אנו מציגים שיטה לחקור ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס של הדיסק הבין חולייתי בשיטת חתך אופטית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חתך אופטי והדמיה של הדיסק הבין חולייתי מהתפתחות עוברית לניוון
במאמר זה
סיכום
תקציר
ניוון דיסק בין חולייתי (IVD) הוא גורם מוביל לכאבי גב תחתון והוא כרוך במידה גבוהה של פגיעה עבור אנשים מושפעים. כדי לפענח ניוון דיסק ולהיות מסוגל לפתח גישות התחדשות הבנה יסודית של הביולוגיה התאית של IVD הוא חיוני. היבט אחד של ביולוגיה זו שעדיין נותר ללא מענה הוא השאלה כיצד תאים מסודרים מרחבית במצב פיזיולוגי ובמהלך ניוון. המאפיינים הביולוגיים של IVD וזמינותו מקשים על ניתוח רקמה זו. המחקר הנוכחי חוקר ארגון כונדרוציטים מרחבי בסיברווס אנולוס מהתפתחות עוברית מוקדמת ועד ניוון סופני. שיטת חתך אופטית (Apotome) מוחלת כדי לבצע ניתוחי כתמים ברזולוציה גבוהה באמצעות רקמת עובר בקר כמודל בעלי חיים ורקמת דיסק אנושית המתקבלת מחולים שעברו ניתוח בעמוד השדרה. מתוך צפיפות כונדרוציטים גבוהה מאוד בדיסק בקר עוברי מוקדם, מספר התאים פוחת במהלך ההריון, הצמיחה וההתבגרות. בדיסקים אנושיים, עלייה בצפיפות התאים ליוותה את התקדמות ניוון הרקמות. כפי שכבר הוכח בסחוס מפרקי, היווצרות אשכול מייצג תכונה אופיינית של ניוון דיסק מתקדם.
מבוא
הדיסק הבין חולייתי (IVD) הוא מבנה מבוסס סחוס, כי ביוכימית וביחס לארכיטקטורה הסלולר, ממבט ראשון, דומה במובנים רבים הסחוס המפרקי1. ואכן, הן ניוון IVD והן דלקת מפרקים ניוונית (OA) של סחוס מפרקים מאופיינים על ידי צמצום שטח משותף עקב שחיקת סחוס, ציסטה תת-כונדרית היווצרות אוסטאופיפט, וטרשת תת-ביתית2,3. למרות הדמיון לכאורה הזה ארכיטקטורה ותפקיד תפקודי של שתי הרקמות שונים. בעוד המטריצה של סחוס מפרקי נוצרת בעיקר מרשת קולגן מסוג II היוצרת ארקייד, ה- IVD מורכב משלושה סוגים שונים של רקמות: פולפוס הגרעין העשיר בקולגן II במרכז תופס עומסים ציריים ומעביר אותם לטבעת מקיפה של סיבי קולגן עגולים מסוג I צפו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לניתוח התפתחות עוברית והבשלה, נעשה שימוש בדיסקים של בקר. כדי להעריך את ניוון ההפרה ההפרה,דגימות אנושיות נותחו.
רקמת IVD אנושית התקבלה מחולים שעברו ניתוח לניוון דיסק מותני, צניחת דיסק או טראומה בעמוד השדרה במחלקה לכירורגיה אורתופדית, בבית החולים האוניברסיטאי של טיבינגן ובמרכז הטראומה BG Tübingen. אישור מלא של ועדת האתיקה התקבל לפני תחילת המחקר (פרויקט מספר 244/2013BO2). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים לפני ההשתתפות. השיטות בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו.
רקמת בקר התקבלה ממשרד הבריאות והבטיחות במזון של בוואריה/אוברשלהיים וממפעל עיבוד בוורטאוסן (גרמניה). אישור הרשויות המקומיות והווטרינריות התקבל לרקמה מבעלי חיים מתי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות תמונות פסיפס, ניתן לזהות בבירור את הארכיטקטורה של ה-IVD עם רשת סיבי הקולגן הצפופה שלו באנולו והגרעין הרך יותר(איור 4). במהלך התפתחות עוברית ניתן לראות ירידה מתמשכת בצפיפות התאים (איור 5). בעוד בשלבים המוקדמים של פיתוח IVD ניתן למצוא צפיפות תאים של 11,435 תאים /מ"מ רבוע בסיבי אנולוס בקר ו 17,426 תאים / מ"מ² בגרעין הבעירה פולפוס, מספרים אלה להקטין במהירות ל 1,011 תאים / מ"מ² (פיברו אנולוס בקר) ו 488 תאים / mm² (גרעין בקר פולפוס) עד הלידה. בבקר הבוגר נראים .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות מוגברת על ידי הדמיית פסיפס וחתך אופטי, הערכנו את הסידור המרחבי של כונדרוציטים באנולוס של IVD המותני לאורך כל הפיתוח, ההתבגרות, ניוון. בעוד רקמות ניווניות ניתן לקצור מחולים שקיבלו ניתוח עמוד השדרה עבור ניוון דיסק, ניתוח של התקופה העוברית ושלב ההתבגרות נדרשו שימוש באורגניזם מודל (בקר). צפיפות תאית גבוהה נרשמו אנולוס במהלך התפתחות עוברית מוקדמת. במהלך הפיתוח הנוסף, צמיחה לאחר ההבשלה והתבגרות ניתן היה לראות ירידה בולטת בצפיפות התאים. ברקמה האנושית עם ניוון דיסק מתקדם, נוכל לכמת עלייה בצפיפו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
אנו מודים למחברים השותפים שלנו מהפרסומים המקוריים על עזרתם ותמיכתם. אנו מודים לשרלוט אמה במברגר על שעזרה להשיג את תמונות האפוטום.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אמפוטריצין B | Merck KGaA, גרמניה | A2942 | |
| שקופיות מיקרוסקופ הידבקות SuperFrost Plus | R. Langenbrinck, גרמניה | 03-0060 | |
| ApoTome | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה | 462000115 | |
| AxioVision Rel. 4.8 עם Modul MosaiX | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה | ||
| CellMask Actin מעקב אחר כתם | Thermo Fischer Scientific, ארה"ב | A57249 | |
| Cryostat | Leica Biosystems, ארה"ב | CM3050S | |
| DAPI | Thermo Fischer Scientific, ארה"ב | D1306 | |
| מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) | Gibco, Life Technologies, גרמניה | 41966052 | |
| חומצה אתילנדיאמינטטראצטית | Sigma-Aldrich, ארה"ב | 60004 | |
| מיקוסקופ פלואורסצנטי - Axio Observer Z1 עם Axio Cam MR3 ו-Colibri | Carl Zeiss MicroImaging GmbH, גרמניה | 3834000604 | |
| פורמלדהיד | Merck KGaA, גרמניה | 104002 | |
| תמונה J 1.53a, עם תוסף מונה תאים | המכון הלאומי לבריאות (NIH), ארה" | ||
| Invitrogen Alexa Fluor 568 Phalloidin | Thermo Fischer Scientific, ארה"ב | A12380 | |
| משקפי כיסוי מיקרוסקופיים | R. Langenbrinck, גרמניה | 01-1818/1 | |
| PAP Pen חוסם נוזלים | שירותים מדעיים GmbH, גרמניה | N71310 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | P4333 | |
| פוספט חוצץ מלח | סיגמא-אולדריץ', ארה"ב | P5119 | |
| אזמל | pf medical AG, גרמניה | 2023-01 | |
| Tissue-tek O.C.T. Compound | סאקורה פינטק, הולנד | SA6255012 |
מקורות
- Urban, J. P. G., Roberts, S. Degeneration of the intervertebral disc. Arthritis Research and Therapy. 5 (3), 120-130 (2003).
- Gupta, K. B., Duryea, J., Weissman, B. N. Radiographic evaluation of osteoarthritis. Radiologic Clinics of North America. 42 (1), 11-41 (2004....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
