Method Article

חתך אופטי והדמיה של הדיסק הבין חולייתי מהתפתחות עוברית לניוון

DOI:

10.3791/62594

⸱

July 8th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology, Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 2Department of Orthopedic Surgery, University Hospital of Tübingen, 3Institute for Bioinformatics and Medical Informatics, Faculty of science of the University of Tübingen, 4Medical faculty of the University of Tübingen, 5Bavarian Health and Food Safety Authority

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים שיטה לחקור ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס של הדיסק הבין חולייתי בשיטת חתך אופטית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניוון דיסק בין חולייתי (IVD) הוא גורם מוביל לכאבי גב תחתון והוא כרוך במידה גבוהה של פגיעה עבור אנשים מושפעים. כדי לפענח ניוון דיסק ולהיות מסוגל לפתח גישות התחדשות הבנה יסודית של הביולוגיה התאית של IVD הוא חיוני. היבט אחד של ביולוגיה זו שעדיין נותר ללא מענה הוא השאלה כיצד תאים מסודרים מרחבית במצב פיזיולוגי ובמהלך ניוון. המאפיינים הביולוגיים של IVD וזמינותו מקשים על ניתוח רקמה זו. המחקר הנוכחי חוקר ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון סופני. שיטת חתך אופטית (Apotome) מוחלת כדי לבצע ניתוחי כתמים ברזולוציה גבוהה באמצעות רקמת עובר בקר כמודל בעלי חיים ורקמת דיסק אנושית המתקבלת מחולים שעברו ניתוח בעמוד השדרה. מתוך צפיפות כונדרוציטים גבוהה מאוד בדיסק בקר עוברי מוקדם, מספר התאים פוחת במהלך ההריון, הצמיחה וההתבגרות. בדיסקים אנושיים, עלייה בצפיפות התאים ליוותה את התקדמות ניוון הרקמות. כפי שכבר הוכח בסחוס מפרקי, היווצרות אשכול מייצג תכונה אופיינית של ניוון דיסק מתקדם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא מבנה מבוסס סחוס, כי ביוכימית וביחס לארכיטקטורה הסלולר, ממבט ראשון, דומה במובנים רבים הסחוס המפרקי1. ואכן, הן ניוון IVD והן דלקת מפרקים ניוונית (OA) של סחוס מפרקים מאופיינים על ידי צמצום שטח משותף עקב שחיקת סחוס, ציסטה תת-כונדרית היווצרות אוסטאופיפט, וטרשת תת-ביתית2,3. למרות הדמיון לכאורה הזה ארכיטקטורה ותפקיד תפקודי של שתי הרקמות שונים. בעוד המטריצה של סחוס מפרקי נוצרת בעיקר מרשת קולגן מסוג II היוצרת ארקייד, ה- IVD מורכב משלושה סוגים שונים של רקמות: פולפוס הגרעין העשיר בקולגן II במרכז תופס עומסים ציריים ומעביר אותם לטבעת מקיפה של סיבי קולגן עגולים מסוג I צפו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לניתוח התפתחות עוברית והבשלה, נעשה שימוש בדיסקים של בקר. כדי להעריך את ניוון ההפרה ההפרה,דגימות אנושיות נותחו.

רקמת IVD אנושית התקבלה מחולים שעברו ניתוח לניוון דיסק מותני, צניחת דיסק או טראומה בעמוד השדרה במחלקה לכירורגיה אורתופדית, בבית החולים האוניברסיטאי של טיבינגן ובמרכז הטראומה BG Tübingen. אישור מלא של ועדת האתיקה התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מספר 244/2013BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

רקמת בקר התקבלה ממשרד הבריאות והבטיחות במזון של בוואריה/אוברשלהיים וממפעל עיבוד בוורטאוסן (גרמניה). אישור הרשויות המקומיות והווטרינריות התקבל לרקמה מבעלי חיים מתי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות תמונות פסיפס, ניתן לזהות בבירור את הארכיטקטורה של ה-IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלו באנולו והגרעין הרך יותר(איור 4). במהלך התפתחות עוברית ניתן לראות ירידה מתמשכת בצפיפות התאים (איור 5). בעוד בשלבים המוקדמים של פיתוח IVD ניתן למצוא צפיפות תאים של 11,435 תאים /מ"מ רבוע בסיבי אנולוס בקר ו 17,426 תאים / מ"מ² בגרעין הבעירה פולפוס, מספרים אלה להקטין במהירות ל 1,011 תאים / מ"מ² (פיברו אנולוס בקר) ו 488 תאים / mm² (גרעין בקר פולפוס) עד הלידה. בבקר הבוגר נראים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מוגברת על ידי הדמיית פסיפס וחתך אופטי, הערכנו את הסידור המרחבי של כונדרוציטים באנולוס של IVD המותני לאורך כל הפיתוח, ההתבגרות, ניוון. בעוד רקמות ניווניות ניתן לקצור מחולים שקיבלו ניתוח עמוד השדרה עבור ניוון דיסק, ניתוח של התקופה העוברית ושלב ההתבגרות נדרשו שימוש באורגניזם מודל (בקר). צפיפות תאית גבוהה נרשמו אנולוס במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. במהלך הפיתוח הנוסף, צמיחה לאחר ההבשלה והתבגרות ניתן היה לראות ירידה בולטת בצפיפות התאים. ברקמה האנושית עם ניוון דיסק מתקדם, נוכל לכמת עלייה בצפיפו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם. אנו מודים לשרלוט אמה במברגר על שעזרה להשיג את תמונות האפוטום.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
אמפוטריצין BMerck KGaA,  גרמניהA2942
שקופיות מיקרוסקופ הידבקות SuperFrost PlusR. Langenbrinck, גרמניה03-0060
ApoTomeCarl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה462000115
AxioVision Rel. 4.8 עם Modul MosaiXCarl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה
CellMask Actin מעקב אחר כתםThermo Fischer Scientific, ארה"בA57249
CryostatLeica Biosystems, ארה"בCM3050S
DAPIThermo Fischer Scientific, ארה"בD1306
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)Gibco, Life Technologies, גרמניה41966052
חומצה אתילנדיאמינטטראצטיתSigma-Aldrich, ארה"ב60004
מיקוסקופ פלואורסצנטי - Axio Observer Z1 עם Axio Cam MR3 ו-ColibriCarl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה3834000604
פורמלדהידMerck KGaA,  גרמניה104002
תמונה J 1.53a, עם תוסף מונה תאיםהמכון הלאומי לבריאות (NIH), ארה"
Invitrogen Alexa Fluor 568 PhalloidinThermo Fischer Scientific, ארה"בA12380
משקפי כיסוי מיקרוסקופייםR. Langenbrinck, גרמניה01-1818/1
PAP Pen חוסם נוזליםשירותים מדעיים  GmbH, גרמניהN71310
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא-אולדריץ', ארה"בP4333
פוספט חוצץ מלחסיגמא-אולדריץ', ארה"בP5119
אזמלpf medical AG, גרמניה2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compoundסאקורה פינטק, הולנדSA6255012
ב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
  2. Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intervertebral DiscDisc DegenerationOptical SectioningChondrocyte OrganizationEmbryonic DevelopmentMosaic ImagingFluorescence MicroscopyCell Density AnalysisAnnulus FibrosusNucleus Pulposus

Related Articles