אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי
במאמר זה
סיכום
תקציר
צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.
מבוא
צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. חומרים ריאגנטים
- השתמש בפתרונות חינם pyrogenic ובינוני עבור תרבות התא (טבלה 1).
- הכינו פתרונות לניסוי הביוכימי באמצעות מים אולטרה-דקים והשתמשו בהם כ-DNase/RNase ללא תשלום.
- בחר FBS מתאים עבור תרבות התא עם תהליך בדיקה רב. מאחר שמגרש FBS שנבחר משתנה באופן קבוע, אין אפשרות לייצג כאן את הקטלוג ואת מספר הלוט עבור FBS.
- פלסמיד דנ"א
- הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל.
הערה: meGFP היא גרסה מונומרית הנושאת מוטציה A2....
- הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ביצענו מדידת FCS של GFP-TDP25 בתא ליסקאט ו- SOD1-G85R-GFP בתאים חיים. בשני המקרים, משרעת חיובית ACFs חלקה הצליחו לרכוש. הראינו כי חלק GFP-TDP25 לידי ביטוי בתאי Neuro2a התאושש בשבר מסיס תחת התנאי המצוין6. בחלק המסיס של lysate התא, מולקולות פלואורסצנטיות בהירות מאוד זוהו ברשומה קצב ספירת פוטון באמצעות FCS (איור 2A, למעלה, חץ). כזה "קוצים (המכונה גם פרץ)" לא נצפו מונומרים GFP ותמיסת צבע פלואורסצנטי כימי מונודיספרס, מה שמרמז כי הקוצים מצביעים על חלבונים אוליגומריים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ"מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חור הסיכה. יש להימנע משיעורי ספירת פוטון גבוהים במיוחד כדי להגן על הגלאי (למשל, יותר מ-1,000 קילו-הרץ). יתר על כן, הפתרון המרוכז אינו מתאים לרכישת פונקציית תיקון אוטומטי (לשמור על פחות מ 100 kHz). הכיול של מיקום חור סיכה חשוב. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אלה אין ניגודי אינטרסים.
תודות
A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים "כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות" (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים "פיזיקת מידע בענייני חיים" (#20H05522).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% (w/v) טריפסין-1 ממול/ליטר EDTA· תמיסת 4Na עם פנול אדום (טריפסין-EDTA) | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 201-16945 | |
| צלחות פלסטיק 100 מ"מ | CORNING | 430167 | |
| צלחת בסיס זכוכית 35 מ"מ | IWAKI | 3910-035 | למדידת תאים חיים |
| צלחות פלסטיק 35 מ"מ | Thermo Fisher Scientific | 150460 | |
| צלחת אלומיניום | Bio-Bik | AB-TC1 | |
| C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27 | Carl Zeiss | מגרד תאים אובייקטיבי | |
| Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-93100 | ||
| קרום מסנן אצטט תאית (0.22 מ"מ) | Advantech Toyo | 25CS020AS | |
| תא זכוכית כיסוי 8 בארות | IWAKI | 5232-008 | למדידת תמיסה |
| מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | בינוני בסיסי |
| סרום בקר עוברי (FBS) | biosera | נדרשת בדיקת אצווה | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| LSM510 META + ConfoCor3 | Carl Zeiss | FCS מערכת | |
| נוירובלסטומה עכברית תאי Neuro2a | ATCC | CCL-131 | קו תאים |
| Opti-MEM I | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| pCAGGS | RIKEN | RDB08938 | DNA פלסמיד לנשא הטרנספקציה |
| תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (ופעמים; 100 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 168-23191 | |
| pmeGFP-C1-TDP25 | DNA פלסמיד עבור TDP25 מתויג עם מונומרי eGFP | ||
| pmeGFP-N1 | DNA פלסמיד לביטוי מונומר eGFP | ||
| pmeGFP-N1-SOD1-G85R | DNA פלסמיד עבור מוטציה G85R הקשורה ל-ALS של SOD1 מתויג עם | ||
| קוקטייל מעכב פרוטאז | Sigma-Aldrich | P8304 |
מקורות
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
- Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
