חתך אופטי והדמיה של הדיסק הבין חולייתי מהתפתחות עוברית לניוון

Summary

אנו מציגים שיטה לחקור ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס של הדיסק הבין חולייתי בשיטת חתך אופטית.

Abstract

ניוון דיסק בין חולייתי (IVD) הוא גורם מוביל לכאבי גב תחתון והוא כרוך במידה גבוהה של פגיעה עבור אנשים מושפעים. כדי לפענח ניוון דיסק ולהיות מסוגל לפתח גישות התחדשות הבנה יסודית של הביולוגיה התאית של IVD הוא חיוני. היבט אחד של ביולוגיה זו שעדיין נותר ללא מענה הוא השאלה כיצד תאים מסודרים מרחבית במצב פיזיולוגי ובמהלך ניוון. המאפיינים הביולוגיים של IVD וזמינותו מקשים על ניתוח רקמה זו. המחקר הנוכחי חוקר ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון סופני. שיטת חתך אופטית (Apotome) מוחלת כדי לבצע ניתוחי כתמים ברזולוציה גבוהה באמצעות רקמת עובר בקר כמודל בעלי חיים ורקמת דיסק אנושית המתקבלת מחולים שעברו ניתוח בעמוד השדרה. מתוך צפיפות כונדרוציטים גבוהה מאוד בדיסק בקר עוברי מוקדם, מספר התאים פוחת במהלך ההריון, הצמיחה וההתבגרות. בדיסקים אנושיים, עלייה בצפיפות התאים ליוותה את התקדמות ניוון הרקמות. כפי שכבר הוכח בסחוס מפרקי, היווצרות אשכול מייצג תכונה אופיינית של ניוון דיסק מתקדם.

Introduction

הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא מבנה מבוסס סחוס, כי ביוכימית וביחס לארכיטקטורה הסלולר, ממבט ראשון, דומה במובנים רבים הסחוס המפרקי¹. ואכן, הן ניוון IVD והן דלקת מפרקים ניוונית (OA) של סחוס מפרקים מאופיינים על ידי צמצום שטח משותף עקב שחיקת סחוס, ציסטה תת-כונדרית היווצרות אוסטאופיפט, וטרשת תת-ביתית^2,3. למרות הדמיון לכאורה הזה ארכיטקטורה ותפקיד תפקודי של שתי הרקמות שונים. בעוד המטריצה של סחוס מפרקי נוצרת בעיקר מרשת קולגן מסוג II היוצרת ארקייד, ה- IVD מורכב משלושה סוגים שונים של רקמות: פולפוס הגרעין העשיר בקולגן II במרכז תופס עומסים ציריים ומעביר אותם לטבעת מקיפה של סיבי קולגן עגולים מסוג I צפופים הנקראים סינולוס סיביים. תפקידם הוא לספוג את הלחצים הארזיים המתורגמים המתקבלים על ידי הגרעין הפרוטאוגליקני והעשיר במים עם חוזק הסיבים האורך המתוח שלהם. בחלק העליון והתחתון של כל גרעין ואנולוס, לוחית קצה קרטלגינית היאלין יוצרת את הצומת לחוליות הסמוכות⁴ (איור 1).

בסחוס מפרקי ניתן למצוא ארבעה דפוסי כונדרוציטים מרחביים נפרדים: זוגות, מחרוזות, מחרוזות כפולות, אשכולות קטנים בהתאמה גדולים^5,6,7 ( איור2). שינויים בתבנית זו משויכים להתפרצות OA ולהתקדמות^8,9. ארגון chondrocyte מרחבי מעיד גם על מאפיין פונקציונלי ישיר של סחוס, כלומר נוקשותו, הדגיש את הרלוונטיות התפקודית של גישה זו דירוג מבוסס תמונה^10,11. דפוסים אלה יכולים גם להיות מזוהים עם טכנולוגיה כבר קיים קליני זמין¹². בשל הדמיון בין IVD וסחוס מפרקי, ניתן לשער כי דפוסי chondrocyte אופייניים נמצאים גם בעירוי. היווצרות אשכול היא תופעה שנצפתה גם בהבחנה מנוונת^13,14.

כאשר מנסים לנתח ארגון סלולרי מרחבי בעירוי, יש צורך להתגבר על מספר קשיים טכניים שאינם קיימים בעת חקירת סחוס מפרקי:

ראשית, עיבוד הרקמה עצמה הוא הרבה יותר מאתגר מאשר עם סחוס היאלין הומוגני אשר מורכב בעיקר קולגן סוג II. רכיב הסיבים העיקרי של ה-IVD הוא קולגן מסוג I, מה שמקשה הרבה יותר על יצירת מקטעים היסטולוגיים דקים. בעוד בסחוס מפרקי היאלין אפילו חלקים עבים ניתן לנתח בקלות בשל אופי "דמוי זכוכית" של הרקמה, סוג הקולגן I רשת של IVD הוא אופטי מאוד בלתי חדיר. מסיבה זו, רעש רקע חזק הוא בעיה נפוצה בהצטולוגיה של IVD. דרך מהירה וזולה לחדור לרקמה צפופה אופטית זו היא שימוש במכשיר חתך אופטי למשל, באמצעות אפופוטם. באפוטום כזה, רשת מוכנסת במסלול התאורה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי. מול הרשת מונחת צלחת זכוכית מקבילה למטוס. פעולה זו נוטה קדימה ואחורה ובכך מקרינת את הרשת בתמונה בשלושה מיקומים שונים. עבור כל מיקום z, שלוש תמונות גולמיות עם הרשת המוקרנת נוצרות ומונחות על-גבי. באמצעות תוכנה מיוחדת, ניתן לחשב את האור מחוץ למיקוד. העיקרון הבסיסי הוא שאם הרשת גלויה, המידע הזה נמצא במוקד, אם לא הוא נחשב לא ממוקד. עם טכניקה זו, תמונות ממוקדות היטב ברזולוציה גבוהה ניתן לרכוש בפרק זמן סביר.

שנית, קשה להשיג את הרקמה מתורמים אנושיים. בעת ביצוע החלפת ברך מוחלטת, ניתן להשיג את כל פני השטח של המפרק לניתוח נוסף במהלך הניתוח. למרות דלקת מפרקים ניוונית של מפרק diarthrodial היא גם מחלה של המפרק כולו, ישנם בכל זאת הבדלים מוקדיים חזקים באיכות הסחוס עם בדרך כלל כמה אזורים של המפרק עדיין להיות שלם, למשל בשל עומס מופחת באזור זה. מצב זה שונה בהפריה הVD, שם הניתוח מבוצע בדרך כלל רק כאשר הדיסק נהרס ברחבי העולם. בעת קבלת רקמות מתורמים אנושיים מחדר הניתוח, הרקמה גם מקוטעת מאוד ויש צורך להקצות כראוי את הרקמה לאחד משלושת סוגי הסחוס של ה- IVD לפני ביצוע ניתוחים נוספים. כדי לאפשר ניתוחים מפורטים יותר של קטעי רקמות גדולים יותר ולבדוק את ההתפתחות העוברית של IVD הבחירה של אורגניזם מודל בעלי חיים היא, אם כן, הכרחית.

בעת בחירת אורגניזם מודל כזה חשוב שתהיה מערכת הדומה לדיסק האנושי ביחס לאנטומיה ומידותיו, העמסה המכנית שלו, אוכלוסיית התא הנוכחית כמו גם הרכב הרקמה שלה. לצורך הטכניקה המוצגת כאן אנו מציעים את השימוש ברקמת דיסק מותני בקר: מאפיין קריטי של הדיסק האנושי וכתוצאה מכך הפוטנציאל ההתחדשותי הנמוך שלו הוא אובדן תאים לא-רדודליים במהלך ההבשלה בגרעין. עם זאת, במודלים רבים אורגניזמים notochordal תאים ניתן לזהות כל חייהם. לרוב בעלי החיים המעטים שמאבדים את התאים הלא-נוכרודים שלהם כמו כבשים, עזים או כלבי כונדרודיסטרופיג יש IVD שהוא קטן בהרבה מדיסקים אנושיים. רק דיסקים מותניים של בקר נוכחים עם קוטר דיסק קשתי דומה לאלה של IVDs אנושי¹⁵.

גורם מפתח המוביל לניוון דיסק מוקדם הוא טעינה מכנית מוגזמת. הלחצים התוך-ממדיים של פרה עומדת בעמוד השדרה המותני הם בסביבות 0.8 MPa כשעמוד השדרה מיושר אופקית. באופן מפתיע לחצים אלה דומים ללחצים התוך-דיקליים המותניים שדווחו לעמוד השדרה האנושי הזקוף (0.5 MPa)^15,16. גם כמות המים ופרוטוגליקנים בדיסקים של בקר דומה לזו של ה- IVD מבני אדם צעירים¹⁷. לכן, למרות שדפוס התנועה בפועל של מקטעי התנועה עשוי להיות שונה בבעלי חיים מרובעים מהאדם הדו-רגליים, ביחס למאפייני הטעינה והדיסק הכוללים, הפרה קרובה הרבה יותר לביולוגיה האנושית מאשר מודלים בעלי חיים מבוססים אחרים עבור IVD כגון כבשים וכלבים.

בפרוטוקול זה אנו מציגים טכניקה כיצד לנתח שינויים בהפריה חוץ גופית מנקודת המבט של ארגון כונדרוציטים מרחבי מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון שלב הסיום.

Protocol

לניתוח התפתחות עוברית והבשלה, נעשה שימוש בדיסקים של בקר. כדי להעריך את ניוון ההפרה ההפרה,דגימות אנושיות נותחו.

רקמת IVD אנושית התקבלה מחולים שעברו ניתוח לניוון דיסק מותני, צניחת דיסק או טראומה בעמוד השדרה במחלקה לכירורגיה אורתופדית, בבית החולים האוניברסיטאי של טיבינגן ובמרכז הטראומה BG Tübingen. אישור מלא של ועדת האתיקה התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מספר 244/2013BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.

רקמת בקר התקבלה ממשרד הבריאות והבטיחות במזון של בוואריה/אוברשלהיים וממפעל עיבוד בוורטאוסן (גרמניה). אישור הרשויות המקומיות והווטרינריות התקבל לרקמה מבעלי חיים מתים.

1. קציר מדגם

1. רקמת IVD אנושית: יש להניח דגימות IVD שהושגו תוך ניתוח באופן מיידי במדיום הנשר המעודכן (DMEM) של Dulbecco עם 2% (v/v) של פניצילין-סטרפטומיצין ו-1.2% (v/v) אמפטריצין B. חנות ב-4 °C עד לעיבוד נוסף. לעבד את הרקמה בתוך 48 שעות. לחלופין, לאחסן את הרקמות ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות.
2. רקמת IVD בקר: הקפד לקצור את הרקמה מבעלי החיים בתוך 24 שעות לאחר המוות.
   תחברו את דיסקי הקרן עם החוליות שמסביב מהחיות המתות. מעבירים את הרקמה הקפואה על קרח יבש ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף.
   הערה: אם רק ניתוחי פלואורסצנטיות נועדו ולא מתוכננות שיטות כימות ביוכימיות נוספות כגון ELISA או PCR, בצע את קיבוע הרקמות כפי שהוסבר להלן. זה מאפשר לשמור על הרקמה זמן רב יותר באחסון לפני שהוא צריך להיות מעובד. כדי למנוע הידרדרות של מטריצת הרקמה, לבצע קיבעון בתוך 48 שעות לאחר הקציר אלא אם כן הרקמה קפואה ישירות.

2. הכנת מדגם

1. להפשיר את הרקמה הקפואה בטמפרטורת החדר. לעבד את הרקמה ברגע שאין קרח גבישים ניתן להרגיש יותר על דחיסה עדינה דיגיטלית של הרקמה.
   הערה: לבצע את הכנת הרקמה ב- DMEM בצלחת פטרי.
2. זהה את מקור רקמת ההVD האנושית (אנולוס פיברווס, אזור ביניים, גרעין פולפוס או לוחית קצה סחוס) בהתבסס על תכונות מקרוסקופיות כגון צפיפות קולגן וכיוון.
3. קח את קטע התנועה המורכב מדיסק IVD בקר עם שתי החוליות הסמוכות שלו וניתח את הדיסק בכללותו מהעצם התת-שכונתית באמצעות להב כירורגי (להב מספר 15).
   1. השתמש בשני מלקחיים אנטומיים כדי להפוך את הדיסק כדי להגיע לאזורים מרוכזים יותר. בצע את הניתוח. ודא לectect את גרעין pulposus האחרון כפי שהוא הרבה יותר רזה מאשר אנולוס, נוטה לקרוע, וזה לא יורד בצורה מוגדרת בקלות.
   2. זהה את האזורים השונים של הסחוס.
   3. לגזור את שטח העניין מן הדיסק כולו באמצעות להב כירורגי (להב מספר 20 או 22). לחלופין, השתמש בלהב קריוטום.
      הערה: כאשר דיסקי בקר מגיעים כחלק מעמוד השדרה, ניתן להכין את הדיסקים ב- toto. זה עושה זיהוי נכון של סוגים שונים של סחוס הרבה יותר קל. בעת ניתוח הדיסק בצורה המתוארת לעיל, לוחית הקצה הקרטלגינית נשארת על החוליות. אם אזור זה ייחקר, עדיף להוריד אותו מהעצם הבסיסית עם אזמל עובד בכיוון משיק מעט כפוף.
4. במקרה שהעוברים הם באורך כתר-ישבן של קטן מ -20 ס"מ, הקפד לעבד את העוברים טוטו כדי לשמר את ארכיטקטורת הרקמה של IVD. אין לבצע כל ניתוח של החוליות במקרים אלה.
5. לאחר שהדיסק נפלט בטוטו, זהה את האזורים השונים של הסחוס.
   1. בצע את ההסתיידות בחומצה אתילנדימינטראטראצטית (EDTA) (20% (w/v); pH = 7.4) בטמפרטורת החדר. בחר את הנפח בהתאם לגודל המדגם - הרקמה כולה חייבת להיות מכוסה היטב עם EDTA.
   2. לשנות את פתרון decalcification מדי יום אשר יכול להימשך עד 5 ימים בהתאם לגודל של הרקמה.
   3. ודא כי ההסתיידות מוצלחת עם מחט 20 מד שחודרת לחוליות ללא התנגדות בולטת.
      הערה: השינוי היומי של פתרון הסרת הסתיידות חשוב כדי למנוע קלסר כלאט EDTA מרוויה כדי לשמור על אפקטיות התגובה. זה גם מונע קולוניזציה חיידקית.

3. דירוג גיל המדגם, שלמות והתנוונות

1. לסווג את רקמת הדיסק האנושית לאחת מחמש הקטגוריות הבאות בעזרת מידע קליני, כמו גם הדמיית רנטגן ותהודה מגנטית¹⁸ (איור 3).
   הערה: קטגוריה I: כדי לשמש מדגם כמעט בריא להשתמש אנולוס ללא כל סימן רדיולוגי של ניוון IVD נגזר טראומה עמוד השדרה חריפה.
   קטגוריה II: כדי להמחיש מצב של דלקת חריפה עם תחילת ניוון להשתמש ברקמה מאזור הביניים מחולים עם תסמינים קליניים עם משך של פחות מ 4 שבועות.
   קטגוריה III: כדי לתאר מצב שבו התגובה הדלקתית כבר היה זמן להשפיע על הרקמה והתאים לקחת רקמה מחולים אשר נותחו עבור צניחה גרעינית אבל עם משך סימפטום העולה על 4 שבועות.
   קטגוריה 4: עבור ניוון דיסק מתון בחר אנולוס שהתקבל מניתוח עם היתוך בין גוף למחלת דיסק ניוונית עם ציון Pfirrmann של 3 או 4 בהדמיית תהודה מגנטית¹⁹.
   קטגוריה V: עבור תהליך ניוון בשלב הסופי אנולוס שהתקבל מניתוח עם היתוך בין גוף למחלת דיסק ניוונית עם ציון Pfirrmann של 5.
2. לסווג את רקמת בקר בהתבסס על השלב ההתפתחותי / גיל של החיה לאחת משמונה הקטגוריות, כפי שמוצג בטבלה 1.
   1. חשב את גיל ההיריון על אורך כתר-ישבן של העוברים בהתבסס על הנוסחה המוצעת על ידי קלר:
      גיל ההיריון בחודשים =
      הערה: בעלי חיים ב 4 השבועות הראשונים של ההריון נוכחים עם אורך כתר-ישבן של 0.8-2.2 ס"מ²⁰.

4. קיבוע רקמות

1. לקבע את הדגימות ב 10x את נפח המדגם של 4% (w /v) פורמלדהיד פתרון תמיסת פוספט חוצץ (PBS) במהלך הלילה ב 4 °C (50 °F).
   הערה: תמיסת פורמלדהיד חודרת לרקמה בקצב של כ-1 מ"מ לשעה מכל כיוון. עבור דגימות קטנות מאוד או גדולות מאוד ניתן יהיה צורך בהתאמת זמן החשיפה.
2. לאחסן את הרקמה PBS ב 4 °C (7 °F) עד עיבוד נוסף.

5. חתך היסטולוגי

1. הטמע את הדגימות במדיום הטבעה מסיס במים על ידית הקריוטום.
   1. מניחים את הרקמה על הידית כך שנוצר מישור צירי או מטוס שחותך את סוג הקולגן אני lamellae בניצב (למשל, מישור חתך קשתי חציוני).
      הערה: הרקמה צריכה להיות מכוסה במלואה על ידי המדיום המטביע.
2. חלק את הרקמה המוטמעת בעובי של 70 מיקרומטר בדגימות אנושיות ו 40 מיקרומטר בדגימות בקר באמצעות קריוטום סטנדרטי.
   הערה: ההבדל בעובי המקטע נובע מההבדל בשלמות הרקמה בין דיסק בקר שלם לבין הרקמה האנושית המנוונת ביותר.
3. אסוף את המקטעים במגלשת זכוכית.
   1. תקיף את מקטעי הרקמה בעט הידרופובי.
   2. יש לשטוף את המקטעים 3 פעמים עם תמיסת מלח עם פוספט (PBS) כדי להסיר את מדיום ההטבעה המסיס במים.

6. כתמי פלואורסצנטיות

1. הוסף 60 μL של 1% (v/v) של DAPI (Exmax 358 ננומטר, Emmax 461 ננומטר) כמו גם 1% (v/v) של מכתמים מעקב Actin (Exmax 540 ננומטר, Emmax 565 ננומטר) ב PBS ודגרה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: פרוטוקול הכתמים המתואר כאן הוא לדמיין את הגרעין באמצעות כתמים גרעיניים DAPI (כחול) ואת הציטופלסמה באמצעות כתם מעקב Actin (אדום). IVD יש autofluorescence חזק בשל סיבי הקולגן בערוץ הירוק. כמות הנוזל שנוספה לסעיפים בפרוטוקול זה מיועדת לחלקים בגודל של כ-5 מ"מ x 5 מ"מ. עבור מקטעים גדולים יותר, יש להגדיל סכום זה בהתאם. בצעו את כל העבודות בחדרים ללא חשיפה ישירה לאור שמש ועם אורות מעומעמים כדי למנוע את ההלבנה של הצבע.
2. הסר את נוזל הכתמים עם pipette ולשטוף שלוש פעמים עם 60 μL של PBS בכל פעם.
3. מוסיפים מדיום הרכבה מתאים ומכסים את המקטעים בתלוש כיסוי.
   הערה: ודא שאין בועות אוויר לכודות בעת הוספת שובר הכיסוי. זה נעשה בצורה הטובה ביותר על ידי התחלת מגע של להחליק עם השקופית על שפת אחת ולאחר מכן לתת להחליק לרדת לאט.

7. הדמיה ועיבוד מיקרוסקופיים

1. הנח שקופית עם מקטע מוכתם על מחזיק הדגימה של המיקרוסקופ.
   הערה: בשל רשת הקולגן הצפופה I של ה- IVD, האור המפוזר מקשה על הרקמה לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית. אחת ה דרך לטפל בבעיה זו היא לבצע חתך אופטי באמצעות תאורה מובנית. זה גם מאפשר לעבד הקרנה תלת ממדית של הדגימה כולה בשני הערוצים (כחול ואדום). מומלץ לעשות זאת באמצעות הגדרת התאורה המובנית ומצב הפסיפס עם עדשת יעד הגדלה פי 10 כדי לקבל סקירה כללית של המדגם, כמו גם שחזורים תלת-ממדיים של דפוסים בודדים.
2. הפעל את התקן התאורה המובנה.
   1. בצע הדמיה שדה ראייה יחיד עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים, מסנני פלואורסצנטיות ותאורה נאותה.
      הערה: התאם את זמן החשיפה עבור כל המסננים המשמשים כדי לתקנן את רכישת ההדמיה. כדי לקבל ייצוג מדויק של הדגימה בתמונה ברזולוציה גבוהה יותר, המקטעים עם הגדלה גבוהה יותר (למשל, המטרה 20x).
   2. לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
3. כדי לדמיין את המקטע בכללותו השתמש בטכניקת הדמיית הפסיפס
   1. פתח את הגדרות הרכישה (לחץ על 6D- Acquisition) מלוח סרגל הכלים.
   2. התאם את הגדרות הפסיפס (באוגר MosaiX) והגדר את מספר העמודות והשורות של תמונות שדה-מבט שמאוחר יותר ימוזגו לתמונת מבט כולל אחת.
   3. הקש Setup והתאם את תיקון המוקד של אריחים בודדים.
      הערה: זה כמעט בלתי אפשרי עבור סעיף רקמות גדול יש את כל פני השטח רקמה במישור מיקוד אחד. אריחי תמונה ברמות מוקד שונות ניתן לקחת על ידי 'רכישת MosaiX'.
   4. כדי להתחיל ברכישת אריחי התמונה, הקש התחל.
   5. תפר את האריחים בתמונה באמצעות פונקציית התפירה (לחצןתפירה) עם חפיפה של 20% המשולבת בתוכנה.
   6. לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
4. כדי לנתח את ארגון chondrocyte המרחבי, השתמש בפונקציה 3D המשולבת בתוכנה.
   1. התאם את הגדרות מחסנית z. הגדר את פרמטרי הסריקה: הגדר את מיקומי ההתחלה וההפסקה בציר z ואת מרחק הפרוסה על-ידי הפעלת לחצן התחל/עצור.
      הערה: התוכנה מחשבת באופן אוטומטי את מספר הפרוסות.
   2. כדי להתחיל ברכישת ערימות z של התמונה, הקש התחל.
   3. לאחר עיבוד התמונות על-ידי מיטוב העוצמה והבהירות באמצעות תוכנת אופטימיזציה של תמונה התואמת למיקרוסקופ הפלואורסצנטיות.
5. יצא את התמונות בתבנית קובץ התואמת לתוכנת עיבוד התמונה.
   הערה: ייצאו את השחזורים בתלת-ממד כתמונות בודדות או /ו כמודל תלת-ממדי אינטראקטיבי או בתבנית וידאו.

8. זיהוי דפוס תאי והערכה של צפיפות

1. פתח את תמונות הפסיפס המיוצאות של מקטע הרקמה כולו בתוכנית עיבוד תמונה מתאימה.
2. הגדר את האזורים הכפופים להערכת צפיפות תאים על-ידי הגדרת אזורים בעלי עניין של 500 מיקרומטר x 500 מיקרומטר בתמונות.
   הערה: כל האריחים שאין להם איכות תמונה נאותה אינם נכללים בניתוח.
3. זהה דפוסים תאיים בודדים.
   הערה: תאים בודדים מוגדרים כתאים בודדים - אנקפסולציה מלאה בתוך המטריצה הסמוכה. זוגות מוגדרים כשני תאים סמוכים בסמיכות (<25 מיקרומטר) לפיהם התאים מחוברים דרך המטריצה שלהם (ראו איור 2). תצורות מחרוזת הן לפחות שלושה כונדרוציטים מיושרים בשורה (מאמצע הגרעינים <25 מיקרומטר). תאים אלה מוקפים במטריצה שלמה וניתן לראות חיבורי מטריצה בין כל תא. אשכולות מייצגים תאים מרובים הממוקמים בסמיכות ישירה זה לזה (<25 מיקרומטר) והם עטופים בלקונה גדולה נטולת מטריצה.
4. השתמש ביישום Plug-in של ספירת תאים לניתוח הכמותי של התבניות הסלולריות.
   הערה: כתמי הציטופלסמה מייצגים שיטת אימות לזיהוי הדפוסים המרחביים השונים.
5. חשב את צפיפות התאים על-ידי חלוקת התאים שנספרו לפי גודל אזור העניין שנבחר.

Results

באמצעות תמונות פסיפס, ניתן לזהות בבירור את הארכיטקטורה של ה-IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלו באנולו והגרעין הרך יותר(איור 4). במהלך התפתחות עוברית ניתן לראות ירידה מתמשכת בצפיפות התאים (איור 5). בעוד בשלבים המוקדמים של פיתוח IVD ניתן למצוא צפיפות תאים של 11,435 תאים /מ"מ רבוע בסיבי אנולוס בקר ו 17,426 תאים / מ"מ² בגרעין הבעירה פולפוס, מספרים אלה להקטין במהירות ל 1,011 תאים / מ"מ² (פיברו אנולוס בקר) ו 488 תאים / mm² (גרעין בקר פולפוס) עד הלידה. בבקר הבוגר נראים ...

Discussion

באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מוגברת על ידי הדמיית פסיפס וחתך אופטי, הערכנו את הסידור המרחבי של כונדרוציטים באנולוס של IVD המותני לאורך כל הפיתוח, ההתבגרות, ניוון. בעוד רקמות ניווניות ניתן לקצור מחולים שקיבלו ניתוח עמוד השדרה עבור ניוון דיסק, ניתוח של התקופה העוברית ושלב ההתבגרות נדרשו שימוש באורגניזם מודל (בקר). צפיפות תאית גבוהה נרשמו אנולוס במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. במהלך הפיתוח הנוסף, צמיחה לאחר ההבשלה והתבגרות ניתן היה לראות ירידה בולטת בצפיפות התאים. ברקמה האנושית עם ניוון דיסק מתקדם, נוכל לכמת עלייה בצפיפו...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אמפוטריצין B	Merck KGaA,  גרמניה	A2942
שקופיות מיקרוסקופ הידבקות SuperFrost Plus	R. Langenbrinck, גרמניה	03-0060
ApoTome	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה	462000115
AxioVision Rel. 4.8 עם Modul MosaiX	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה
CellMask Actin מעקב אחר כתם	Thermo Fischer Scientific, ארה"ב	A57249
Cryostat	Leica Biosystems, ארה"ב	CM3050S
DAPI	Thermo Fischer Scientific, ארה"ב	D1306
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)	Gibco, Life Technologies, גרמניה	41966052
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית	Sigma-Aldrich, ארה"ב	60004
מיקוסקופ פלואורסצנטי - Axio Observer Z1 עם Axio Cam MR3 ו-Colibri	Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה	3834000604
פורמלדהיד	Merck KGaA,  גרמניה	104002
תמונה J 1.53a, עם תוסף מונה תאים	המכון הלאומי לבריאות (NIH), ארה"
Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin	Thermo Fischer Scientific, ארה"ב	A12380
משקפי כיסוי מיקרוסקופיים	R. Langenbrinck, גרמניה	01-1818/1
PAP Pen חוסם נוזלים	שירותים מדעיים  GmbH, גרמניה	N71310
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	P4333
פוספט חוצץ מלח	סיגמא-אולדריץ', ארה"ב	P5119
אזמל	pf medical AG, גרמניה	2023-01
Tissue-tek O.C.T. Compound	סאקורה פינטק, הולנד	SA6255012