Method Article

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

DOI:

10.3791/62544

⸱

August 7th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Gene Expression, ECOTECH-Complex, Maria Curie-Sklodowska University, 2Department of Molecular Biology, Institute of Biological Sciences, Maria Curie-Sklodowska University, 3Faculty of Information Technology, Polish-Japanese Academy of Information Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב vivo. היתרון של שיטה זו, בהשוואה לגישות אחרות, הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים בתעתיק mRNA.

במאמר זה אנו מתארים את השלבים העוקבים של איסוף והכנה לדוגמה לשיטת RIBO-seq בחיידקים, ומדגישים את הפרטים הרלוונטיים לתכנון וביצוע הניסוי.

מאז RIBO-seq מסתמך על ריבוזומים שלמים mRNAs הקשורים, הצעד העיקרי הוא עיכוב מהיר של תרגום התפוררות נאותה של תאים. לכן, אנו מציעים סינון והקפאת פלאש בחנקן נוזלי לקצירת תאים עם טיפול מקדים אופציונלי עם כלוראמפניקול כדי לעצור תרגום בחיידקים. להתפוררות, אנו מציעים שחיקה תאים קפואים עם מרגמה ועלי בנוכחות תחמוצת אלומיניום כדי לשבש מכנית את דופן התא. בפרוטוקול זה, כרית סוכרוז או שיפוע סוכרוז ultracentrifugation עבור טיהור מונוזום אינו נדרש. במקום זאת, הפרדת mRNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ואחריו כריתת טביעת הרגל ריבוזומלית (28-30 nt הלהקה) מוחל ומספק תוצאות משביעות רצון. פעולה זו מפשטת במידה רבה את השיטה וכן מפחיתה את דרישות הזמן והציוד עבור ההליך. להכנת הספרייה, אנו ממליצים להשתמש בערכת RNA קטנה הזמינה מסחרית לריצוף Illumina מניו אינגלנד Biolabs, בהתאם להנחיות היצרן עם מידה מסוימת של אופטימיזציה.

ספריות ה- cDNA המתקבלות מציגות כמות ואיכות מתאימות הנדרשות לריצוף הדור הבא (NGS). רצף הספריות שהוכנו על פי תוצאות הפרוטוקול המתוארות ב 2 עד 10 mln קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם מתן נתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים מהיר וקל יחסית וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) פותחה במעבדתו של ג'ונתן וייסמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו1. בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות לחקר ביטוי גנים ברמה התרגומית, RIBO-seq מתמקד בכל מחייב ריבוזום ל- mRNA ומספק מידע על מיקומו ועל המספר היחסי של ריבוזומים בתעתיק. זה מאפשר ניטור התהליך של סינתזת חלבון vivo והוא יכול לספק רזולוציה קודון יחיד ודיוק המאפשר מדידה של צפיפות ריבוזום על שניהם, mRNA הפרט לאורך התמלול כולו בתא. בבסיס טכניקת RIBO-seq טמונה העובדה כי במהלך התרגום הריבוזום קושר את מולקולת mRNA ובכך מגן על החלק הקבור של התמליל מעיכול ריבונוקלאאז. עם תוספת של ribonuclease, mRNA לא מוגן מתעכל ואת שברים מוקף ריבוזומים - בדרך כלל של ~ 28-3....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. אוסף לדוגמה

  1. הכינו תרבות חיידקים. אנו ממליצים על נפח תרבות של 100 מ"ל לכל מדגם.
  2. הכן ציוד ריאגנטים לאיסוף מדגם: שתי כפות מדידה לדגימה, סטרילי 0.45 מיקרומטר מעורב אסטרים תאית ממברנה (MCE) מסננים, 50 מ"ל צינורות סטריליים, חנקן נוזלי, 50 מ"ג / מ"ל כלוראמפניקול ב 70% (vol / vol) אתנול (אופציונלי). לנקב את המכסה של צינורות 50 מ"ל כדי לאפשר אידוי חנקן נוזלי ולמנוע פיצוץ של צינורות סגורים. מרוקנים כפות מדידה עם חומר ניקוי במעבדה ו-70% אתנול.
  3. מחממים מראש את ציוד הסינון ואת אחת הסקופולות לטמפרטורת הגדילה של תרבות החיידקים.
    הערה: אנו ממליצים על מנגנון סינון זכוכית עם משפך, בסיס פריט, בקבוקון משותף טחון ומהדק קפיץ Ø 47 מ"מ.
  4. לפני קציר מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המופתיות שהוצגו כאן התקבלו במחקר שבחן את ויסות התרגום בתאי הסאבטיליס של WT Bacillus. תרבויות לילה היו מדולל OD600 שווה 0.1 ב 100 מ"ל של בינוני עשיר דגירה ב 37 °C (600) עם רעידות נמרצות עד OD600 הגיע 0.5-0.6. המדיום העשיר הוחלף אז במדיום מינימלי כדי לגרום לתהליך ההצטברות והדגירה נמשכה עד ארבע שעות. תאים נקצרו כל שעה החל T0 - אינדוקציה sporulation - וכתוצאה מכך חמש נקודות זמן. דקה אחת לפני הקציר, התרבויות טופלו בכלוראמפניקול כמתואר בפרוטוקול לעיל. תאים נאספו על ידי סינון במערכת סינון .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האתגר הטכני העיקרי של פרופיל הריבוזום הוא הצורך לעכב במהירות את התרגום על מנת ללכוד תמונת מצב של ריבוזומים על mRNAs במצב פיזיולוגי מסוים של עניין. כדי להשיג זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. החלת אנטיביוטיקה היא אופציונלית שכן הם יכולים לגרום חפצים. כלוראמפניקול הוא סם נפוץ לעצור ריבוזומים מאריכים ב RIBO-seq חיידקי. עם זאת, זה לא מונע חניכה, וכתוצאה מכך הצטברות של ריבוזומים על שישה codons במורד הזרם של אתר ייזום תרגום14. יתר על כן, היכולת שלה לעכב את תגובת peptid.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ALS רוצה להכיר בתמיכה הכספית של EMBO התקנה מענקים IG 3914, ו POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 שבוצע במסגרת תוכנית TEAM הראשונה של הקרן למדע פולני במימון משותף של האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח אזורי.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10X TBE (אבקה)InvitrogenAM9864
2-Mercaptoethanol, 99%, טהורAcros Organics125472500
אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)ניו אינגלנד BiolabsP0756S
תחמוצת אלומיניום טהורה מסויידת p.a.Chempur114560600
סידן כלוריד דיהידראטסיגמא-אולדריץ'C3881-500G
כלורמפניקולMP ביומדיקל190321
DNA נקי & רכז -5Zymo ResearchD4004
Dnase I רקומביננטי, נטול RnaseRoche4716728001
EDTA מלח דיסודיוםFisher ScientificE/P140/48
אתיל אלכוהול אבסולוט 99,8%  Pure-PA-BasicPOCH Avantor Performance Materials פולין SABA6480111
מכשיר סינוןVWR Collection511-0265מכשיר סינון זכוכית מלאה, עם משפך, בסיס פריט, מכסה, 47 מ"מ Ø מהדק קפיץ ובקבוק מפרק קרקע
ג'ל 40 (19:1)Rotiphorese3030.1
צבע טעינת ג'ל, כחול, 6XNew England BiolabsE6138G
גואנוזין 5&פריים;-[&בטא;,&גמא;-אימידו]טריפוספט טריסודיום מלח הידרטסיגמא-אולדריץ'G0635-25MG
labZAPA& ביוטכנולוגיה040-500
מגנזיום אצטט טטרהידראטסיגמא-אולדריץ'M5661-250G
MCE מתקן ממברנהAlfatec TechnologyM47MCE45GWSגודל נקבוביות: 0.45um
MICROBExpress חיידקי mRNA טיהורInvitrogenAM1905
סט הכנה לספריית RNA קטנה מולטיפלקס עבור IlluminaNew England BiolabsE7300S
אמביון מים ללא נוקלאזAM9937
אשלגן אצטט נטול מים טהור P.A.POCH Avantor Performance Materials Poland SA744330113
טעינה מהירה pBR322 DNA-MspI Digestניו אינגלנד BiolabsE7323A
RNA נקי & רכז -25Zymo ResearchR1018
נתרן אצטטסיגמא-אולדריץ'S2889-250G
נתרן פחמתיסיגמא-אולדריץ'223530-500 גרם
נתרן מימן פחמתי טהור p.a.POCH Avantor Performance Materials Poland SA 810530115
SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהבLife TechnologiesS11494
T4 פולינוקלאוטיד קינאזניו אינגלנד BiolabsM0201L
T4 מאגר תגובת פולינוקלאוטיד קינאזניו אינגלנד BiolabsB0201S
מאגר דגימת TBE-אוריאה (2x)InvitrogenLC6876
Tris(hydroxymethyl)amino-methane, אולטרה-טהור, 99.9%AlfaAesarJ65594
Triton X-100, 98%Acros Organics327371000
Urea G.R.לך:נר40096-AP0

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
  2. Takanami, M., Yan, Y., Jukes, T. H. Studies on t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Ribosome ProfilingRIBO seq ProtocolBacterial TranslationLibrary PreparationNext Generation SequencingRibosomal FootprintsPolyacrylamide Gel ElectrophoresisTranslation InhibitionRNA SequencingBioinformatic Analysis

Related Articles