Method Article

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

DOI:

10.3791/62576

⸱

April 25th, 2021

 ,  , 
1Laboratory for Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים כאן הליך למדידת אוליגומרים של חלבונים וצבירה בתאים ליזלתיים ותאים חיים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטיות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבירת חלבונים היא סימן ההיכר של הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב אמיוטרופית (ALS), מחלת אלצהיימר (לספירה), מחלת פרקינסון (PD), מחלת הנטינגטון (HD), וכן הלאה. כדי לזהות ולנתח אוליגומרים או אגרגטים של חלבונים מסיסים או מפוזרים, נעשה שימוש בספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי (FCS), שיכולה לזהות את מהירות הדיפוזיה והבהירות של חלקיק יחיד עם רגישות למולקולות בודדות. עם זאת, ההליך הנכון והידע לגילוי צבירת חלבונים לא שותפו באופן נרחב. כאן, אנו מראים הליך סטנדרטי של מדידת FCS עבור מאפייני דיפוזיה של חלבונים נוטים לצבירה בתאים ליזאטים חיים: ALS הקשורים 25 kDa קרבוקסיל-מסוף שבר של TAR DNA / RNA מחייב חלבון 43 kDa (TDP25) ו סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). התוצאות הייצוגיות מראות כי חלק אגרגטים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)-מתויג TDP25 נכלל מעט בחלק מסיס של neuroblastoma מורין Neuro2a תא lysate. יתר על כן, GFP מתויג SOD1 נושאת מוטציה הקשורה ALS מראה דיפוזיה איטית יותר בתאים חיים. בהתאם לכך, אנו מציגים כאן את ההליך לגילוי צבירת החלבון באמצעות נכס הדיפוזיה שלו באמצעות FCS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

צבירות חלבון המערבות הפרעות ניווניות כגון טרשת לרוחב amyotrophic (ALS), מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, מחלת הנטינגטון, וכן הלאה1 ידועים להיות רעילים יפריע הומאוסטזיס חלבון (פרוטוסטזיס) בתאים ובאיברים, זה יכול אז להוביל להזדקנות2. אישור צבירת החלבון צפוי כאסטרטגיה טיפולית; עם זאת, כימיקלים המונעים היווצרות צבירת חלבונים ואגרגטים של חלבונים משפילים (למשל, מולקולות קטנות או תרופות) עדיין לא הוקמו. יתר על כן, איך צבירת חלבון מפעיל רעילות נשאר חמקמק. לכן, כדי לקדם פרויקטים מחקריים הקשורים לצבירת חלבונים, חשוב להציג נהלי תפוקה גבוהים פשוט כדי לזהות צבירת חלבונים. גילוי צבירת חלבונים באמצעות נוגדנים המזהים את ההתאמה של צבירת חלב....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חומרים ריאגנטים

  1. השתמש בפתרונות חינם pyrogenic ובינוני עבור תרבות התא (טבלה 1).
  2. הכינו פתרונות לניסוי הביוכימי באמצעות מים אולטרה-דקים והשתמשו בהם כ-DNase/RNase ללא תשלום.
  3. בחר FBS מתאים עבור תרבות התא עם תהליך בדיקה רב. מאחר שמגרש FBS שנבחר משתנה באופן קבוע, אין אפשרות לייצג כאן את הקטלוג ואת מספר הלוט עבור FBS.
  4. פלסמיד דנ"א
    1. הכן pmeGFP-N15 לביטוי מונומר eGFP; pmeGFP-C1-TDP256 עבור ביטוי GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R7 עבור ביטוי SOD1-G85R-GFP; ו pCAGGS8 כמוביל.
      הערה: meGFP היא גרסה מונומרית הנושאת מוטציה A2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ביצענו מדידת FCS של GFP-TDP25 בתא ליסקאט ו- SOD1-G85R-GFP בתאים חיים. בשני המקרים, משרעת חיובית ACFs חלקה הצליחו לרכוש. הראינו כי חלק GFP-TDP25 לידי ביטוי בתאי Neuro2a התאושש בשבר מסיס תחת התנאי המצוין6. בחלק המסיס של lysate התא, מולקולות פלואורסצנטיות בהירות מאוד זוהו ברשומה קצב ספירת פוטון באמצעות FCS (איור 2A, למעלה, חץ). כזה "קוצים (המכונה גם פרץ)" לא נצפו מונומרים GFP ותמיסת צבע פלואורסצנטי כימי מונודיספרס, מה שמרמז כי הקוצים מצביעים על חלבונים אוליגומריים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לגבי כיול המערכת לפני המדידות, יש להשתמש באותן כלי זכוכית המשמשים למדידת הדגימה (למשל, 8 הבארות מכסות תא זכוכית עבור ליזלת תאים ותבשיל בסיס זכוכית 35 מ"מ לתאים חיים). בגלל ספיחה של Rh6G על הזכוכית, הריכוז האפקטיבי שלה עשוי לפעמים להקטין. אם כן, יש להשתמש בתמיסת Rh6G מרוכזת מאוד כגון μM 1 רק להתאמת חור הסיכה. יש להימנע משיעורי ספירת פוטון גבוהים במיוחד כדי להגן על הגלאי (למשל, יותר מ-1,000 קילו-הרץ). יתר על כן, הפתרון המרוכז אינו מתאים לרכישת פונקציית תיקון אוטומטי (לשמור על פחות מ 100 kHz). הכיול של מיקום חור סיכה חשוב. .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אלה אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.K. נתמך על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענק בסיוע למחקר מדעי (C) (#18K06201), על ידי מענק בסיוע של קרן Nakatani לאופני נגד זיהומים חדשים בנגיף הקורונה, על ידי מענק ממשרד אוניברסיטת הוקאידו לפיתוח מנהיגי מחקר עתידיים (L-Station), ומענק בסיוע מקרן Hoansha. M. K. נתמך חלקית על ידי JSPS Grant-in-Aid למחקר מדעי על תחומים חדשניים "כימיה עבור מערכות ביולוגיות צפיפות רב-מולקולריות" (#20H04686), ומענק JSPS למחקר מדעי על תחומים חדשניים "פיזיקת מידע בענייני חיים" (#20H05522).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% (w/v) טריפסין-1 ממול/ליטר EDTA· תמיסת 4Na עם פנול אדום (טריפסין-EDTA)Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.201-16945
צלחות פלסטיק 100 מ"מCORNING430167
צלחת בסיס זכוכית 35 מ"מIWAKI3910-035למדידת תאים חיים
צלחות פלסטיק 35 מ"מThermo Fisher Scientific150460
צלחת אלומיניוםBio-BikAB-TC1
C-Apochromat 40x/1.2NA Korr. UV-VIS-IR M27Carl Zeissמגרד תאים אובייקטיבי
Sumitomo Bakelite Co., Ltd.MS-93100
קרום מסנן אצטט תאית (0.22 מ"מ)Advantech Toyo25CS020AS
תא זכוכית כיסוי 8 בארותIWAKI5232-008למדידת תמיסה
מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)Sigma-AldrichD5796בינוני בסיסי
סרום בקר עוברי (FBS)bioseraנדרשת בדיקת אצווה
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019
LSM510 META + ConfoCor3Carl ZeissFCS מערכת
נוירובלסטומה עכברית תאי Neuro2aATCCCCL-131קו תאים
Opti-MEM IThermo Fisher Scientific31985070
pCAGGSRIKENRDB08938DNA פלסמיד לנשא הטרנספקציה
תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין (ופעמים; 100Fujifilm Wako Pure Chemical Corp.168-23191
pmeGFP-C1-TDP25DNA פלסמיד עבור TDP25 מתויג עם מונומרי eGFP
pmeGFP-N1DNA פלסמיד לביטוי מונומר eGFP
pmeGFP-N1-SOD1-G85RDNA פלסמיד עבור מוטציה G85R הקשורה ל-ALS של SOD1 מתויג עם
קוקטייל מעכב פרוטאזSigma-AldrichP8304
) eGFP מונומרי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  2. Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. The proteostasis network and its decline in ageing. Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein AggregationFluorescence Correlation SpectroscopyNeurodegenerative DisordersDiffusion PropertiesCell LysateLive Cell MeasurementGFP Tagged ProteinsCurve Fitting AnalysisConfocal MicroscopySoluble Oligomers

Related Articles