שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

סיכום

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.

תקציר

Micropatterning היא טכניקה מבוססת בקהילת הביולוגיה של התא המשמשת לחקר קשרים בין המורפולוגיה והתפקוד של תאים תאיים תוך עקיפת סיבוכים הנובעים מווריאציות טבעיות של תא לתא. כדי לתקנן את צורת התא, התאים מוגבלים בתבניות תלת-ממדיות או נשלטים עבור גיאומטריה דביקה דרך איים דביקים. עם זאת, טכניקות micropatterning מסורתיות המבוססות על פוטוליטוגרפיה ותחיריט UV עמוק תלויות במידה רבה בחדרים נקיים או בציוד מיוחד. כאן אנו מציגים טכניקת מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום (microphotopatterning) שונה דויל ואח '. שניתן להגדיר בנוחות עם מערכות הדמיה זמין מסחרית. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים במערכת הדמיה ניקון A1R MP+ כדי ליצור micropatterns עם דיוק מיקרון באמצעות לייזר אינפרא אדום (IR) כי ablates אזורים קבועים מראש על כיסויים מצופים אלכוהול פולי ויניל. אנו משתמשים בסקריפט מותאם אישית כדי לאפשר ייצור דפוסים אוטומטי ביעילות ובדיוק גבוהים במערכות שאינן מצוידות בפוקוס אוטומטי של חומרה. אנו מראים כי זה לייזר IR סייע micropatterning (microphotopatterning) הפרוטוקול תוצאות דפוסים מוגדרים אשר תאים לצרף באופן בלעדי ולקחת על הצורה הרצויה. יתר על כן, נתונים ממספר גדול של תאים ניתן ממוצע עקב סטנדרטיזציה של צורת התא. דפוסים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה, בשילוב עם הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח כמותי, יכולים לשמש למסכי תפוקה גבוהים יחסית לזיהוי שחקנים מולקולריים המתווכים את הקשר בין צורה לתפקוד.

מבוא

צורת התא היא דטרמיננטה מרכזית של תהליכים ביולוגיים בסיסיים כגון מורפוגנזה^{של רקמות 1}, נדידת תאים², התפשטות תאים³, וביטוי^{גנים 4}. שינויים בצורת התא מונעים על ידי איזון מורכב בין סידורים מחדש דינמיים של הציטוסקלטון המעוותים את קרום הפלזמה וגורמים חיצוניים כגון כוחות חיצוניים המופעלים על התא לבין הגיאומטריה של הידבקויות תאים ומטריצת תאים⁵. תאים mesenchymal נודדים, למשל, polymerize רשת actin צפוף בקצה המוביל שדוחף את קרום הפלזמה קדימה ויוצר lamellipodia רחב⁶, בעוד התכווצות actomyosin נסוגה הקצה הנגרר הצר של התא כדי לנתק את התא ממיקומו הנוכחי^7,8. שיבוש אירועי איתות שמעוררים מבנים ציטוסקלים מיוחדים כאלה מפריעים לצורה ולקוטביות ומאטים את נדידת התאים⁹. בנוסף, כיפוף גיליון אפיתל במהלך gastrulation דורש התכווצות apical מבוסס actomyosin שגורם לתאים ושכניהם להיות טריז בצורת¹⁰. למרות שמחקרים אלה מדגישים את החשיבות של צורת התא, ההטרוגניות הטבועה בצורת התא הכבידה על המאמצים לזהות מנגנונים המחברים מורפולוגיה לתפקוד.

למטרה זו, גישות רבות כדי לתפעל את צורת התא פותחו בשלושת העשורים האחרונים. גישות אלה להשיג את מטרתם על ידי הגבלת התא עם עובש תלת מימדי או שליטה גיאומטריה הידבקות הסלולר באמצעות תצהיר בדוגמת של חלבונים מטריצה חוץ תאית (ECM) על משטח antifouling, טכניקה הנקראת micropatterning¹¹. כאן נסקור מספר טכניקות שצברו פופולריות לאורך השנים.

במקור היה חלוץ כגישה ליישומים מיקרואלקטרוניקה, הדפסת מיקרו-טכנולוגיה רכה המבוססת על ליתוגרפיה הפכה באופן חד משמעי לפולחן מועדף¹². רקיק מאסטר מפוברק תחילה על ידי חשיפה סלקטיבית של אזורים של מצע סיליקון מצופה פוטורסיסטי לצילום, ומשאיר אחריו משטח בדוגמת¹³. אלסטומר, כגון PDMS, נשפך לאחר מכן על הוופל הראשי כדי ליצור "חותמת" רכה המעבירה חלבוני ECM למצע הרצוי^11,14. לאחר ייצור, רקיק הורים יכול לשמש כדי להטיל בולים רבים PDMS כי להוליד micropatterns לשחזור מאוד¹². עם זאת, לא ניתן להתאים את הדפוסים בקלות בשל תהליך הפוטוליטוגרפיה הממושך. תהליך זה דורש גם ציוד וחדרים נקיים מיוחדים מאוד שאינם זמינים בדרך כלל במחלקות ביולוגיה.

לאחרונה, הדפסה ישירה באמצעות UV עמוק דווח לעקוף מגבלות שהוצגו על ידי גישות מבוססות ליתוגרפיה מסורתית. אור UV עמוק מופנה דרך פוטומסק לאזורים סלקטיביים של כיסוי זכוכית מצופה פולי-L-ליצין-מושתל- פוליאתילן גליקול. קבוצות כימיות החשופות ל- UV עמוק מומרות ללא שימוש במקשרים רגישים לאור כדי לאפשר איגוד של חלבוני ECM¹⁵. היעדר קישורים רגישים לאור מאפשר לכיסויים בדוגמאות להישאר יציבים בטמפרטורת החדר במשך יותר משבעה חודשים¹⁵. שיטה זו נמנעת משימוש בחדרים נקיים ובציוד פוטוליטוגרפיה ודורשת הכשרה פחות מיוחדת. עם זאת, הדרישה לפוטומסקים עדיין מהווה משוכה משמעותית לניסויים הדורשים שינויים זמינים בדפוסים.

בנוסף לשיטות לתפעל גיאומטריה של תאים באמצעות תצהיר מבוקר של חלבוני ECM על משטח דו-ממדי, אחרים מבקשים לשלוט בצורת התא על ידי הגבלת תאים במיקרו-מבנים תלת-ממדיים. מחקרים רבים התאימו את הגישה הרכה המבוססת על ליתוגרפיה המתוארת לעיל כדי ליצור תלת מימד, ולא דו מימדי, תאי PDMS כדי לחקור תהליכים ביולוגיים תלויי צורה בעוברים, חיידקים, שמרים וצמחים^16,17,18,19. פולמור דו פוטון (2PP) לקח גם את ההובלה כטכניקת microfabrication שיכול ליצור פיגומים הידרוג'ל 3D מורכבים עם רזולוציה ננומטר²⁰. 2PP מסתמך על העקרונות של ספיחה של שני פוטון, שבו שני פוטונים המועברים בפולסים femtosecond נספגים בו זמנית על ידי מולקולה - photoinitiator במקרה זה - המאפשר פולמור מקומי של פוטופולימרים²¹. טכניקה זו שימשה בכבדות כדי להדפיס פיגומים 3D המחקים את המבנים המקומיים ECM של רקמה אנושית הוכח לגרום נזק פוטוכימי נמוך לתאים²².

הופעת הבכורה של microphotopatterning לפני 10 שנים נתן לחוקרים את ההזדמנות לפברק micropatterns תוך הימנעות ציוד נגיש ומתמחה. Microphotopatterning יוצר דפוסים בסולם מיקרון על ידי הסרה תרמית אזורים סלקטיביים של פולי ויניל אלכוהול (PVA) מצופה על משטחי זכוכית פעילים באמצעות לייזר אינפרא אדום^23,24. חלבוני ECM המחברים רק את משטח הזכוכית המשמש כבסיס ולא PVA משמשים כרמזים ביוכימיים כדי לאפשר דינמיקה של התפשטות מבוקרת וצורת תא. שיטה זו מציעה גם גמישות מעולה שכן דפוסים ניתן לשנות בקלות בזמן אמת. כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד של microphotopatterning באמצעות מערכת הדמיה רב פוטון מסחרית. הפרוטוקול המתואר מיועד לייצור מהיר ואוטומטי של דפוסים גדולים. הוכחנו כי דפוסים אלה שולטים ביעילות בצורת התא על ידי הגבלת הגיאומטריה של הידבקויות תאים-ECM. לבסוף, אנו מראים כי טכניקת דפוס המתוארת מווסתת את הארגון ואת הדינמיקה של ציטוסקלטון actin.

פרוטוקול

1. כיסויים לעיבוד מקדים

1. הכינו כיסויים נקיים וחורקים כמתואר בווטרמן-סטוריר, 1998²⁵.
2. הכן 1% (3-aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS) פתרון דגירה את ה-coverslips בתמיסה במשך 10 דקות עם תסיסה עדינה. ודא כי coverslips לנוע בחופשיות בפתרון.
3. לשטוף מכסה פעמיים עם dH₂O במשך 5 דקות כל אחד.
4. הכינו 0.5% פתרון גלוטרלדהיד (GA) ודגרו את הכיסויים בתמיסה למשך 30 דקות על שייקר. עבור 25 כיסויים, יש להשתמש ב-50 מ"ל של תמיסת גלוטרלדהיד. ודא כי coverslips לנוע בחופשיות בפתרון.
5. לשטוף מכסה שלוש פעמים עם dH₂O במשך 10 דקות כל אחד.
6. סובבו כיסויים יבשים במשך 30 שניות באמצעות ספינר כיסויים שנבנה בהתאמה אישית. תיאור מפורט של ספינר כריכות פורסם²⁶ והוא זמין באינטרנט (https://mullinslab.ucsf.edu/home-built-coverslip-drierspinner/). כיסויים מופעלים ניתן לאחסן עד חודש אחד ב +4 °C (60 °F) בתיבה עם חוצצים, כך שהם עומדים בנפרד אחד מהשני.

2. ציפוי PVA

1. מערבבים PVA (98% PVA שעבר הידרוליזה, MW 98000) עם dH₂O כדי ליצור פתרון של 5.6%.
2. לטבול את התערובת באמבט מים 90 מעלות צלזיוס ומיד לסנן דרך מסנן 0.2 מיקרומטר בארון biosafety בעוד חם. סנן שוב את פתרון המניה אם הוא מזרז. פתרון PVA ניתן לאחסן בטמפרטורת החדר במשך 3 חודשים.
3. בצינור 15 מ"ל, להוסיף חלק אחד HCl לשמונה חלקים PVA. הפוך את הצינור בזהירות כמה פעמים כדי לערבב.
4. יוצקים 2 מ"ל של הפתרון המעורב לתוך צלחת פטרי 35 מ"מ לטבול נקי, כיסוי מעובד מראש לתוך הנוזל, דואג כי coverslips לא מקל לתחתית. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות על שייקר.
5. הסר בזהירות את התוויות מהפתרון. השתמש ספינר coverslip לסובב את המעיל במשך 40 s. בינתיים, תנקה את פינצטה. מעבירים את הכיסוי לקופסה ויבשים ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כיסויים מצופים PVA ניתן לאחסן ב +4 מעלות צלזיוס עד שבועיים.

3. קביעת התצורה של מיקרוסקופ מולטי פוטון

הערה: הפרוטוקול המתואר מכוון ליצירת מיקרופטרנים דביקים לתאים בעלי הצורה והגודל הרצויים במערכות הדמיה מרובות פוטון זקופות או הפוכות, במיוחד אלה שאינן מצוידות בפוקוס אוטומטי של חומרה. לכן, עבור כל שדה תצוגה (FOV), סקריפט דוגמת מילוי ablates שטח קטן כדי ליצור סמן נאמנות על coverslip, משתמש בפוקוס אוטומטי תוכנה כדי למקד את המיקרוסקופ על משטח coverslip, ו ablates את התבנית הרצויה. הפעלת קובץ Script זה בלולאה עבור FOVs סמוכים יוצרת באופן חזק מערך גדול של מיקרופטרנים (5 x 5 מ"מ ומעלה) המגבילים את צורת התא ומווסתים את הפעילות של תהליכים ביולוגיים תאיים. הפרוטוקול המתואר פותח עבור מערכת ההדמיה ניקון A1R MP+ הנשלטת על ידי תוכנת NIS-Elements. אם מערכת דימות מספק אחר משמשת לדוגמאות, יש להתאים את התצורות האופטיות ואת קובץ ה- Script של דוגמת הדפוס בהתאם להוראות היצרן.

1. הפעל את תוכנת המיקרוסקופ. ודא שהמטרה "Apo LWD 25X/1.10W DIC N2" מותקנת על המיקרוסקופ.
   הערה: הפרוטוקול המתואר כאן ממוטב עבור יעד טבילה במים NA 25x/1.1, אך ניתן להשתמש במטרות אחרות גם עבור דפוס. הקוראים צריכים להיות מודעים לכך שללטף עם מטרה של הגדלה גבוהה (למשל,40x ו- 60x) לוקח זמן רב יותר מכיוון שהוא מקטין באופן משמעותי את מספר הדפוסים המתפוגגים בכל FOV. ניתן להשתמש במטרות הגדלה נמוכות למילוי כל עוד הן מספקות תאורה אחידה על פני FOV וכוח לייזר מספיק כדי לבלום את שכבת ה- PVA.
2. בחלון A1plus MP GUI, הגדר את קו הלייזר ל- 750 ננומטר.
3. הגדרת התצורה האופטית "תמונה"
   הערה: NIS-Elements מספקת למשתמשים מספר כלים (ממשק גרפי, בונה זרימות עבודה של רכישה JOBS, תצורות אופטיות ופקודות מאקרו) כדי לשלוט בחומרת המיקרוסקופ. בפרוטוקול זה, רוב בקרת החומרה מושגת באמצעות תצורות אופטיות שונות, כמו גם מודולי רכישת ND וגירוי ND.
   1. בכרטיסיה כיול, לחץ על תצורה אופטית חדשה. תן שם לתצורה האופטית "תמונה". זוהי התצורה האופטית הבסיסית המאפשרת הדמיה של החלקה באמצעות שיקוף. השאר את כל האפשרויות האחרות כברירת מחדל ובחר את המטרה המתאימה.
   2. בחלון A1plus MP GUI, לחץ על לחצן הגדרות כדי לקבוע את תצורת הגדרות החומרה תחת תצורה אופטית זו. הגדר את לייזר גירוי כדי IR stim, למקם את מפצל קרן (BS 20/80) בנתיב האור, להגדיר את יחידת הסורק כדי Galvano ובחר את הגלאי descanned המתאים.
   3. בחלון A1plus Compact GUI, בחר גודל סריקה וזמן השתהות שמספיק כדי ללכוד תכונות קטנות ב- coverslip (1.1 אלפיות השנייה ו- 1024 פיקסלים במערכת שלנו, בהתאמה). לחץ על לחצן רגיל כך שלא יבוצע ממוצע קו או שילוב קו. ודא שהתיבה השתמש בלייזר IR מסומנת. הגדר סריקה חד-כיוונית לפשטות.
      הערה: אם מהירות הסריקה מדאיגה, ניתן להשתמש בסריקה דו-כיוונית.
   4. באותו חלון, התאם את עוצמת הלייזר ואת רגישות הגלאי כדי להשיג תמונה בהירה אך לא רוויה של משטח ה-coverslip. הגדרת הספק לייזר ל- 3 - 5% מהעוצמה המרבית ורגישות הגלאי (מחוון "HV") ל- 15 V היא נקודת התחלה טובה.
   5. בחלון אזור הסריקה של A1plus, הגדר את מרחק מתצוגה ל- 1 כדי ללכוד את FOV כולו.
   6. שמור את התצורה האופטית.
4. הגדרת התצורה האופטית "Print_Fudiciary_Marker"
   1. שכפל את התצורה האופטית "תמונה" ושנה את שמה ל-"Print_Fudiciary_Marker".
   2. בחלון A1plus Compact GUI, בחר את גודל הסריקה וזמן ההשתהות הקטנים ביותר (64 פיקסלים ו- 80.2 אלפיות השנייה במערכת שלנו, בהתאמה).
   3. מאז אין צורך בהדמיה בשלב זה, להגדיר רגישות הגלאי 0 ולהגדיל את כוח הלייזר ל 30%. כוח לייזר גבוה יותר יסיר תרמית את שכבת ה- PVA על ה- coverslip באזורים הרצויים.
   4. בחלון אזור הסריקה A1plus, הגדר את Zoom למקסימום (15.87 עבור המערכת שלנו) והצב את אזור הסריקה באמצע FOV.
   5. בחלון רכישת ND, הגדר ניסוי מחסנית Z. הגדר תנועה במיקום Z ליחסית ובחר בהתקן Z המתאים. הגדר את גודל הצעד ל- 2 מיקרומטר ואת עומק המחסנית ל- 10 מיקרומטר מעל ומתחת כדי להסביר כל אי אחידות בשלב המיקרוסקופ או במשטח PVA בין FOVs סמוכים.
5. הגדרת התצורה האופטית "פוקוס אוטומטי"
   1. שכפל את התצורה האופטית "תמונה" ושנה את שמה ל"פוקוס אוטומטי".
   2. בחלון אזור סריקת A1plus, הקטן את גורם הזום כך שה- FOV יהיה מעט גדול יותר מסמן הנאמנות. פעולה זו מבטיחה שתכונות קטנות אחרות ב- coverslip לא יפריעו להתמקדות אוטומטית.
   3. בתפריט התקנים, בחר הגדרת פוקוס אוטומטי. הגדר את עובי הסריקה לזה של מחסנית Z בניסוי מחסנית Z (ראה שלב 3.5.5). המיקרוסקופ יסרוק את הטווח הזה וימצא את מישור המוקד הטוב ביותר באמצעות סמן הנאמנות. השאר את גודל השלב כברירת מחדל.
6. הגדרת התצורה האופטית "Load_ROI"
   1. שכפל את התצורה האופטית "תמונה" ושנה את שמה ל"Load_ROI".
   2. בחלון A1plus Compact GUI, הגדר גודל סריקה זהה לגודל מסיכת ההחזר על ההשקעה. תצורה אופטית זו תשמש ללכידת תמונה שעליה תיטען מסיכת ההחזר על ההשקעה. השתמשנו בפיקסלים 2048 כדי להשיג איזון אופטימלי בין רזולוציה למהירות.
      הערה: חיוני שהתמונה שנלכדה זהה בגודלה למסכת ההחזר על ההשקעה.
7. הגדרת התצורה האופטית "מיקרופטרן"
   1. שכפל את התצורה האופטית "Print_Fiduciary_Marker" ושנה את שמה ל-"Micropattern".
   2. הגדר את פקטור שינוי גודל התצוגה לאחת.
   3. בחלון A1plus MP GUI, להגדיל את כוח לייזר גירוי כדי ablate PVA ולבחור מהירות סריקה מתאימה (40% ו 32 s /frame בניסויים שלנו, בהתאמה).
   4. בחלון גירוי ND, להגדיר ניסוי גירוי ND. הוסף כמה שלבים ללוח הזמנים והגדר כל אחד מהם כגירוי. ודא שאזור הגירוי ומשך הזמן נכונים.
      הערה: ניתן לכוונן את מספר השלבים בהתאם לעובי ולחלקות של שכבת ה- PVA, כמו גם את עוצמת הלייזר המשמשת בתצורה אופטית זו.
   5. באותו חלון, הפעל את הפונקציה StgMoveMainZ(-1.000,1)לפני כל שלב. זה שוב מסביר את כל הסטיות בכיוון Z.
      הערה: המרחק והכיוון שבהם ניתן להתאים את המהלכים האובייקטיביים בהתאם לעובי ולחלקות של שכבת ה- PVA.
8. הגדרת התצורה האופטית "Label_Surface"
   1. שכפל את התצורה האופטית "Print_Fudiciary_Marker" ושנה את שמה ל"Label_Surface".
   2. בחלון A1plus Compact GUI, הגדל את עוצמת הלייזר באופן משמעותי והגדר את מרחק מתצוגה לאחד. כוח לייזר גבוה המשמש כאן יפגע פיזית בכיסויי הזכוכית ויפיק תווית הנראית לעין בלתי. זה מסייע באיתור הדפוסים בניסויים נוספים.

4. יצירת מסיכת ההחזר על ההשקעה והגדרת המאקרו

1. יצירת מסיכת ההחזר על ההשקעה
   1. השתמשו ב-Adobe Photoshop או בתוכנות זמינות אחרות ליצירת תמונת RGB של 2048 × 2048. התמונה תואמת FOV תחת המיקרוסקופ(כלומר, 532.48 × 532.48 מיקרומטר, 0.26 מיקרומטר לפיקסל). לתמונה צריך להיות רקע שחור (0, 0, 0).
      הערה: ניתן להשתמש במספר עורכי תמונות מסחריים וחינמיים כדי ליצור מסכות החזר על ההשקעה עבור מיקרופטרנינג בסיוע לייזר. למרות שאנו משתמשים Adobe Photoshop כדי ליצור את המסכות, GIMP ו ImageJ / פיג'י זמינים גם כאפשרויות חינם חלופיות.
   2. לצייר 8 - 12 לבן (255,255,255) דפוסים על הרקע השחור. גודל התבנית משתנה בהתאם לסוג התא (קוטר של כ- 200 פיקסלים). השאר אזור ריק של 500 × 500 במרכז התמונה למיקוד אוטומטי. השאר מרווח מספיק בין דוגמאות מילוי סמוכות (>200 פיקסלים) לבין הדייר של FOV עבור אבלציה אופטימלית וקובץ מצורף לתא. תבניות המוצגות בפרוטוקול זה זמינות ב- Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning).
2. הגדרת המאקרו
   1. לחץ על תפריט מאקרו ובחר מאקרו חדש.
   2. יבא את הקוד "Pattern_Stimulation" הזמין ב- Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) לחלון המאקרו החדש. שמור קטע קוד זה בתיקיה מתאימה.
   3. פתח חלון מאקרו חדש נוסף וייבא את הקוד "Stage_Movement" הזמין ב- Github (http://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning). ודא שספריית העבודה "Stage_Movement" בקוד זה זהה לזו שבשלב 4.2.2. שמור את הקוד "Stage_Movement" באותה תיקיה בשלב 4.2.2.

5. יצירת מיקרופטרנים באמצעות אבלציה של תמונות

1. הפעל את המיקרוסקופ ואת אביזריו. ודא כי לייזר IR התחמם מספיק לפני זה.
2. מעבירים את הכיסוי מצופה PVA למחזיק. למיקרוסקופ זקוף, ודאו שפני השטח של PVA יהיו מנופחים עם הפנים כלפי מטה.
3. מוסיפים מים לפינות כדי לייצב את הכיסוי ולהרכיב את המחזיק על שלב המיקרוסקופ.
4. מנמיכים את המטרה ומוסיפים מים על העטיפה.
   הערה: הפרוטוקול המתואר כאן מותאם למטרה טבילה במים NA 25x/1.1. אם נעשה שימוש במטרה טבילה יבשה או בשמן, יש להחליף מים במדיום טבילה מתאים. כאשר מטרה טבילה במים משמשת ליצירת מערך מיקרופטרן גדול, אידוי עלול להפוך לבעיה. אם זה המקרה, מים צריך להיות מוחלף GenTeal, חומר סיכה ללא מרשם העין זמין מבתי מרקחת.
5. בתוכנת המיקרוסקופ, הפעל את תריס הלייזר IR בחלון A1plus MP GUI. לחץ על כפתור יישור אוטומטי כדי ליישר את הלייזר לפני דוגמת.
   הערה: חיוני לבצע יישור אוטומטי בלייזר בתחילת כל מפגש דפוס כמו סטיות קטנות בנתיב הלייזר ישפיע באופן משמעותי על איכות הדפוסים.
6. עבור לתצורה האופטית "תמונה". בחלון A1plus Compact GUI, לחץ על סריקה כדי לסרוק את FOV תוך הזזה איטית של המטרה קרוב יותר לכיסוי.
7. נטר בזהירות את התמונה. בהתחלה, התמונה תיראה עמומה מאוד. קירבו את המטרה לכיסוי עד שהבהירות של התמונה תגדל. זהו משטח הכיסוי הפונה למטרה. המשך להזיז את המטרה עד שהבהירות תפחת ותעלה שוב. זהו משטח PVA שיש לדוגמת. התמקד בכל תכונה קטנה (מכסה פגמים, אבק וכו ')על משטח זה ולהגדיר אפס על כונן Z. תמיד להגדיר אפס לאחר התמקדות.
   הערה: למרות ששני המשטחים של הכיסוי מצופים ב- PVA, המאפיינים האופטיים של הזכוכית אינם משתנים באופן משמעותי על ידי ציפוי PVA. אנו מדמיינים באופן שגרתי כיסויים כאלה עם מטרות יבשות, מים ושמן טבילה ולא מצאנו את משטח PVA ללא דפוס להפריע הדמיה.
8. עבור לתצורה האופטית "Label_Surface". לחץ על לכידה. חזור לתצורה האופטית "דימות" וסריקה. משטח הזכוכית צריך להיות פגום ולהיראות אמורפי. האזור הפגוע נראה לעין בלתי, המציין את מיקום הדפוסים בניסויים נוספים.
   הערה: כדי להגדיל את התווית הגלויה, חזור על שלב 5.8 במספר FOVים סמוכים.
9. בדוק שוב שהמטרה נמצאת בערך במרכז הכיסוי. ודא שיש מספיק מים בין המטרה לבין הכיסוי. להזיז את הבמה על ידי 1 עד 2 FOVs כדי למנוע חלקיקי זכוכית לסרוק כדי לאשר.
10. בתפריט התקנים, פתח את המאקרו Stage_Movement. ודא שספריית העבודה Pattern_Stimulation נכונה; אם לא, גירוי לא יתרחש. הגדר את המשתנים "אורך תבנית" ו- "PatternHeight" למספר הרצוי של FOVים שיעצבו. שמור והפעל את המאקרו.
11. לאחר השלמת הדפוס, עבור לתצורה האופטית "דימות". שוב, ודא שתריס הלייזר של IR פתוח בחלון A1plus MP GUI.
12. הזז את הבמה כדי להציג את התבניות. סרוק את הדפוסים כדי לבדוק את איכותם.
13. העבר את ה- coverslip לתיבת הרשת, עם תבניות הפונות כלפי מעלה.
14. יש לאחסן כיסויים בדוגמת +4 °C (60 °F) עד שבוע לפני השימוש.

6. ספיחה פיברונקטין

1. הפוך טרי 1 M NaBH₄ ב 1 M NaOH פתרון. הוסף ביחס של 1:100 ל- pH 8.0 מאגר פוספט המכיל 0.2 M אתנולמין.
2. מעבירים כיסויים בדוגמאות לתבנית תרבית רקמה של 35 מ"מ. דגירה כל coverslip עם 1 מ"ל של הפתרון לעיל במשך 8 דקות כדי להרוות שפעת אוטומטית, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS.
3. לדלל פיברונקטין (FN) ב PBS לריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. דגירה כיסוי ב FN עבור 1 שעה ב +37 מעלות צלזיוס.
   הערה: אם נצפתה כריכה משמעותית לא ספציפית של חלבון ECM למצע, ניתן לדלל את FN ב- PBS המכיל 0.1% F-127²⁴פלורי.
4. לשטוף את העטיפה 2 פעמים עם PBS. אם לא נעשה שימוש מיידי, יש לאחסן ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

7. קובץ מצורף לתא

הערה: הפרוטוקול הבא ממוטב עבור פיברובלסטים חניכיים אנושיים ראשוניים.

1. תרבות צלחת 10 ס"מ של תאים ל 70% מפגש.
2. לחמם את המדיה תרבות התא, PBS ו 0.05% טריפסין באמבט מים +37 מעלות צלזיוס.
   הערה: עבור תאים הנצמדים חלש למצע, ניתוק לא פרוטאוליטי עם פסוק (0.48 mM EDTA) או מאגר קנייני ללא אנזימים עשוי להגביר את ההחזקה של התא לדפוסים ויש לקחת בחשבון.
3. לפני זריעת תאים, להעביר את coverslip בדוגמת צלחת נקייה 35 מ"מ רקמת תרבות המכיל 1 מ"ל חם PBS.
4. לשאוף את התקשורת תרבות התא מן צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ ולשטוף פעם אחת עם PBS.
5. הוסף 700 μL של 0.05% טריפסין / EDTA לצלחת תאים דגירה ב +37 °C (77 °F), 5% CO₂ חממה במשך 1 דקות.
6. בינתיים, לשאוף את PBS מכסה את כיסוי בדוגמת ולהוסיף 1 מ"ל של מדיה תרבות התא.
7. ודא שהתאים התנתקו. לאחר מכן התחדשו בתאים שעברו טריפסיניזציה עם 10 מ"ל של מדיית תרבות התא והוסיפו 1 מ"ל לכיסוי בדוגמת.
8. תאי תרבות באינקובטור במשך 2 - 3 שעות ולבדוק אם מספר מספיק של תאים נקשרו לדפוסים. אם כן, שנה את המדיה פעם אחת כדי להסיר תאים לא מחוברים. פעולה זו ממזערת את הסיכוי שתאים מרובים ינחתו על אותו דפוס.
   הערה: זמן הקובץ המצורף עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא.
9. לאחר 3-4 שעות נוספות, או כאשר מספר מספיק של תאים התפשטו על דפוסים, התאים מוכנים לניסויים נוספים. אל תחכה זמן רב מדי כדי למנוע חלוקת תאים.

8. רכישת נתונים

1. לתקן תאים עם 4% PFA במאגר cytoskeleton²⁷ במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
2. בצע פרוטוקולי כשל חיסוני שנקבעו עבור חלבונים מעניינים. כיסויים מצופים PVA פועלים היטב עם כל פרוטוקול כשל חיסוני.
3. לרכוש תמונות של תאים באמצעות מיקרוסקופ מתאים. בהתאם למטרה של הניסוי, תמונה אחת או תאים מרובים לכל FOV.

9. ניתוח תמונה

הערה: הפרוטוקול הבא מאפשר למשתמשים להשיג את אות הפלואורסצנטיות הממוצע של החלבון המעניין על מספר רב של תאים מערימות Z של תמונות מיקרוסקופ.

1. פתחו את התמונות הנרכשות ב-NIS Elements וחתוך את התמונות. ודאו שכל תמונה מכילה תא אחד בלבד. הוראות מפורטות על עיבוד תמונה ניתן למצוא בסקריפט שלהלן.
2. התקן את אנקונדה ושגר את ספיידר דרך נווט אנקונדה.
   הערה: ניתן להפעיל את קבצי ה- Script של .py בכל סביבה עם החבילות המתאימות המזוהות בדרישות.txt. אנו ממליצים על אנקונדה מכיוון שהיא מכילה את רוב החבילות הנדרשות עבור הקודים שלהלן.
3. הורד את התסריט מ Github (https://github.com/PlotnikovLab/Micropatterning) ופתוח Spyder ("Pattern_Averaging_3Channels.py" או "Pattern_Averaging_4Channels.py" עבור תמונות עם 3 ערוצים או 4 ערוצים, בהתאמה).
4. הגדר פרמטרים בהתבסס על התמונות שנרכשו. עיין בקובץ ה- Script לקבלת תיאורים מפורטים.
5. הקש F5 כדי להפעיל את קובץ ה- Script. ניתן לעקוב אחר ההתקדמות בלוח המסוף.
6. אחזר את קבצי הפלט שנשמרו באותה תיקיה. תמונות הפלט הן הממוצע של כל ערוץ עבור כל הדגימות. גליון Excel מציג את העוצמה הממוצעת של כל ערוץ בתוך תא לדוגמה, המאפשר ניתוח כמותי נוסף.

תוצאות

איכות הנתונים הניסיוניים המתקבלים באמצעות מיקרופטרנינג תלויה במידה רבה באיכות הדפוסים. כדי לקבוע את איכות הדפוסים שנוצרו בשיטה לעיל, השתמשנו לראשונה במיקרוסקופיית רפלקטיביות כדי להעריך את הצורה והגודל של האזורים המנוצלים של התמונה של ה- coverslip. גילינו שכל תבנית בודדת נראתה דומה מאוד למסכת אבלציה והציגה דיירים ברורים ומשטח ששיקף אור אחיד(איור 2B). ניתן להדפיס מגוון צורות וגדלים בהתאם לארכיטקטורת הציטוסקלטון הרצויה, אך השתמשנו בצורת הקשת המתאימה ביותר למטרות שלנו. מיקרוסקופיה של הכוח האטומי...

דיון

התוצאות לעיל מראות כי פרוטוקול micropatterning בסיוע לייזר IR המתואר (microphotopatterning) מספק דפוסים חסידים לשחזור של צורות שונות המאפשר מניפולציה של צורת התא וארכיטקטורה cytoskeletal. למרות ששיטות micropatterning רבות פותחו הן לפני ואחרי הופעת הבכורה של microphotopatterning, שיטה זו בעלת מספר יתרונות. ראשית, היא אינה דורשת ציוד מיוחד וחדרים נקיים שנמצאים בדרך כלל רק במחלקות ההנדסה. למעשה, כמו מיקרוסקופים מולטי פוטון הופכים מראה נפוץ יותר במחלקות ביולוגיה, microphotopatterning מרחיב את היישומים של מיקרוסקופ multiphoto...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
(3-אמינופרופיל) trimethoxysilane	Aldrich	281778
10 ס"מ צלחת תרבית תאים	VWR	10062-880	פוליסטרן, TC מטופל, מאוורר
25X Apo LWD טבילה במים מטרה	ניקון	MRD77225
3.5 ס"מ צלחת תרבית תאים	VWR	10861-586	פוליסטרן, TC מטופל, מאוורר
4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI)	תרמו	62248	1 מ"ג/מ"ל תמיסת דיהידרוכלוריד
בקר סרין אלבומין	BioShop	ALB005
תמיסת מלח פוספט של Dulbecco	Wisent	311-425-CL
אתנולמין	סיגמא-אולדריץ'	E9508
פיברונקטין	סיגמא-אולדריץ'	FC010	1 מ"ג/מ"ל ב-pH 7.5
מאגר נוגדן פיברונקטין	BD	610077	עכבר
פיג'י	ImageJ		גרסה 1.53c
פלורסנט פלואורסצנטי	Invitrogen	A12380	568 ננומטר
כיסוי זכוכית	VWR	16004-302	22 ופעמים; 22 מ"מ
גלוטראלדהיד	אלקטרונים מיקרוסקופיה Sciences	16220	25% תמיסה מימית
חומצה הידרוכלורית	קלדון	6025-1-29	תמיסה מימית 37%
IR לייזר	קוהרנטי	זיקית ראייה
מינימלי חיוני בינוני ואלפא;	Gibco	12561-056
הרכבה בינונית	Sigma	F4680
עכבר נוגדן משני	טכנולוגיית איתות תאים	4408S	עז, 488nm
מיקרוסקופ רב פוטון	ניקון	A1R MP+
Myosin שרשרת אור נוגדן	תא איתות טכנולוגיה	3672S	ארנב
NIS אלמנטים	ניקון		גירסה 5.21.03
חומצה חנקתית	קלדון	7525-1-29	תמיסה מימית 70%
פוטושופ	Adobe		גרסה 21.2.1
פלורוניק F-127	סיגמא	P2443	אבקת
פולי (ויניל אלכוהול)	אולדריץ'	341584	MW 89000-98000, 98% ארנב שעבר הידרוליזה
איתות תאי	נוגדנים משניים	4412S	עז, 488 ננומטר
שייקר	VWR	10127-876	ידוע גם בשם נדנדה אנלוגית
נתרן בורוהידריד	אולדריץ	452882	אבקת
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ'	S8045
נתרן פוספט דו-בסיסי	סיגמא	S5136	אבקת
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S5011	אבקת
ספיידר	אנקונדה	4.1.4
Trypsin	Wisent	325-042-CL	תמיסה מימית 0.05% עם 0.53mM EDTA