מאמר שיטה

השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

DOI:

10.3791/62618

⸱

3 במאי 2021

1Department of Physiology, David Geffen School of Medicine, University of California Los Angeles

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז 'מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H+ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז', ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H+ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H+ באמצעות ה-IMM.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית1.

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H+ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם "uncoupling המיטוכונדריאלי"1 (איור 1). דליפה זו של H+ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז 'שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום 2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף1. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני1. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.

נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה1. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H+ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H+ מיטוכונדריאלית על פני IMM1, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות 5,6,7.

מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-78. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ'וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר9 ודרוזופילה 9. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום 6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H+ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה6 של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז' בעכבר בשנת 20177. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H+ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד5.

גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H+ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H+ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H+ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H+ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הניסוייים בבעלי חיים שבוצעו תואמים את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (IACUC).

הערה: הליך הבידוד המיטוכונדריאלי מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית ומשתנה מעט מרקמה לרקמה. לדוגמה, מכיוון שרקמת השומן החום עשירה מאוד בשומנים, היא דורשת צעד נוסף כדי להפריד בין פסולת תאים ואברונים לבין שלב השומנים לפני קצירת המיטוכונדריה. כדי למנוע בלבול, שני הליכי הבידוד המיטוכונדריאליים (אחד מהשומן החום והשני מהלב) מפורטים להלן.

1. בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום בין-סקפולרי של עכברים (שונה מ-Bertholet et al. 2020)15

  1. המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
  2. לאחר מיקום העכבר עם בטנו מול השולחן, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער (שונה מ- Mann et al., 2014)16.
  3. בצעו חתך של 2 ס"מ בגב העליון לאחר שתפסו את העור בפינצטה.
  4. הוציאו את השומן הבין-סקפולרי החום של העכבר המתאים לאיבר בעל שתי אונות עם צורת פרפר16.
  5. מעבירים את השומן החום לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ במילוי 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) שהונח בעבר על קרח.
  6. נקו את השומן החום מהשומן הלבן מתחת למשקפת.
  7. מעבירים את השומן החום לכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לחתוך אותו לחתיכות דקות. העברה להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (חומר פלסטי פוליטטראפלואורואתילן (PTFE) מזיקים).
  8. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
  9. צנטריפוגה ההומוגנאט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ב 4 °C ב 15 מ"ל צינור חרוטי קר כקרח. יש להשליך את ה-supernatant המכיל את שלב השומנים.
  10. החיזרו את הכדור ב-5 מ"ל של חיץ בידוד קר כקרח (טבלה 1) והומוגניזציה, בפעם השנייה, את ההשעיה על הקרח עם שש משיכות איטיות במהירות של 275 סיבוב לדקה.
  11. מעבירים את ההומוגנאט בצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לכדור את כל הגרעינים והתאים הלא שבורים.
  12. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
  13. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
  14. גלולת Resuspend המכילה מיטוכונדריה ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) ומדגירה את התרחיף המיטוכונדריה על קרח למשך 10-15 דקות.

2. בידוד מיטוכונדריאלי מלב העכבר (שונה מ- Garg et al. 2019)17

  1. המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO2 ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
  2. לאחר הצבת העכבר על גבו, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של 2 ס"מ על בית החזה לאחר אחיזת העור בפינצטה.
  3. נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם בכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת הבידוד הקר (טבלה 1).
  4. לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס נוספת של 10 מ"ל המכילה 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לקצוץ אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבר להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (הדברת PTFE).
  5. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
  6. מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לגרעיני כדוריות ולתאים לא שבורים.
  7. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
  8. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
  9. בצעו שימוש חוזר בכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) והדגירו את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10-15 דקות.

3. הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של ה- OMM.

הערה: הליך העיתונות הצרפתית מאפשר לשחרר את ה-IMM מה-OMM כאשר שלמותו נשמרת, כולל המטריצה וה-crista (איור 2)18. המיטוכונדריה מודגרת מראש במאגר היפרטוני-מניטול (טבלה 2) ונתונה ללחץ נמוך יותר במהלך הליך העיתונות הצרפתית כדי למנוע כל מתיחה דרסטית של ה-IMM כאשר ה-OMM נקרע.

  1. מלאו את תרחיף המיטוכונדריה-היפרטוני-מניטול לתוך תא לחץ מיני מקורר (קוטר בוכנה 3/8 אינץ') של העיתונות הצרפתית (איור 3A).
  2. בחר את מצב Medium של העיתונות הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ המיני ב-110 בחוגה של העיתונות הצרפתית עבור המיטוכונדריה של השומן החום וב-140 עבור המיטוכונדריה של הלב (כ-2,000 psi).  ודאו שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כ-1 טיפה לשנייה.
  3. אסוף את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את המתלים ב 10,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
  5. בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5-2 מ"ל של חיץ היפרטוני-KCl קר כקרח (טבלה 3) ואחסנו את ההשעיה על קרח.
    הערה: שומן חום ומיטופלסטים של לב מוכנים להקלטות מהדקי טלאים וצריכים להישאר שמישים במשך כ-3-6 שעות.

4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של דליפת H+ דרך UCP1 ו-AAC 5,7,15

הערה: השתמש במערך האלקטרופיזיולוגי הבא (איור 3B): מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (DIC), 60x מטרת טבילת מים, טבלת בידוד רטט וכלוב פאראדיי, מגבר סטנדרטי התומך בהקלטות רעש נמוך, דיגיטציה סטנדרטית המשמשת להתקנה אלקטרופיזיולוגית, pClamp 10, מיקרומניפולטור, אלקטרודת ייחוס אמבטיה (3 M KCl-agar גשר מלח שהוכנס בתוך מחזיק מיקרואלקטרודה המכיל כדור כלוריד כסוף/כסוף מעוצב לתוך גוף המחזיק (המתואר ב- Liu et al. 2021)19, תא פרפוזיה עם תחתית כיסוי זכוכית 0.13 מ"מ, המחובר למערכת פרפוזיה הניזונה מכוח הכבידה.

  1. משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט. הגדר תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של שכפול20.
    הערה: תכנון תוכנית זה דורש מספר ניסיונות להשיג פיפטות המותאמות למהדק התיקון של IMM. לפיפטה סטנדרטית יש קצוות עדינים עם צורה חרוטית מתקדמת.
  2. הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.
  3. התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך.
  4. מקמו את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והניחו את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי ללטש אותו.
  5. לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.
  6. פיפטות פולניות עם התנגדות בין 25 ל-35 MΩ מתקבלות כאשר הן מתמלאות בתמיסת פיפטה מבוססת TMA (TMA עבור טטרה-מתילמוניום הידרוקסיד, טבלה 4).
  7. קדם-דגירה של כיסויים (קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ) עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסט ולשטוף אותם בתמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט.
  8. מכינים דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 μL של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) ומניחים אותה על כיסויים שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת 4 בארות.
  9. דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור מיטופלסטים למשקעים על הכיסוי.
  10. מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5).
  11. העבר כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף.
  12. מסדרים את הכיסוי בתחתית החדר. אין להחדיר את החדר כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על הכיסוי.
  13. בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק בצורת 8 על ידי סריקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60.
  14. טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה (כ-50 μL) והניחו אותה במחזיק הפיפטה.
  15. הביאו את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור והתקרבו אליה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM. תוכנית המגבר נותנת את ההתנגדות של הפיפטה ברגע שהיא בתמיסת האמבטיה. החזק את פוטנציאל הממברנה ב- 0 mV והחיל פולסים של 10 mV באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר.
  16. הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM (איור 2B).
  17. הגבירו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף הפיפטה במהלך הניסוי.
  18. הפיצו את חולפי הקיבולים המשוטטים באמצעות הפקודה "בדיקת ממברנה" בתוכנית המגבר לפני בדיקת תצורת המיטופלסט כולו כדי לקבל מדידת קיבוליות (Cm) נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה.
  19. החל פולסים של מתח קצר-טווח (5-15 אלפיות השנייה) (250-600 mV) עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את תיקון הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטופלסט השלמה (איור 2C). פריצה מוצלחת משתקפת על ידי הופעתם המחודשת של ארעי הקיבול.
  20. לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה (המשקפת את גודל המיטופלסט) ואת התנגדות הגישה שלו Ra (המשקפת את איכות תצורת המיטופלסט השלם). לאחר הפריצה, Ra צריך להיות בין 40 ל 80 MΩ. למיטופלסטים (בגודל 2-6 מיקרומטר) המשמשים לניסויים בהידוק טלאי יש בדרך כלל קיבוליות ממברנה של 0.5-1.1 pF.
  21. מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) בתמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) על ידי הפעלת הזלוף.
  22. החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה שתוכנן עם תוכנית המגבר, החל מ-160 mV- ועד +100 mV עם מרווח של 5 שניות, תוך החזקת המיטופלסט ב-0 mV. פרוטוקול זה עובד עבור מחקרי UCP1 6,7,15 ו-AAC5 (איור 4 ואיור 5).
    הערה: מומלץ למדידות זרם H+ תלויות UCP1 ו-AAC לרכוש את כל הנתונים האלקטרופיזיולוגיים ב-10 קילוהרץ ולסנן ב-1 קילוהרץ באמצעות תוכנה מתאימה המניעה את המגבר והדיגיטציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח מתודולוגיית הידוק התיקון המיושמת על המיטוכונדריה סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H+ דרך ה-IMM והמובילים המיטוכונדריים, UCP1 ו-AAC, האחראים לכך. הניתוח האלקטרופיזיולוגי של דליפות H+ תלויות UCP1 ו-AAC יכול לספק מבט ראשון על היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה. סעיף התוצאות מתאר את ההליכים הסטנדרטיים למדידת דליפת H+ באמצעות UCP1 ו-AAC.

מדידת זרם H+ תלוית UCP1 (איור 4)6,7,15

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H+ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנתח דליפת H+ ומוליכות אחרות של ה-IMM במודלים סטנדרטיים שונים של בני אדם ותאים כגון תאי HAP1, COS7, C2C12 ו-MEF. עם זאת, כל בידוד מיטוכונדריאלי דורש כמה התאמות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחבר מצהיר שאין אינטרסים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אני מודה לד"ר יורי קיריצ'וק על המדע הגדול שהייתי חלק ממנו במעבדתו ולחברי מעבדת קיריצ'וק על הדיונים המועילים. אני מודה גם לד"ר דאגלס ס. וואלאס על שסיפק עכברי נוקאאוט AAC1 . מימון: A.M.B נתמך על ידי פרס פיתוח קריירה של איגוד הלב האמריקאי 19CDA34630062.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1% ג'לטיןMilliporeES-006-B
60X טבילה במים מטרה, צמצם מספרי 1.20מגבר אולימפוסUPLSAPO60XW
Axopatch 200Bמולקולריים
נימי זכוכית בורוסיליקטמכשירי סאטרBF150-86-10
Digidata 1550B Digitizerמולקולריים
כלוב פאראדייתוצרת בית
עיתונות צרפתיתגלן מילס5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 מעבדה מערבל
מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX71 או IX73
מיקרו פורג(Narishige)MF-830
Micromanupulator MPC-385Sutter מכשיריםFG-MPC325
מחזיק מיקרואלקטרודה לגשר אגרמכשירי דיוק עולמייםMEH3F4515
חולץ מיקרופיפטה(Sutter Instruments)P97
מיני תא לעיתונות צרפתיתגלן מילס5500-FA-004
מיקסר IKA 6-2000RPMקול פארמרEW-50705-50
אובייקטיבי 100X הגדלהNikon  עדשהMPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10מולקולריים
תא זלוףWarner InstrumentsRC-24E
Potter-Elvehjem הומוגנייזר 10 מ"לWheaton358039
צנטריפוגה מקוררת SORVALL X4R PRO-MDThermo Scientific75 009 521
כיסויי זכוכית עגולים קטנים: קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מWarner Instruments640700
שולחן בידוד רעידותניופורטVIS3036-SG2-325A
<חזק>כימיקלים
D-חומצה גלוקוניתסיגמא אולדריץ'G1951
D-מניטול  סיגמא אולדריץ'M4125
EGTA  סיגמא אולדריץ'3777
HEPES  סיגמא אולדריץ'H7523
KCl  סיגמא אולדריץ'60128
MgCl2  סיגמא אולדריץ'63068
סוכרוז  סיגמא אולדריץ'S7903
TMA  סיגמא אולדריץ'331635
TrisBase  סיגמא אולדריץ'T1503
TrisCl  סיגמא אולדריץ'T3253
התקנים מכשירים תקורה' מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Divakaruni, A. S., Brand, M. D. The regulation and physiology of mitochondrial proton leak. Physiology (Bethesda). 26 (3), 192-205 (2011).
  2. Chouchani, E. T., Kazak, L., Spiegelman, B. M. New advances in adaptive thermogenesis: UCP1 and beyond. Cell Metabolism. 29 (1), 27-37 (2019).
  3. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
  4. Nicholls, D. G. The hunt for the molecular mechanism of brown fat thermogenesis. Biochimie. 134, 9-18 (2017).
  5. Bertholet, A. M., et al. H(+) transport is an integral function of the mitochondrial ADP/ATP carrier. Nature. 571 (7766), 515-520 (2019).
  6. Fedorenko, A., Lishko, P. V., Kirichok, Y. Mechanism of fatty-acid-dependent UCP1 uncoupling in brown fat mitochondria. Cell. 151 (2), 400-413 (2012).
  7. Bertholet, A. M., et al. Mitochondrial patch clamp of beige adipocytes reveals UCP1-positive and UCP1-negative cells both exhibiting futile creatine cycling. Cell Metabolism. 25 (4), 811-822 (2017).
  8. Kirichok, Y., Krapivinsky, G., Clapham, D. E. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature. 427 (6972), 360-364 (2004).
  9. Fieni, F., Lee, S. B., Jan, Y. N., Kirichok, Y. Activity of the mitochondrial calcium uniporter varies greatly between tissues. Nature Communications. 3, 1317(2012).
  10. Chaudhuri, D., Sancak, Y., Mootha, V. K., Clapham, D. E. MCU encodes the pore conducting mitochondrial calcium currents. eLife. 2, 00704(2013).
  11. Vais, H., Payne, R., Paudel, U., Li, C., Foskett, J. K. Coupled transmembrane mechanisms control MCU-mediated mitochondrial Ca(2+) uptake. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (35), 21731-21739 (2020).
  12. Vais, H., et al. EMRE is a matrix Ca(2+) sensor that governs gatekeeping of the mitochondrial Ca(2+) uniporter. Cell Reports. 14 (3), 403-410 (2016).
  13. Vais, H., et al. MCUR1, CCDC90A, is a regulator of the mitochondrial calcium uniporter. Cell Metabolism. 22 (4), 533-535 (2015).
  14. Kamer, K. J., et al. MICU1 imparts the mitochondrial uniporter with the ability to discriminate between Ca(2+) and Mn(2+). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 7960-7969 (2018).
  15. Bertholet, A. M., Kirichok, Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial H(+) leak in brown and beige fat. Frontiers in Physiology. 11, 326(2020).
  16. Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52174(2014).
  17. Garg, V., Kirichok, Y. Y. Patch-clamp analysis of the mitochondrial calcium uniporter. Methods in Molecular Biology. 1925, 75-86 (2019).
  18. Decker, G. L., Greenawalt, J. W. Ultrastructural and biochemical studies of mitoplasts and outer membranes derived from French-pressed mitochondria. Advances in mitochondrial subfractionation. Journal of Ultrastructure Research. 59 (1), 44-56 (1977).
  19. Liu, B., et al. Recording electrical currents across the plasma membrane of mammalian sperm cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), (2021).
  20. Flaming, D. G., Brown, K. T. Micropipette puller design: form of the heating filament and effects of filament width on tip length and diameter. Journal of Neuroscience Methods. 6 (1-2), 91-102 (1982).
  21. Klingenberg, M. The ADP and ATP transport in mitochondria and its carrier. Biochimica and Biophysica Acta. 1778 (10), 1978-2021 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

1ADP ATP

מאמרים קשורים