כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

Summary

מאמר זה מתאר שיטה מבוססת ריחוף מגנטית שיכולה לזהות באופן ספציפי נוכחות של אנטיגנים, מסיסים או קשורים לממברנה, על ידי כימות שינויים בגובה הריחוף של חרוזי לכידה עם צפיפות קבועה.

Abstract

השיטה המתוארת פותחה על בסיס עקרונות הריחוף המגנטי, המפריד בין תאים וחלקיקים על סמך צפיפותם ומאפייניהם המגנטיים. Density הוא מאפיין מזהה סוג תא, הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו, לבידול ולמצב ההפעלה שלו. ריחוף מגנטי מאפשר גישה חד-שלבית כדי להפריד, לדם ולאפיין בהצלחה תאי דם במחזור, ולזהות אנמיה, מחלת חרמשית ותאי גידול במחזור המבוססים על צפיפות ומאפיינים מגנטיים. גישה זו מקובלת גם על זיהוי אנטיגנים מסיסים הנמצאים בפתרון באמצעות סטים של חרוזים בצפיפות נמוכה וגבוהה מצופים בנוגדנים ללכידה וזיהוי, בהתאמה. אם האנטיגן נמצא בתמיסה, הוא יגשר בין שני סטים של חרוזים, יצירת קומפלקס חרוזים חדש, אשר מרחף בין השורות של חרוזים מצופים נוגדנים. ריכוז מוגבר של האנטיגן היעד בפתרון יפיק מספר גדול יותר של מתחמי חרוזים בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר של אנטיגן, ובכך יאפשר מדידות כמותיות של אנטיגן היעד. ריחוף מגנטי הוא יתרון לשיטות אחרות בשל זמן הכנת המדגם הירידה שלה וחוסר תלות בשיטות קריאה קלאסיות. התמונה שנוצרת נלכדת ומנותחת בקלות באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי או מכשיר נייד, כגון טלפון חכם או טאבלט.

Introduction

ריחוף מגנטי הוא טכניקה שפותחה כדי להפריד, לנתח ולזהות סוגי תאים^1,2,3, חלבונים^4,5 ואופיואידים⁶ המבוססים אך ורק על הצפיפות הספציפית שלהם ואת המאפיינים paramagnetic. צפיפות תאים היא מאפיין ייחודי ומהותי של כל סוג תא הקשור ישירות לקצב חילוף החומרים שלו ומצב הבידול^{שלו 7,8,9,10,11,12,}

Protocol

הפרוטוקול הניסיוני המשמש במחקר זה אושר על ידי הוועדה לבדיקה מוסדית של המרכז הרפואי בית ישראל דיקונס (IRB).

1. התקנת מכשיר

הערה: הדמיה של תאים מרחפים דורשת שני מגנטים נדירים של ניאודימיום אדמה הממוגנטים על ציר z כדי להיות ממוקמים עם אותו מוט אחד מול השני כדי ליצור שדה מגנטי. המרחק בין המגנטים יכול להיות מותאם אישית בהתאם לעוצמת השדה המגנטי וצפיפות המטרות. במקרה זה המגנטים מופרדים על ידי שטח 1 מ"מ מספיק להחדרה של צינור נימי זכוכית מרובע באורך 50 מ"מ 1x1 מ"מ. ההתקן הודפס בתלת-ממד באמצעות עיצוב AutoCAD, הזמין על פי בקשה.

1. הנח מיקרוסקופ על צידו, אופקי לחלוטין.
   הערה: מיקרוסקופ הממוקם בתנוחה זקופה סטנדרטית א....

Results

ריחוף מגנטי ממקד עצמים בצפיפות שונה בגבהי ריחוף שונים בהתאם לצפיפות האובייקט, החתימה המגנטית שלו, ריכוז התמיסה הפרמגנטית וכוח השדה המגנטי שנוצר על ידי שני מגנטים חזקים ונדירים של כדור הארץ. כששני המגנטים מונחים זה על גבי זה, ניתן לצפות רק בדגימות מרחפות, תוך שמירה על תאורת קולר, באמצעות מיקרוסקופ שהופנה על צידו(איור 1). ניתן לשנות בקלות את גובה הריחוף הסופי אליו מגיע כל סוג תא על ידי שינוי הריכוז של הפתרון הפרמגנטי. איור 2 ממחיש את ההפרדה בין תאי הדם השונים במחז.......

Discussion

צנטריפוגה הדרגתית היא כיום הטכניקה הסטנדרטית לבידוד רכיבים תת-תאיים בהתבסס על הצפיפות הייחודית שלהם. גישה זו, לעומת זאת, דורשת שימוש במדיה הדרגתית מיוחדת, כמו גם ציוד צנטריפוגות. גישת הריחוף המגנטי המוצגת כאן מאפשרת חקירה מפורטת של התכונות המורפולוגיות והתפקודיות של תאים במחזור, עם מינימום, אם בכלל מניפולציה של התאים, המספקת גישה כמעט in vivo לתאים במחזור.

עם זאת, בעת שימוש בריחוף מגנטי מספר נקודות ראוי להזכיר. ראשית, המיקרוסקופ המשמש להדמיה חייב להיות מוקדש לשיטה זו, שכן ההתקנה גוזלת.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-(N-Morpholino) הידרט חומצה אתנסולפונית	סיגמא אולדריץ'	M-2933	(MES); רכיב מגנטים של מאגר הפעלה
50x2.5x1 מ"מ, מצופה ניקל (Ni-Cu-Ni), דרגה N52, ממוגנט בעובי 5 מ"מ (0.197 אינץ')	K& J Magnetics	מגנטים מותאמים אישית	המשמשים למכשיר הריחוף המגנטי
איטום צינורות נימי (Critoseal)	Leica Microsystems	267620	משמש לכיסוי קצות הצינורות הנימים
מסנני צינור צנטריפוגה (Corning Costar Spin-X)	Sigma Aldrich	CLS8163	משמש לשטיפת חרוזים
מעבדה קומפקטית ג'ק	Thorlabs	LJ750	משמש להתאמת מכשיר הריחוף המגנטי
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום	Gibco	14190-144	תמיסה לתרחיפים חרוזים
אתנולמין	סיגמא אולדריץ'	E9508-100ML	משמש במהלך שלב כביסה לחרוזים
כתם קרום פלזמה פלורסנט (CellMask Green)	Invitrogen	C37608	משמש להכתמת תאי Rh +
הזרקת Gadoteridol	ProHance	NDC 0270-1111-03	גדוליניום (Gd3+); תמיסה מגנטית המשמשת להשעיית תאים
HBSS++	Gibco	14025-092	פתרון להכנת דגימה
אנושי C5b,6 קומפלקס	Complement Technology, Inc	A122	משמש לייצור RBC Evs
Human C7 חלבון	Complement Technology, Inc	A124	משמש לייצור RBC Evs
Human C8 חלבון	Complement Technology, Inc	A125	משמש לייצור RBC Evs
Human C9	protein Complement Technology, Inc	A126	משמש לייצור RBC Evs
Mini Series Post Collar	Thorlabs	MSR2	משמש לאבטחת מכשיר ריחוף מגנטי לשקעי מעבדה
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride	Sigma Aldrich	E1769-10G	(EDC); משמש בתגובת צימוד נוגדנים
בקרת IgG רגילה של ארנב	מו"פ D Systems	AB-105-C	משמש לציפוי חרוזים כתנאי בקרה
פוספט חוצץ מלח (תמיסה 10X, pH 7.4)	Boston Bioproducts	BM-220	רכיב של מאגר צימוד, המשמש לשלבי כביסה
פוליסורבט 20 (Tween 20)	Sigma Aldrich	P7949-500ML	רכיב של מאגר הפעלה
פוליסטירן קרבוקסיל	פולימר Bangs Laboratories	PC06004	חרוזים בצפיפות עליונה (1.05 גרם/מ"ל), המשמשים לצימוד נוגדנים
ארנב RhD נוגדן פוליקלונלי	Invitrogen	PA5-112694	משמש לציפוי חרוזים להסרת גורם Rh בתאי דם אדומים
מיקרוסקופ בדרגת מחקר	אולימפוס	פרוביס AX-70	מיקרוסקופ המשמש להרכבה של מכשיר ריחוף מגנטי וצפייה בתאים מרחפים
רגלי שיכוך גומי	Thorlabs	RDF1	משמש לתמיכה בשולחן לוח הלחם
צינורות בורו מרובעים	VitroTubes	8100-050	צינור נימי המשמש להעמסת דגימה לתוך Maglev
Sulfo-NHS	Thermoscientific	24510	משמש בתגובת צימוד נוגדנים
שלב תרגום	Thorlabs	PT1	משמש למיקוד ולסריקת צינור נימי