 pN / nm1,2,3. כדי לחקור אינטראקציה עם קולטן ליגנד, BFP מאפשר מדידות DFS ב~ 1 pN (10-12 N), ~ 3 ננומטר (10-9 מ '), ו ~ 0.5 ms (10-3 s) בכוח, מרחבי, ורזולוציה זמנית4,5. התצורה הניסיונית שלו מורכבת משני מיקרופיטים מנוגדים, כלומר הגשוש והמטרה. מיקרופיפט הגשושית שואף ל-RBC וחרוז מודבק בשיאו באמצעות אינטראקציה ביוטין-סטרפטבידין. החרוז מצופה בליגנד מעניין(איור 1A). המיקרופיט היעד שואף לתא או לחרוז הנושא את קולטן העניין, המתאים למצבי חרוז-תא (איור 1B) וחרוזים (איור 1C), בהתאמה5.

בניית BFP, הרכבה ופרוטוקולי הניסוי של DFS תוארו בפירוט בעבר1,6. בקצרה, מחזור מגע BFP מורכב מ-5 שלבים: גישה, פגיעה, מגע, חזרה ושיתוק (איור 1D). מיקום השיא האופקי של RBC מסומן כ- ΔxRBC. בהתחלה, עיוות RBC שאינו מנוטר (אפס כוח) ΔxRBC הוא 0 (טבלה 1). היעד מונע על ידי פייזו-טרנסלטור שיפגע בו ויסוג מחרוז הגשושית(איור 1D). הגשושית RBC נדחסת לראשונה על ידי היעד עם עיוות RBC שלילי ΔxRBC < 0. באירוע בונד, שלב ה-Retract עובר משלב דחיסה לשלב מתיחה עם עיוות RBC חיובי ΔxRBC > 0 (איור 2C ו- D). על פי החוק של הוק, כוח הנושא BFP הוא מסוגל להימדד כ- F = kRBC × ΔxRBC, שם kRBC (טבלה 1) הוא קבוע האביב RBC של BFP. לאחר קרע באג"ח והשלמת מחזור מגע אחד, חרוז הגשושית חוזר לעמדת אפס כוח עם ΔxRBC = 0 (איור 1D).

כדי לקבוע את ה- KRBC,אנו מודדים ומתעדים את הרדי של פתח המיקרופיט הפנימי של הגשושית (Rp), RBC (R0) ואזור המגע המעגלי (Rc) בין RBC לחרוז הגשושית ( איור1A). ואז kRBC מחושב על פי המודל של אוון (Eq. 1)7,8 באמצעות תוכנית LabVIEW הפועלת ככלי וירטואלי (VI) להפעלת ה- BFP ( איורS1A)8,9.

משוואת שיווי משקל סטטית עבור kRBC בדינמיקת זורמים, המציגה משתנים ומונחים לוגריתמיים. (א"ק 1)

עם BFP הוקם ונתונים גולמיים DFS הושגו, בזאת אנו מציגים כיצד לנתח את קבוע האביב של זוג קולטן ליגנד או תאים. הנתונים הגולמיים של DFS על האינטראקציה של החלבון הגליקוסילי Thy-1 ו- K562 הנושאים אינתגרין α5β1 (Thy-1-α5β1; איורים 3A ו-3B)10, ושל הפיברינוגן והחרוזים מצופים האינטיגרין αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; איור 3C) 11,12 שימשו כדי להדגים את מצבי ניתוח חרוז-תא וחרוזים, בהתאמה.

הכנה ניסיונית BFP
לקבלת פרטים על הכנה ניסויית ומכשור BFP, עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר3. בקצרה, RBC האנושי כבר biotinylated באמצעות ביוטין-PEG3500-NHS במאגר פחמן / ביקרבונט. חלבונים מעניינים הוצמדו באופן קוולנטי אל חרוזי הזכוכית הבורוסיליקט באמצעות MAL-PEG3500-NHS במאגר הפוספט. כדי לצרף RBC biotinylated, חרוז הגשושית מצופה גם סטרפטאבידין (SA) באמצעות MAL-SA. נא עיין בטבלת החומרים ושולחן 2.

כדי להרכיב את ה- BFP (איור 1, משמאל), המיקרופיט השלישי המכונה 'עוזר' ישמש להעברת חרוז הגשושית ולהדבקתו לשיא של RBC1,3. האינטראקציה הקוולנטית בין חרוז הגשושית מצופה SA לבין RBC הביוטיניל הוא הרבה יותר חזק מאשר קשר קולטן ליגנד של עניין. לפיכך, ניתן לפרש את שלב הניתוק כקרע בקשר קולטן ליגנד ולא כניתוק של חרוז הגשושית מה- RBC.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. השג אירועי DFS הניתנים לניתוח

  1. התחל את הניסוי בתוכנה (לדוגמה, LabVIEW VI) עבור הגדרת הבקרה והפרמטרים של BFP(איור S1A).
  2. שים לב לחרוזים/סלולריים חוזרים ונשנים של חרוזי החרוזים/תאים בתוכנה עבור צג BFP(איור S1B).
  3. בדוק והשג את תדירות ההדבקה ≤ 20% בתוך 50 הנגיעות הראשונות על ידי כוונון כוח ההחסה וזמן המגע, שבאמצעותו הוא מבטיח כי ≥ 89% מאירוע הידבקות DFS מתווכים על ידי אג"ח בודדות12,13,14.
    הערה: עבור כל זוג חרוזים/חרוזים, אנו מבצעים 200 מחזורי מגע חוזרים ונשנים. כדי להשיג איכות נתונים הניתנת לפרסום, אנו מבצעים בדרך כלל n ≥ 3 זוגות חרוזים או חרוזים.
    1. שמור נתונים, בצורה של כוח לעומת זמן, לתיקיה המופנית על-ידי המשתמש עד סוף כל זוג, שהתבקשה על-ידי התוכנה עבור פקד BFP והגדרת פרמטר.
  4. אסוף את הנתונים הגולמיים של כוח לעומת זמן של אירועי בונד, כפי שהם מדגמנים באיור 2A, באמצעות פלטפורמת הרכישה BFP (איור S1C).
    1. פתח את תוכנת ניתוח הנתונים של BFP. לחץ על סמל התיקייה הצהובה ובחר את קובץ הנתונים הגולמי המתאים על ידי לחיצה כפולה עליהם.
  5. הפעל את התוכנית ולאחר מכן לחץ על לחצן למעלה ולמטה כדי לעבור בין אירועים. השתמש בקריטריוני אי-הכללה חריגים (איור S2) כדי לסנן אירועים לא חוקיים. בחר את סוג הנתונים המייצא כתבנית כוח לעומת זמן ולחץ על לחצן יצא נתוני התוויות.

2. המר את עקומת הכוח לעומת הזמן לעקומת הכוח לעומת עקומת ההעתקה

  1. יצא את מקטע הנתונים המתאים לשלב 'ביטול' לגיליון אלקטרוני (איור 2A, כתובית מרובעת),הרלוונטי לניתוח הקבוע של האביב.
  2. התווה את עקומת הכוח לעומת הזמן באמצעות תוכנת גיליון אלקטרוני. כדי להשיג את עקומת הכוח לעומת עקירה, המר את ערכי הזמן(איור 2A, x-ציר) לערכי ההעתקה הכוללים (Δxtot) על-ידי הכפלת ערכי הזמן במהירות תנועת פיזו (כלומר, 4,000 ננומטר/שניה לפי קביעה מוגדרת מראש).
  3. אפס את נקודת הנתונים הראשונה על-ידי הפחתה של ערך ההעתקה הקטן ביותר מכל ערך תזוזה שנרכש. שינוי אופקי זה אינו משפיע על השיפועים העולים של שלב ההסרה או על חישוב קבוע האביב הבא.
  4. ראוי לציין, BFP נחשב כמערכת קפיצית סדרתית שבה Δxטוט (טבלה 1) סיכום עיוותים של RBC, ΔxRBC (טבלה 1),הקשר המולקולרי, Δxמול ( טבלה1), ותא היעד, Δxתא (טבלה 1), כמו Eq. 2:
    משוואת שיווי משקל סטטית Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, נוסחה מתמטית. (א"ק 2)
  5. התווה את העקומה כוח (F) לעומת תזוזה (Δxטוט)כפי שמוצג באיור 2B.

3. ניתוח קן-ים באביב של מצב חרוזים- תא

  1. בעקומת הכוח לעומת תזוזה, ניתן לזהות שני רשלנות נפרדת, שבה כל אחד יכול לייצג את שלב הדחיסה ואת שלב המתיחה. התאם קו רגרסיה לכל קבוצת נתונים (איור 2B), כאשר שיפוע ההתאמה הליניארית הגדול יותר מייצג את קבוע הקפיצה הכולל בשלב דחיסה (איור 2B, אדום),מסומן כ- k1 (טבלה 1); ושיפוע ההתאמה הליניארי הקטן יותר מייצג את קבוע האביב הכולל בשלב מתיחה(איור 2B, כחול),המציין כ- k2 (טבלה 1).
  2. עבור קפיצים המחוברים בסדרה לכל שלב 2.2 תיאור, לבטא את ההדדיות של קבוע האביב הכולל, kטוט (טבלה 1), כסכום של הפוך קבוע האביב של RBC, kRBC (טבלה 1), הקשר המולקולרי, kמול (טבלה 1), ותא היעד,תא k(טבלה 1). במהלך שלב הדחיסה של מצב חרוז-תא, הקשר המולקולרי אינו נמתח, ולכן kמול אינו נלקח בחשבון. ההדדיות של ktot בתרחיש זה (1/k1) באה לידי ביטוי כ
    משוואה המייצגת קינטיקה של התא בביולוגיה; דיאגרמה של קבועים קינטיים: k1, kRBC, kcell. (א"ק ג).
    בנתונים לדוגמה, kRBC נקבע מראש (0.25 pN/nm כברירת מחדל). ניתן להפיק תא k מה- Eq. 3 עם k1 ו- kRBC שנרכשו (איור 3B).
  3. במהלך שלב המתיחה, הידבקות נוצרת בין זוג קולטן ליגנד. לבטא את ההדדיות של kטוט בתרחיש זה (1/k2) כ
    משוואת ההתנגדות בסדרה, המציגה 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell, המשמשת במחקר קינטיקה. (א"ק 4)
    כאשר k2 (טבלה 1) מייצג את קבוע האביב הכולל במהלך שלב המתיחה.
  4. יש להפיק kמול מהפחתה 1/k1 מ 1/k2 (השווה Eq. 3 לעומת Eq. 4).

4. ניתוח מתמיד של מצב חרוזים- חרוזים באביב

  1. התאם קו רגרסיה לנתוני שלב הדחיסה כדי להשיג k1 (בדומה לאיור 2B, אדום). שימו לב, במצב חרוז-חרוז, תא היעד מוחלף בחררוז זכוכית מצופה בקולטן העניין(איור 1C). מאחר שעיוות חרוזים זניח, ניתן להסיר את מונחתא 1/kמה- Eq. 3 ו- Eq. 4 בהתאם. ניתן לבטא אתהטוט הקיט ההדדישל שלב הדחיסה (1/k1) כ:
    משוואה המציגה קשר: 1/k1 = 1/kRBC; מפתח לקבועי קצב קינטי בניתוח ביוכימי. (א"ק 5)
  2. התאם קו רגרסיה לנתוני שלב המתיחה כדי להשיג k2 (בדומה לאיור 2B, כחול). ניתן לבטא אתהטוט הקתי ההדדישל שלב המתיחה (1/k2)כ:
    משוואת קצב תגובה, דיאגרמת קבועי קצב הפוך; k2, kRBC, מונחי kmol לניתוח קינטיקה. (א"ק 6)
  3. יש להפיק kמול מהפחתה 1/k1 מ- 1/k2 (השווה Eq. 5 לעומת Eq. 6).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעבודה זו, הדגמנו את הפרוטוקול של ניתוח מתמיד האביב BFP. עבור מצב ניתוח חרוז-תא, ניתחנו את kמול של הקשר המולקולרי בין חלבון גליקוסילאט Thy-1 מצופה חרוז בדיקה ואת האינתגרין α5β1 לידי ביטוי על תא היעד K562 (Thy-1-integrin α5β1; איור 3א) 10.תא kנגזר גם ממצב תא חרוזים (תא K562; איור 3B). עבור מצב חרוז-חרוז, הקשר המולקולרי שנוצר בין פיברינוגן לאינטגרין αI...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסיכום, סיפקנו פרוטוקול ניתוח נתונים מפורט עבור עיבוד מראש של הנתונים הגולמיים של DFS וגזירת קבועי קפיץ מולקולריים במצבי ניתוח חרוזים וחרוזים BFP. מודלים ומשוואות ביומכניים הנדרשים לקביעת קבועי קפיץ מולקולריים ותאיים מוצגים. למרות שנלמדים אינטילגרינים שונים, ה-kמול הנמדד על ידי מצב חרוז-חרוז ומצב חרוז-תא הוא בעל הבדלי טווח משמעותיים(איור 3A לעומת איור 3C). שימו לב, עם מצב חרוז-חרוז, הקולטן מקושר באופן קוולנטי חרוז הזכוכית. לעומת זאת, עם מצב ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים לדווח לגבי המחקר הנוכחי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לגיום טרואדק על הדיון המועיל, זיהאו וואנג לייעוץ בחומרה, ולמרכז הייצור של סידני, גרג סואנינג וסיימון רינגר על התמיכה בסטארט-אפ המעבדה שלנו. עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט דיסקברי מועצת המחקר האוסטרלית (DP200101970 - L.A.J.), תוכנית בניית קיבולת לב וכלי דם של NSW (מענק חוקר קריירה בתחילת אמצע - L.A.J.), פרס מאיץ המחקר של סידני (SOAR - L.A.J.), ראמאסיו מענק השקעות בריאות קרנות טי (2020HIG76 - L.A.J.), מענק רעיונות לבריאות ומחקר רפואי לאומי (APP2003904 - L.A.J.), וקרן הסטארט-אפ של הפקולטה להנדסה באוניברסיטת סידני ותוכנית ציוד גדולה (L.A.J.). בטנה ארנולד ג'ו הוא עמית מועצת המחקר האוסטרלית DECRA (DE190100609).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)Uct, Specialties, LLC4420-74-0פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
Anhy. נתרן פוספט דו-בסיסי (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907הכנת מאגר פוספט
רכישת נתוני BFP VILabVIEWבקרת BFP וקביעת פרמטרים
ניתוח נתוני BFP VILabVIEWניתוח נתונים גולמיים של BFP
ביוטין-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC ביוטינילציה
חרוזי זכוכית בורוסיליקטטכנולוגיית חלקיקים Distrilab, הולנד9002פונקציית חרוזי זכוכית
אלבומין סרום בקרסיגמא-אולדריץ'A0336ליגנד פונקציונליזציה
מצלמה VILabVIEWניטור BFP
D-glucoseSigma-AldrichG7021Tyrode' הכנת מאגר Hepes
Sigma-AldrichH3375Tyrode' הכנת חיץ
s MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
אשלגן כלורי (KCl)סיגמא-אולדריץP9541טירוד ' הכנת חיץ
s נתרן ביקרבונט (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761הכנת מאגר קרבונט/ביקרבונט; טירוד" הכנת בופר
s נתרן קרבונט (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127הכנת חיץ קרבונט/ביקרבונט
נתרן כלורי (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' הכנת חוצץ נתרן
פוספט מונו-ביסיק מונוהידראט (NaH2PO4& bull; H2O)Sigma-AldrichS9638הכנת מאגר פוספט
Streptavidin-MaleimideSigma-AldrichS9415פונקציונליזציה של חרוזי זכוכית
'

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
  15. Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation. Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).
  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

מאמרים קשורים