פרוטוקול זה מתאר את הכנת תרביות פרוסות אורגנוטיפיות (OTSCs). טכניקה זו מאפשרת טיפוח ex vivo של רקמה רב-תאית שלמה. ניתן להשתמש ב-OTSCs באופן מיידי כדי לבדוק את התגובה המתאימה שלהם לתרופות בסביבה רב-תאית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרביות פרוסות אורגנוטיפיות כמודלים פרה-קליניים של מיקרו-סביבה גידולית בסרטן לבלב ראשוני וגרורות
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים פרה-קליניים מציאותיים של סרטן לבלב ראשוני וגרורות נחוצים בדחיפות כדי לבחון את תגובת הטיפול ex vivo ולהקל על טיפול מותאם אישית בחולה. עם זאת, היעדר מיקרו-סביבה ספציפית לגידול במודלים הנמצאים בשימוש כיום, כגון קווי תאים שמקורם במטופל וקסנוגרפטים, מאפשר רק תובנות ניבוי מוגבלות. תרביות פרוסות אורגנוטיפיות (OTSCs) מורכבות מרקמה רב-תאית שלמה, שניתן להשתמש בה במהירות לבדיקת תגובת תרופות מפוענחת מרחבית.
פרוטוקול זה מתאר את היצירה והטיפוח של פרוסות גידול בנות קיימא של סרטן הלבלב וגרורותיו. בקצרה, רקמה יצוקה באגרוז נמס נמוך ומאוחסן בחיץ איזוטוני קר. לאחר מכן, פרוסות רקמות בעובי 300 מיקרומטר נוצרות עם ויברטום. לאחר ההכנה, הפרוסות מתורבתות בממשק אוויר-נוזל באמצעות תוספות תרבית תאים ואמצעי גידול מתאים. במהלך הטיפוח ניתן לעקוב אחר שינויים בהתמיינות התאים ובכדאיות. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת יישום של טיפול ברקמת גידול אנושית בת קיימא ex vivo וניתוחים במורד הזרם, כגון פרופיל שעתוק ופרופיל.
OTSCs מספקים הזדמנות ייחודית לבחון את תגובת הטיפול האישית ex vivo ולזהות פרופילים שעתוק ופרוטאומיים בודדים הקשורים לתגובה בהתאמה של פרוסות גידול נפרדות. ניתן להמשיך לחקור OTSCs כדי לזהות אסטרטגיות טיפוליות להתאמה אישית של הטיפול בסרטן לבלב ראשוני וגרורות.
מבוא
מודלים פרה-קליניים קיימים של אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC) וגרורות בהתאמה הם מנבאים גרועים של תגובה לטיפול בחולים, דבר המהווה חסרון משמעותי בפיתוח תרופות ובזיהוי סמנים ביולוגיים מנבאים1. למרות שמודלים כגון אורגנואידים שמקורם במטופל וקסנוגרפטים שמקורם במטופל מבטיחים, השימוש בהם נותר מוגבל2. המגבלות העיקריות של מודלים אלה במבחנה הן היעדר מיקרו-סביבה של הגידול וקסנוגרפטינג במינים מדוכאי חיסון שאינם אנושיים. במיוחד ב- PDAC והגרורות שלו, המיקרו-סביבה של הגידול זכתה להתעניינות רבה בשנים האחרונות בגלל תפקידיה המכריעים בביולוגיה של הגידול. הוא מורכב מרכיבים תאיים ואצלולריים, כגון (מיו-)פיברובלסטים, תאי סטלט הלבלב, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימות רקמות נאספו ועובדו לאחר אישור ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת ליבק (# 16-281).
1. איסוף וטיפול ברקמות טריות
הערה: יש לטפל בזהירות בכל דגימת רקמה אנושית לא קבועה כדי למנוע את הסיכון לזיהום מפתוגנים הנישאים בדם. כל החולים צריכים להיבדק כדי להיות שליליים עבור HIV, HBV, ו- HCV לפני עיבוד רקמות. לבשו מעיל מגן וטפלו בדגימות רקמות אנושיות עם כפפות.
- יש לאסוף דגימת רקמת PDAC טרייה, לא קבועה ולא קפואה בגודל מינימלי של 0.4 x 0.4 ס"מ מיד לאחר הניתוח ולהעביר את הדגימה למעבדה בתמיסת אחסון רקמות.
- במידת האפשר, יש לעבד את הרקמה הטרייה באופן מיידי.
- לחלופין, אחסנו רקמות בתמיסת אחסון רקמות על ק....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מספק סקירה כללית של זרימת העבודה לתרבית OTSCs מרקמת גידול טרייה ולא קפואה. דגימות של PDAC ראשוני וגרורות נאספו מיד לאחר כריתה כירורגית ואוחסנו במשך הלילה על קרח רטוב ב -4 מעלות צלזיוס בתמיסת אחסון הרקמות. הדגימות עובדו, והפרוסות תורבתו כמתואר בפרוטוקול. המורפולוגיה המקרוסקופית של כל OTSC לא השתנתה באופן גס במהלך הטיפוח. אולם גודל שטח הפנים של ה-OTSCs ירד עם הזמן, כפי שניתן לראות לדוגמה באיור 2A במהלך הטיפוח במשך 6 ימים. הכדאיות הכוללת של OTSC הוערכה על-יד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
OTSCs של דגימות גידול טרי הם קירוב קרוב של הגידול באתרו. הם שומרים על המורפולוגיה הבסיסית שלהם, פעילות ההתרבות והמיקרו-סביבה שלהם במהלך הטיפוח לתקופה מוגדרת ותלויית רקמות 11,12,13. טכניקה זו מאפשרת יישום מיידי של הטיפול ברקמת גידול אנושית בת קיימא ex vivo וניתוחים במורד הזרם, כגון פרופיל של התמליל והפרוטאום. יתרון ספציפי של OTSCs הוא שניתן ליישם ניתוחים מפוענחים מרחבית במורד הזרם, כגון הדמיית MALDI, על רקמת גיד.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים לא חשפו ניגודי עניינים פוטנציאליים.
תודות
ר. בראון נתמך על ידי בית הספר למדען קליני ליבק (DFG #413535489) ותוכנית מימון הצעירים של אוניברסיטת ליבק.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מתקדם DMEM/F-12 בינוני | Gibco | 12634028 | |
| אגרוז נמס נמוך | רוט | 6351.2 | 8% בתמיסת רינגר |
| מדלל נוגדנים, הפחתת רקע | Dako | S3022 | |
| AquaTex | Merck | 108562 | |
| ביו-אתנול (99%, מפוגל) | CHEMSolute | 2,21,19,010 | |
| חומצת לימון monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 9664 | 1:400 דילול |
| דרבי אקסטרה דו-אדג' בטיחות סכיני גילוח | דרבי Tokai | ||
| הטמעת קלטות | Roth | H579.1 | |
| Eosin Y-solution 0,5% מימית | Merck | 10,98,44,100 | |
| Eukitt מדיום הרכבה מתקשה מהיר | Sigma-Aldrich | 3989 | |
| סרום בקר עוברי | תמיסת פורמלדהיד Gibco | ||
| 4,5%, חוצץ | Bü fa Chemikalien | B211101000 | |
| Hem Alum Solution acid acc. to Mayer | Roth | T865 | |
| Human EGF | Milteniy Biotec | 130-097-794 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich (Merck) | H0888 | |
| מי חמצן 30% | Merck | 1,08,59,71,000 | |
| אינסולין אנושי | Sigma Aldrich (Merck) | 12643 | |
| מערכת כרומוגן מצע DAB+ נוזלית | Dako | K3468 | |
| MACS פתרון אחסון רקמות | Milteniy Biotech | 130-100-008 | |
| מתנול | Merck | 10.600.092.500 | |
| שקופיות מיקרוסקופ Superfrost Plus | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| הכנסת תרבית תאים מילי-תאים, 30 מ"מ, PTFE הידרופילי, 0.4 ומיקרו; מ | Millipore (Merck)PICM0RG50 | ||
| עכבר חד שבטי אנטי אנושי ציטוקרטין 7 (שיבוט OV-TL 12/30) | Dako | M7018 | 1:200 דילול |
| עכבר חד שבטי אנטי אנושי Ki67 שיבוט MIB-1 | Dako | M7240 | 1:200 דילול |
| עכבר חד שבטי אנטי וימנטין (שיבוט V9) | Dako | M0725 | 1:200 דילול |
| עכבר שליטה שלילית IgG2a | Dako | X0943 | 1:200 דילול |
| עכבר שליטה שלילית IgG1 | Dako | X093101-2 | 1:200 דילול |
| פרפין (טמפרטורת התכה 56°- 58°) | Merck | 10,73,37,100 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10.000 יח'/מ"ל) | ג'יבקו | 15140122 | |
| PBS pH 7,4 (1x) זרימה ציטומטרית גיבקו | A12860301 | ||
| מלח נתרן רזזורין; 10 מ"ג/מ"ל ב-PBS | Sigma Aldrich | R7017 | דילול 1:250 |
| תמיסת רינגר | Fresenius Kabi | 2610813 | |
| RPMI-1640 בינוני | Sigma Aldrich (Merck) | R8758 | |
| לוחית בדיקה לתרבית רקמות 6 | TPP | 92006 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9002-93-1 | |
| VECTASTAIN Elite ABC-Peroxidase Kit | Vector Laboratories | PK-6200 | |
| קסילן (טהור במיוחד) | J.T.Baker | 8,11,85,000 | |
| <חזק>ציוד | |||
| ClarioStar Microplate Reader | BMG Labtech | ||
| Paraffin Embedding Center E61110 | Leica | ||
| Rotary Microtome Microm HM355S | Thermo Scientific | ||
| Section Transfer System Microm STS | Thermo Scientific | ||
| VT 1200S Vibratom | Leica |
מקורות
- Nevala-Plagemann, C., Hidalgo, M., Garrido-Laguna, I. From state-of-the-art treatments to novel therapies for advanced-stage pancreatic cancer. Nature Reviews. Clinical Oncology. 17 (2), 108-123 (2020).
- Tiriac, H., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
