פרוטוקול זה מדגיש שיטה להערכה מהירה של תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC)/אגרוז דיו ביו-חומרים מרוכבים הידרוג'ל עם תאי פין שמקורם במח העצם של העכבר במונחים של כדאיות התא וביטוי פנוטיפי של קולטני פני השטח של התא, קיט (CD117) וקולטן IgE בעל זיקה גבוהה (FcεRI).
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור של דיו ביו-חומרים אגרוז משובץ ננו-תאית לגבישית
במאמר זה
סיכום
תקציר
ביו-הדפסה תלת מימדית (תלת-ממדית) משתמשת ברכיבים מרוכבים מבוססי הידרוג'ל (או דיו ביו-חומרי) המופקדים בתבנית ויוצרת מצע שעליו מופקדים תאים. מכיוון שדיו ביו-חומרים רבים יכולים להיות ציטוקסיים פוטנציאליים לתאים ראשוניים, יש צורך לקבוע את תאימות ביולוגית של מרוכבים הידרוג'ל אלה לפני השימוש שלהם בתהליכים יקרים של הנדסת רקמות תלת-ממדיות. כמה שיטות תרבית תלת-ממדית, כולל הדפסה ביולוגית, דורשות שתאים יוטבעו במטריצה תלת-ממדית, מה שמקשה על חילוץ וניתוח התאים לשינויים בכדאיות ובביטוי סמן ביולוגי מבלי לגרום לנזק מכני. פרוטוקול זה מתאר כהוכחה של מושג, שיטה להערכת תאימות ביולוגית של ננו-תאי גבישי (CNC) מוטבע אגרוז מרוכבים, מפוברק לתוך מערכת תרבית 24-well, עם תאי פיטום נגזר מח עצם העכבר (BMMCs) באמצעות תרסיסים ציטומטריים זרימה עבור הכדאיות התא וביטוי סמן ביולוגי.
לאחר 18 שעות של חשיפה למטריקס CNC / אגרוז / D-מניטול, הכדאיות BMMC לא היה ללא כל כפי שנמדד על ידי חמיצות יוד פרופיליום (PI). עם זאת, BMMCs תרבית על CNC / agarose / D-מניטול מצע נראה להגדיל מעט את הביטוי שלהם של קולטן IgE זיקה גבוהה (FcεRI) ואת קולטן גורם תא גזע (ערכה; CD117), למרות שזה לא נראה תלוי בכמות CNC בביוינק מורכב. הכדאיות של BMMCs הוערכה גם בעקבות חשיפה לקורס זמן לפיגומים הידרוג'ל שהיו מפוברקים מדיו ביו-חומרים מסחרי המורכב מננו-תאי פרברילר (FNC) ונתרן אלגינט באמצעות ביו-הדפסה תלת-ממדית. במשך תקופה של 6-48 שעות, מצעים FNC / אלגינט לא השפיעו לרעה על הכדאיות של BMMCs כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה ובדיקות microtiter (XTT ו לקטט דהידרוגנאז). פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לסנן במהירות את התאימות הביוכימית של דיו ביו-חומרים מועמד עבור השירות שלהם כפיגומים תלת-ממדיים לזריעה לאחר ההדפסה עם תאי פין.
מבוא
העניין האחרון במערכות תרבות תלת-ממדית וביו-הדפסה תלת-ממדית מיקד את תשומת הלב בהידרוג'לים ובהידרוג'ל מרוכבים. מרוכבים אלה משמשים צמיג אך נקבובי biomimetics והוא יכול להיות מורכב עד 99% תכולת מים לפי משקל, אשר דומה רקמות ביולוגיות1,2,3. תכונות אלה של מרוכבים הידרוג'ל ובכך לאפשר את הצמיחה של תאים מבלי להשפיע על הכדאיות שלהם ותפקוד. מרוכבים אחד כזה הוא ננו-תאי גבישי (CNC), אשר שימש כחומר חיזוק ב מרוכבים הידרוג'ל, פיגומים תאים בפיתוח של שתלים ביו-חומרים, ובתרבות תאים דו מימדית (2D) ותלת-ממדית במבחנה4,5. על פי רוב,....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: פרוטוקול זה מורכב מחמישה חלקים: (1) בידוד של מח עצם העכבר ובידול של תאי פיטום שמקורם במח עכבר (BMMCs), (2) ייצור של מצעים הידרוג'ל CNC / agarose / D-מניטול במערכת 24-well ותרבות של BMMCs על המצעים, (3) הסרת BMMCs מן CNC / agarose / D-מניטול הידרוג'ל וסטוח של כדאיות וביטוי סמן ביולוגי באמצעות cytometry זרימה, (4) ביו-הדפסה תלת-ממדית של פיגומי הידרוג'ל מפיברילר ננו-תאי (FNC) /נתרן אלגינט ביו-חומרים מורכבים, ותרבית (5) של BMMCs על פיגומי הידרוג'ל FNC/נתרן אלגינט וניתוח הכדאיות באמצעות ציטומטריית זרימה, XTT, ומיקרו-טייטר דהידרוגנאז לקטט (LDH).
1. דור תרבות ה- BMMC
הערה: עכברים הומתו על ידי חנק CO2 בעק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אחד המאפיינים המכריעים ביותר של דיו ביו-חומרים מוצלח או מצע תרבות הוא זה של תאימות ביולוגית. בראש ובראשונה, אסור שהמצע יזום מוות תאי. ישנן מספר שיטות ציטומטריות מבוססות מיקרוטיטר וזרימה לכימות הכדאיות של התא ונמק; עם זאת, שיטות אלה אינן מקובלות על ניתוח תאים המוטמעים בתוך מטריצת הידרוג'ל. בפרוטוקול זה, המגבלה הנ"ל עוקפת על ידי זריעת ה- BMMCs על מצע ההידרוג'ל או הפיגומים המודפסים ביו.. לאחר תקופת דגירה ספציפית (6-48 שעות במחקר זה), BMMCs נקצרים בקלות על ידי מיקרופיפיט ללא צורך בהפרעה מכנית או הידרוליזה של מצע הידרוג'ל או .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ייצור של רקמות ביו-מימטיות תלת-ממדיות דורש מיזוג מוצלח של הביו-וינק, המחקה רכיבים של המטריצה החוץ-תאית, עם הרכיבים התאיים ליצירת אנלוגים פיזיולוגיים של רקמות ויוו . זה מחייב שימוש בתאים ראשוניים, ולא תאים שעברו טרנספורמציה, בעת ייצור רקמות ביו-מימטיות פיזיולוגיות. תאים אימונולוגיים ראשוניים, כגון תאי פיטום, עם זאת, רגישים במיוחד להשפעות ציטוטוקסיות ושינויים פנוטיפיים שעשויים להיות מופעלים על ידי מטריצת הביוינק עצמה, שאינה רצויה. לכן, היכולת להעריך במהירות את ההשפעות של דיו ביו-חומרים מועמד על הכדאיות והפנוטיפ (ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר קנדה ואלברטה Innovates.
תודות
אנו מודים לאלברטה אינחדשס על שסיפקה ל- CNC וקן האריס וג'ה-יאנג צ'ו על העצה הטכנית שלהם בעת הכנת מטריצת CNC / אגרוז / D-מניטול. אנו מודים גם לבן הופמן, הת'ר וינצ'ל וניקול דיאמנטידס על הייעוץ הטכני והתמיכה שלהם עם ההתקנה וכיול הביו-הדפסה התלת-ממדית INKREDIBLE+ .
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>A אצטית > | |||
| חזקה (קרחון) | סיגמא אולדריץ' | AX0074-6 | |
| אגרוז (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| אוגר ארמני IgG בקרת איזוטיפ, APC (שיבוט: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| <חזק>B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד מלח נתרן (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 מ"ל מזרק (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 באר Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 ס"מ2 בקבוק מאוורר | תרמו פישר סיינטיפיק | 130-191 | |
| ארון בטיחות ביולוגית Class II | Microzone Corp., קנדה | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| <חזק>C | |||
| C57BL/6 עכברים | מעבדת ג'קסון | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) נוגדן חד שבטי, PE (שיבוט: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (מחסנית 3 x 3 מ"ל) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent - בקבוק סטרילי 1 x 60 מ"ל | CELLINK LLC | ||
| מחסניות ריקות של CELLINK 3 סמ"ק עם מכסי קצה וקצה | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare למחשב | CELLINK LLC | גרסה 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK חרירי הדפסה ביולוגית חרוטית סטנדרטית סטרילית 22G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK חרירי הדפסה ביולוגית חרוטית סטנדרטית סטרילית 25G | CELLINK LLC | ||
| CELLINK חרירי הדפסה ביולוגית חרוטית סטנדרטית סטרילית 27G | CELLINK LLC | ||
| ערכת ריבוי תאים NZ4270005001 II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| צנטריפוגה (ספסל) | Eppendorf | 5804R | |
| קורנינג קוסטאר 96 Well Clear שטוח תחתית לא מטופל PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, גרמניה | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | בקמן קולטר | A00-1-1102< | |
| strong>D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| <חזק>F | |||
| פלקון 15 מ"ל צינורות חרוטיים מפוליסטירן, | סטריליים | 352095 | |
| פלקון 50 מ"ל | קורנינג | 352070 | |
| FceR1 אלפא נוגדן חד שבטי, APC (שיבוט: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך, חום | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. ארה"ב | גרסה 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | גרסה 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (משופר נויבאואר 0.1 מ"מ היטל עמוק | VWR | 15170-208 | |
| HEPES נתרן מלח | פישר מדעי | BP410-500 | |
| <חזק>I | |||
| יודוניטרוטרזוליום כלוריד (INT) | סיגמא אולדריץ' | I10406-5G | |
| <חזק>L> | |||
| L-גלוטמין 200 מ"מ (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| ליתיום L-לקטט | סיגמא אולדריץ | ' L2250-100G | |
| <חזק>M | |||
| MEM חומצות אמינו לא חיוניות 100 מ"ל 100x (Gibco)Thermo | Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-מתוקסי-5-מתילפנאזיניום מתיל סולפט (MPMS) | סיגמא אולדריץ' | M8640 | |
| מיקרו-צינורות (1.7 מ"ל שקוף) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 מ"ל שקוף) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (לייצור מים אולטרה-טהורים MilliQ) | Millipore | ZMQS60001 | |
| <חזק>N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 מ"מ יחידת סינון (0.2 מ"מ גודל נקבוביות, 500 מ"ל) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| מסנן מזרק Nalgene (0.2 מ"מ PES, 25 מ"מ) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 מ"ל (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, ללא סידן/מגנזיום, 500 מ"ל (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| פרופידיום יודיד, 1.0 מ"ג/מ"ל (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (שיבוט: eB149/10H5)Thermo | Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| עכברים רקומביננטיים IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 בינוני 1X + 2.05 מ"מ L-גלוטמין (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| <חזק>S | |||
| Sarstedt 96 בסיס עגול היטב PS צלחת בדיקה מיקרו שקופה (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| נתרן אזיד, 500 גרם | פישר סיינטיפיק | BP922I-500 | |
| נתרן פירובט (100 מ"מ) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%, למיקרוסקופיה) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| <חזק>V | |||
| ספקטרופוטומטר VARIOSKAN LUX Microplate (סוג: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
מקורות
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: Scaffold design variables and applications.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
