פרוטוקול זה מציג השוואה בין שני פרוטוקולי אינדוקציה שונים להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) כלפי שושלות הלבלב במבחנה: הפרוטוקול האינטגרטיבי והפרוטוקול הלא אינטגרטיבי. הפרוטוקול האינטגרטיבי מייצר יותר תאים המייצרים אינסולין (IPCs).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
במבחנה אינדוקציה של תאי גזע עיסת שיניים אנושית לכיוון שושלות הלבלב
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
נכון ל-2000, ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון לטיפול בסוכרת מסוג I עדיין נתקלה בכמה מכשולים. אלה כוללים את המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric ואת השימוש ארוך הטווח של מדכאי חיסון. תאי גזע מזנכימליים (MSCs) נחשבו למועמד פוטנציאלי כמקור חלופי ליצירת תאים דמויי איון. הדו"חות הקודמים שלנו המחישו בהצלחה את הקמתם של פרוטוקולי אינדוקציה להבחנה בין תאי גזע עיסת שיניים אנושית (hDPSCs) לתאים מייצרי אינסולין (IPCs). עם זאת, יעילות האינדוקציה השתנתה מאוד. במאמר זה, אנו מדגימים את ההשוואה של יעילות אינדוקציה בלבלב hDPSCs באמצעות אינטגרטיבית (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית וגנטית) ופרוטוקולי אינדוקציה לא אינטגרטיביים (מניפולציה מיקרו-וירונימנטלית) לאספקת IPCs שמקורם ב- hDPSC (hDPSC-IPCs). התוצאות מצביעות על יעילות אינדוקציה ברורה הן עבור גישות האינדוקציה במונחים של מבנה מושבה תלת מימדי, תשואה, סמני mRNA הלבלב, ורכוש פונקציונלי על אתגר גלוקוז מרובה מינון. ממצאים אלה יתמכו בהקמה עתידית של IPCs ופלטפורמת ייצור שושלת לבלב ישימים קלינית.
מבוא
סוכרת היא דאגה גלובלית מתמשכת. דו"ח של הפדרציה הבינלאומית לסוכרת (צה"ל) העריך כי השכיחות העולמית של סוכרת תגדל מ-151 מיליון בשנת 2000 ל-415 מיליון בשנת 20151,2. המחקר האחרון המבוסס על אפידמיולוגיה חזה כי שכיחות הסוכרת העולמית המשוערת תגדל מ -451 מיליון בשנת 2017 ל -693 מיליון בשנת 20451. ההצלחה של השתלת אי הלבלב באמצעות פרוטוקול אדמונטון הודגמה לראשונה בשנת 2000, כאשר הוכח לשמור על ייצור אינסולין אנדוגני ולייצב את המצב הנורמוגליקמי בסוג I חולי סוכרת3. עם זאת, היישום של פרוטוקול אדמונטון עדיין מתמודד עם בעיה צוואר בקבוק. המספר המוגבל של תורמי לבלב cadaveric הוא הב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
עבודה זו בוצעה בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרה על ידי ועדת האתיקה לחקר האדם, הפקולטה לרפואת שיניים, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. DPSCs אנושי (hDPSCs) היו מבודדים מרקמות עיסת שיניים אנושיות שחולצו הן premolars והן שיניים שיניים עקב בעיות שיני בינה. הסכמה מדעת התקבלה מהמטופלים על פי פרוטוקול מאושר (HREC-DCU 2018/054).
1. פרוטוקול אינדוקציה אינדוקטיבי
- הכנת וקטור lentiviral נושא PDX1
- השתמש בכליות עובריות אנושיות (HEK) 293FT תאים לאריזה ויראלית. תרבית ושמירה על תאים אלה במדיום הנשר המותנה (DMEM) של דולבק בתוספת סרום בקר עוברי 10%, 1% L-גלוטמין ו-1% אנטי-אנטי-מיקוטיק.
- צור PDX1-lentivirus וקטורים על ידי tr....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במאמר זה הושוו התוצאות של שני פרוטוקולי האינדוקציה. הדיאגרמות של שני פרוטוקולי האינדוקציה מודגמות באיור 2A, C. בשני הפרוטוקולים, ההערכה בוצעה תחת מיקרוסקופ אור, ותמונות נותחו עם ImageJ. hDPSCs הצליחו ליצור מבנים דמויי מושבה מהיום הראשון של אינדוקציה בשני פרוטוקולי האינדוקציה. המורפולוגיה של המושבה הייתה עגולה וצפופה, וכל המושבות צפו בכלי התרבות לאורך כל תקופת האינדוקציה(איורים 2B,D). כמו כן נקבעה ספירת המושבות הכוללת של שני הפרו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השגת ייצור IPCs גבוה יותר מ- MSCs ממלאת תפקיד חיוני בטיפול בסוכרת. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול האינטגרטיבי מסתמכים על איכות התאים שישמשו להעברתם ולאיכות התאים המועברים. דרישות תאים מסוימות שיש לבדוק עבור טרנסולציה מוצלחת מבטיחות את תקינות התא, ניהול בנקאות התאים והתאים נמצאים במצב פעיל במיטוטי. יתר על כן, ניטור הכדאיות של תאים transduced גם ממלא תפקיד חשוב. טרנסדוקציה פחות מוצלחת נגרמת על ידי הכדאיות הירודה של התאים מגורה12. עבור הפרוטוקולים הלא אינטגרטיביים, המראה המורפולוגי והמושבות הצפות צריכו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
SK, WR, ו- QDL נתמכו על ידי תא גזע וטרינרי ויחידת המחקר הביו-הנדסה, קרן הקרן להנדסה של Ratchadaphiseomphot, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן. TO ו- PP נתמכו על ידי קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאההשנייה שלה. מדעי מדעי המוח נתמכו על ידי מענק תמיכה במחקר של הפקולטה למדעי הווטרינריה, קידום אקדמי Chulalongkorn לתוך פרויקט המאה השנייה שלה, תאי גזע וטרינריים ויחידת מחקרביו-הנדסה, קרן קרן ראטצ'אדאפיססומפוט, אוניברסיטת צ'ולאלונגקורן וקרן המחקר הממשלתית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <תרבית תאים חזקה> | |||
| אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית | Thermo Fisher Scientific Corporation, ארה"ב | 15240062 | |
| Corning® צלחת תרבית 60 מ"מ שטופלה ב-TC | Corning® | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 12800017 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Thermo Fisher Scientific Corporation | 10270106 | |
| GlutaMAX ™ | Thermo Fisher Scientific Corporation | 35050061 | |
| אבקת מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4 | Sigma-Aldrich | P3813-10PAK | חבילה אחת משמשת להכנת 1 ליטר של תמיסת PBS עם DDI |
| סטרילי Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo | Fisher Scientific Corporation | 25200072 | |
| <חזק>לנטי-ויראלי וקטור נושא תכשיר PDX1 | |||
| Amicon® מסנן צנטריפוגלי אולטרה-15 | Merck Millipore, ארה"ב | UFC910024 | |
| Human pWPT-PDX1 פלסמיד | Addgene | 12256 | מתנה מדידייה טרונו; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: |
| Addgene_12256 יחידת מסנן מזרק Millex-HV, 0.45 ומיקרו; m | Merck Millipore | SLHV033RB | |
| pMD2.G פלסמיד | Addgene | 12259 | מתנה מדידייה טרונו; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: |
| Addgene_12259 Polybrene Infection / Transfection | Reagent Merck Millipore | TR-1003-G | |
| psPAX2 plasmid | Addgene | 12260 | מתנה מדידייה טרונו; http://n2t.net/addgene:12260; RRID: |
| Addgene_12260<חזק>פרוטוקול אינדוקציה תלת-שלבי | |||
| אקטיבין: חלבון אנושי רקומביננטי | Merck Millipore | GF300 | |
| בטא-מרקפטואתנול | Thermo Fisher Scientific Corporation | 21985-023 | |
| אלבומין בסרום בקר (BSA, שבר כהן V, ללא חומצות שומן) | סיגמא-אולדריץ' | A6003 | |
| פפטיד דמוי גלוקגון (GLP)-1 | סיגמא-אולדריץ' | G3265 | |
| אינסולין-טרנספרין-סלניום (ITS) | Invitrogen | 41400-045 | |
| ניקוטינמיד | סיגמא-אולדריץ' | N0636 | |
| חומצות אמינו לא חיוניות (NEAAs)Thermo | Fisher Scientific Corporation | 11140-050 | |
| צלחת תרבית תאים לא מטופלת, 60 מ"מ | Eppendorf | 30701011 | |
| נתרן בוטיראט | סיגמא-אולדריץ' | B5887 | |
| טאורין | סיגמא-אולדריץ' | T0625 |
מקורות
- Cho, N. H., et al. IDF diabetes atlas: Global estimates of diabetes prevalence for 2017 and projections for 2045. Diabetes Research and Clinical Practice. 138, 271-281 (2018).
- Danaei, G., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
