הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים

1.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62649

⸱

25 באוגוסט 2021

 , 
1Department of Sensory Trauma, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston, 2Engineering Processes and Product Development Group, United States Army Institute of Surgical Research, Fort Sam Houston

במאמר זה

סיכום

פציעות עיניים גלובוס פתוח עלולות ללכת מטופל במשך ימים מרובים בתרחישים כפריים או צבאיים רלוונטיים, וכתוצאה מכך עיוורון. טיפולים נדרשים כדי למזער את אובדן הראייה. כאן, אנו מפרטים מודל פציעה גלובוס פתוח תרבות איברים. עם מודל זה, טיפולים פוטנציאליים לייצוב פציעות אלה ניתן להעריך כראוי.

תקציר

לפציעות גלובוס פתוח יש תוצאות ראייתיות גרועות, ולעתים קרובות גורמות לאובדן ראייה קבוע. זאת, בין היתר, בשל עיכוב ממושך בין פציעה להתערבות רפואית בסביבות כפריות וביישומים לרפואה צבאית שבהם הטיפול ברופאים לא זמין. פציעות לא מטופלות רגישות לזיהום לאחר שהעין איבדה את החותם האטום במים שלה, כמו גם אובדן הכדאיות של הרקמה עקב תת לחץ דם תוך עיני. טיפולים לאטום באופן זמני פציעות גלובוס פתוח, אם מפותח כראוי, עשוי להיות מסוגל לשחזר את הלחץ התוך עיני ולמנוע זיהום עד טיפול עיניים נאות אפשרי. כדי להקל על פיתוח המוצר, מפורט כאן הוא השימוש של תרבות איברים פלח חיצוני פלטפורמת פגיעה גלובוס פתוח למעקב אחר ביצועים טיפוליים לפחות 72 שעות לאחר פציעה. רקמת מקטע חזירית ניתן לשמור על מנות תרבות איברים מעוצבות בהתאמה אישית ומוחזקת בלחץ תוך עיני פיזיולוגי. פציעות דקירה ניתן ליצור עם מערכת פנאומטית מסוגל לייצר גדלי פציעה עד 4.5 מ"מ קוטר, בדומה לגדלי פגיעה רלוונטיים לצבא. אובדן לחץ תוך עיני ניתן לראות עבור 72 שעות לאחר פציעה המאשר אינדוקציה פציעה נכונה ואובדן החותם אטום למים של העין. ביצועים טיפוליים ניתן לעקוב אחר ידי יישום לעין לאחר אינדוקציה פציעה ולאחר מכן מעקב אחר לחץ תוך עיני במשך מספר ימים. יתר על כן, מודל פגיעה במגזר קרום הלב החל על שיטות בשימוש נרחב עבור פיזיולוגיה מגזרי ריצה פונקציונלית וביולוגית, כגון הערכת שקיפות, מכניקת עיניים, בריאות אפיתל הקרנית, ואת הכדאיות רקמות. בסך הכל, השיטה המתוארת כאן היא צעד הכרחי לקראת פיתוח טיפולי ביו-חומרים לאיטום זמני של פציעות גלובוס פתוח כאשר טיפול עיניים אינו זמין.

מבוא

פציעות גלובוס פתוח (OG) עלולות לגרום לאובדן ראייה קבוע כאשר לא מטופלים או לפחות התייצבו בעקבותפציעה 1. עיכובים, לעומת זאת, נפוצים באזורים מרוחקים שבהם הגישה להתערבות עיניים אינה זמינה, כגון באזורים כפריים או בשדה הקרב בתרחישים צבאיים. כאשר הטיפול אינו זמין, הסטנדרט הנוכחי של טיפול הוא להגן על העין עם מגן נוקשה עד התערבות רפואית אפשרית. ברפואה הצבאית, עיכוב זה הוא כרגע עד 24 שעות, אבל זה צפוי להגדיל עד 72 שעות בפעולות לחימה עתידיות בסביבות עירוניות שבו פינוי אוויר אינו אפשרי2,3,4. עיכובים אלה יכולים להיות ארוכים עוד יותר ביישומים אזרחיים כפריים ומרוחקים שבהם הגישה להתערבות עיניים מוגבלת5,6. פגיעת OG לא מטופלת רגישה מאוד לזיהום ואובדן לחץ תוך עיני (IOP) בשל החותם האטום במים של העין שנפרץ7,8. אובדן IOP יכול להשפיע על הכדאיות של הרקמה, מה שהופך כל התערבות רפואית לא סביר לשחזר את הראייה אם העיכוב בין פציעה וטיפול הוא ארוך מדי9.

כדי לאפשר פיתוח של טיפולים קלים ליישום לאיטום פציעות OG עד שניתן להגיע למומחה עיניים, פותח בעבר מודל פגיעה OG benchtop10,11. עם מודל זה, פציעות במהירות גבוהה נוצרו בעיני חזירים שלמים בעוד IOP נתפס על ידי מתמרי לחץ. לאחר מכן ניתן ליישם טיפולים כדי להעריך את יכולתם לאטום את אתר הפציעהOG 12. עם זאת, כמו מודל זה משתמש בעיני חזיר מלא, זה יכול רק להעריך ביצועים טיפוליים מיידיים ללא דרך לעקוב אחר ביצועים לטווח ארוך על פני החלון האפשרי 72 שעות שבו הטיפול חייב לייצב את אתר הפציעה עד המטופל מגיע לטיפול מיוחד. כתוצאה מכך, פותח מודל פגיעה במגזרזרזר אחד (ASOC) OG ופורט בפרוטוקול זה כפלטפורמה למעקב אחר ביצועים טיפוליים ארוכי טווח13.

ASOC היא טכניקה בשימוש נרחב לשמירה על רקמת כלי דם של החלק הימני, כגון הקרנית, במשך שבועות מרובים לאחר enucleation14,15,16,17. המקטע החיצוני נשמר תחת IOP פיזיולוגי על ידי זלוף נוזלים בקצבי זרימה פיזיולוגיים ושמירה על אזור זרימת העבודה הטראבולרית, הרקמה האחראית על ויסות IOP, במהלך הגדרת ASOC18,19. פלטפורמת ASOC יכולה לשמור על רקמות פיזיולוגיות, לגרום לפגיעת OG באמצעות מכשיר המופעל על ידי פנאומטי, ליישם טיפול, ולעקוב אחר ייצוב פציעה לפחות 72 שעות לאחרפציעה 13.

כאן, הפרוטוקול מספק מתודולוגיה שלב אחר שלב לשימוש בפלטפורמת ASOC. ראשית הוא מפרט כיצד להגדיר ולזיוף את פלטפורמת ASOC. לאחר מכן, הפרוטוקול מפרט כיצד לנתח באופן אספטי את המקטע הימני ולשמור על רשת המיזוג הטראבקולרית, ואחריה הגדרת רקמת מקטעים ימנית במנות תרבות איברים שנבנו בהתאמה אישית. לאחר מכן, הוא מפרט כיצד ליצור פציעות גלובוס פתוח וליישם טיפולי מיד לאחר הפציעה. לבסוף, הפרוטוקול מספק סקירה על פרמטרי אפיון המאפשרים לשימוש בשיטה זו המעריכה תכונות תפקודיות, מכניות וביולוגיות של העין וכמה טוב הפגיעה התייצבה. בסך הכל, מודל זה מספק פלטפורמה נחוצה להאצת פיתוח המוצר לייצוב וטיפול בפציעות גלובוס פתוח ולשיפור הפרוגנוזה לקויה של הראייה בעקבות פציעה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

לפני ביצוע פרוטוקול זה, שים לב כי קיימות דרישות משפטיות ואתיות לשימוש בבעלי חיים במחקר ובהכשרה. אם בעלי חיים משמשים למקור של רקמת העין, בקש אישור על ידי הרשות האתית או המשפטית המקומית (IACUC או ועדת האתיקה וכו ') לפני תחילת. אם יש שאלה בקבלת אישור לשימוש בבעלי חיים, אל תמשיך. קבענו בעבר ודיווחנו כי עיני חזיר טריות שהושגו ושימשו בתוך 24 שעות לאחר המוות בהשוואה לפיזיולוגיה של ויוו והסתדרו היטב עבור מחקרים אלה (טכנולוגיות בעלי חיים, טיילר, TX, ארה"ב)10,13. לא נעשה שימוש בבעלי חיים לאורך פרוטוקול זה, באמצעות ספק רקמות כדי להשיג רקמה בתוך 24 שעות.

הערה: לפני הגעת הרקמה, לפברק את מנות תרבית האיברים(פרוטוקול משלים 1),טבעות הידוק(פרוטוקול משלים 1),דוכני צלחת(פרוטוקול משלים 1),הגדרת איסוף נתונים מתמר לחץ (פרוטוקול משלים 2),ופלטפורמת ניקוב פנאומטית(פרוטוקול משלים 3). מחטאים את הכלים, הכלים והאספקה ומכינים את אזורי העבודה. זה שימושי יש אזור לא סטרילי לבצע ניתוח ברוטו על העיניים, כפי שהם בדרך כלל מגיעים עם חיבור, רקמת מסלולית נוספת מחובר. בצע את השלבים הראשונים האלה על משטח עבודה פתוח ונקי, ולאחר מכן העבר את העיניים באופן הפוך לארון BSC II עבור מיקרו-ניתוח (ארון #1). באופן אופטימלי, ארון BSC II המשמש למיקרו-דיסקציה מופרד מארון הרכבת המנה BSC II (ארון #2) כדי למזער את זרימת האוויר ולמקסם את סביבת העבודה. הגדירו את ארון הניתוחים הזעירה עם מיקרוסקופ ניתוח ודרך לדמיין את משטח העבודה (מצלמה או שעונים בולטים מהארון).

1. שלבי עיקור, אספקה (ראו טבלת חומרים לפרטים נוספים) והגדרה

  1. הכן ועקר בגז את הפריטים הבאים (ערכה אחת לכל עין): צלחת ASOC, טבעת הידוק, שני מחברים נוזליים עם טבעות O, שתי רכזות מחט 18 גרם, ארבעה ברגים, שני אורכים של צינורות PE-100 (אורך המרחק צריך להיות ארוך מספיק כדי להאריך מהצלחת בתוך החממה למשאבת המזרק ומערך איסוף נתוני מתמר לחץ), שני רכזות מחט מכופפות 18 G 90°, שני שסתומים תלת-כיווניים.
  2. הכן וערוך אוטומטית את הערכות הבאות.
    1. הכן וחתוך אוטומטית את ערכת מכשירי המיקרו-ניתוח, המכילה זוג אחד של מלקחיים עדינים, זוג מספריים אחד של ואנס, זוג אחד של מלקחיים בעלי שיניים בינוניות, זוג מספריים גדולים, צמר גפן, וסכין גילוח או אזמל.
    2. הכן וכלול אוטומטית את ערכת כלי ההרכבה, המכילה זוג אחד של מלקחיים בעלי שיניים בינוניות, זוג מספריים כירורגיים אחד ומפתח L אחד.
    3. הכן וצמצם אוטומטית את הערכה היומית (כמות: אחד ליום של תרבות), המכילה מפתח L אחד להדק טבעות הידוק למנות בכל יום לפי הצורך.
    4. יש לאחסן אוטומטית ארבעה מכלי 100 מ"ל לחיטוי ולאחסון עיניים ומקטעים קהוריים.
    5. תציב אוטומטית את אובייקטי הנקב.
  3. לאסוף את הפריטים הסטריליים הבאים: צלחת פטרי (1 צלחת / עין), גזה (1-2 / עין), עמדת צלחת, 20 מזרקים מ"ל (1/עין), 10 מזרקים מ"ל (1/ עין), מסנני מזרק ניילון (1/ עין).
  4. הכן מדיה סטרילית: DMEM עם 4% FBS, 1x גלוטמקס, 1x גנטמיצין, 1x אנטישמיקוטי אנטישמי (AA; כ 30-40 מ"ל מדיה מלאה / עין).
  5. הכן AA-PBS: PBS עם AA 1x (~ 500 מ"ל).
  6. הכן את ערכת כלי הניתוח הגסה: מספריים כירורגיים גדולים ונקיים ומלקחיים.
  7. הגדר את סביבת העבודה של ניתוח לא סטרילי: אסוף אספקה מחבילת כלי ניתוח גולמית, עיני חזיר משודרגות שקועות ב- PBS ועל קרח, וילון כירורגי, 100 מ"ל עם PBS. לפרוס את הוילון הכירורגי ואת הפריטים הנדרשים לניתוח ברוטו.
  8. הגדר את סביבת העבודה הסטרילית של ביתור: אסוף אספקה מערכת מכשירים מיקרו-ניתוח, גזה סטרילית, מיקרוסקופ ניתוח, פתרון betadine, PBS סטרילי, מדיה סטרילית, ארבעה כוסות 100 מ"ל מעוקרות, צלחת פטרי סטרילית. העברה אספטית לארון BSC II #1. הגדר את הארון להדמיית עיניים על המיקרוסקופ הניתח.
  9. הקם את סביבת העבודה של הרכבה ASOC: אסוף ערכות מעוקרות בגז (ערכת כלים וערכת מכסה), ערכת כלי הרכבה, מדיה סטרילית, דוכני כלים, צלחות פטרי סטריליות, מזרקים סטריליים ומסנני מזרק. העברה אספטית לקבינט BSC II #2. תארגן את הארון להרכבה של כלים.
  10. כאשר העיניים מתייצבות ומוכנות לנקב (72 שעות לאחר ההתקנה), מעביר אותן באופן טפיטי לארון BSC II. הגדר את סביבת העבודה אינדוקציה פציעה OG: התקן אינדוקציה פציעה מופעל פניאומטי (הרכבה המפורטת בתוספת 3) ושקע מעבדה ומקסימום מעקב צולב להחזיק את צלחת ASOC.

2. ניתוח של רקמות

  1. הכן את רקמת החזיר באמצעות סביבת עבודה לא סטרילית של ניתוח.
    1. רכשו עיני חזיריות משורבות מבית מטבחיים מקומי, ממחקרים בבעלי חיים או מספק. שמור את העיניים על קרח שקוע PBS במהלך הלידה ולהשתמש מיד עם קבלת.
    2. חותכים את הרקמה החוץ-אורביטלית ומקצצים את הלחמית ומשאירים רק את קליפת הקורניאוסקלרלי ואת עצב הראייה. בצע את הניתוח בתנאים לא סטריליים עם מספריים כירורגיים גדולים ומלקחיים בערכת כלי ניתוח גולמית.
    3. מחזירים את העיניים ל-PBS טרי על הקרח עד שכל העיניים הנדרשות להתקנה ניסיונית נותחו ראשוניות/ברוטו.
    4. שקועים בעיניים בתמיסת betadine 10% למשך 2 דקות במיכלים סגורים ומעבירים באופן אספטי לארון BSC II #1. בצע את כל העבודות הבאות בתנאים סטריליים כדי למזער את הזיהומים במהלך ההתקנה.
  2. לנתח באופן סטרילי מקטעים קהוריים.
    1. לאחר 2 דקות בתמיסת betadine, להעביר את העיניים לשלוש שטיפות סדרתיות של AA-PBS סטרילי כדי להסיר תמיסת betadine עודף מפני השטח העין תוך שמירה על סטריליות של רקמת העין. לאחר שלוש שטיפות, לשמור על הרקמה ב- AA-PBS עד לשימוש נוסף.
    2. יש להחמיע את העין באמצעות סכין גילוח/אזמל ומספריים מעוקלות. מניחים את העין על גזה ספוגה AA-PBS וליצור חתך עם סכין גילוח סטרילי או אזמל ליד קו המשווה של העין (60/40 לפצל עם 40 בצד הצידה השמאלי). באמצעות מספריים כירורגיים מעוקלים, יש לבודד את העין האחורית (חצי הקרנית).
      הערה: החתך סביב המקטע החיצוני צריך להיות רציף כדי למנוע קצוות משוננים ומחוספסים בסקלרה שייצרו דליפות נוזלים לאחר ההתקנה בתרבות האיברים.
    3. השתמש מיקרו-cissors כ ואת חפירה כדי לגרוף הומור מצחילי מן הקטע החלקי. הסר את העדשה מהקטע החלק החלקי בחלקו החלקים הזעירים באמצעות מיקרו-רסיסים. השאר את המקטעים הימניים ב- AA-PBS עד לשלבי ניתוח נוספים.
      הערה: כל העיניים שינותחו יכולות להיות מוחזקות בשלב זה ואחת אחת נלקחות דרך שארית תהליך הניתוח.
    4. בעזרת מיקרוסקופ מנתח, קיצצו את הקשתית לשורש הקשתית בהדרגה, רדיאלית עד שעבודת רשת trabecular (TM) גלויה. ה- TM היא רקמה פיגמנטית הכוללת סיבים המכוונים באופן היקפי סביב קליפת הקורניאו. חתכים זהירים לתוך הקשתית לכיוון שורש הקשתית יחשפו את עומק ה- TM מתחת לרקמה.
    5. חותכים 360° סביב הקשתית באותו עומק כמו החתך הראשוני לרקמה כדי לחשוף את כל אזור TM. נקו כל הקשתית שנותרה המכסה TM לפי הצורך.
    6. חותכים את שרידי הגוף הססיריים האחוריים ל- TM, ומשאירים רק רצועה דקה של רקמה אחורית לאזור TM (כ -1 מ"מ).
    7. מקם את המקטע החלקה החלקה של החלקה החלקה של החלקה המפורחת (AS) במדיה עד להתקנה נוספת ב- ASOC בארון BSC II #2.
      הערה: כל העיניים יכולות להיות מוחזקות בשלב זה לפני הגדרת ASOC אם משתמש יחיד מבצע ניתוח והרכבה צלחת תרבות איברים.

3. הקמת מקטעים קהוריים במנות תרבות איברים

  1. מניחים AS יחיד בצלחת פטרי עם AS הפוך (כוס למעלה). באמצעות צמר גפן, רטוב בתקשורת בעדינות טיפה במרכז הקרנית כדי להסיר כל פיגמנט. באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את העין ואת אותה ספוגית, לנגב את צמר גפן סביב sclera כדי להסיר פיגמנט נוסף.
  2. הפוך את AS ומניחים על החלק התחתון של המנה מעל האזור המוגבה, מרכז הקרנית מעל האזור המוגבה בצלחת. הנח את טבעת הידוק על גבי AS החדש שהוצב.
  3. מניחים ארבעה ברגים לתוך החורים המתאימים כדי להחזיק את הטבעת במקום עם AS מתחת לטבעת. הדק בעדינות את הברגים בעזרת ה-L-key.
    הערה: שלב ההידוק יקרה מדי יום במהלך הניסוי, ולכן מטרת ההידוק הראשוני כאן היא להבטיח שהתקשורת לא תדלוף תוך הימנעות משבירת טבעת ההידוק.
  4. עם סט צלחת פטרי סטרילי, מניחים את החלק העליון מעל המנה והורידו את ההתקנה. חברו את דוכן הכלים. חבר את המחברים הנוזליים עם טבעות O ליציאות משורשלות בתחתית המנה.
  5. למחבר נוזלי אחד, חבר רכזת מחט כפופה של 18 G 90°, אורך צינורות, רכזת מחט 18 G, מסנן מזרק ניילון, שסתום משולש ומזרק 20 מ"ל מלא במדיה.
  6. למחבר הנוזלי השני, חבר רכזת מחט כפופה של 18 G 90 מעלות, אורך הצינורות, רכזת מחט 18 G, שסתום משולש, ואת חלק החבית של מזרק סטרילי 10 מ"ל (זה ישמש כמאגר לתפוס נוזלים ובועות מן ASOC).
  7. עם שסתומים משולשים הפתוחים כראוי למזרקים, דחפו בעדינות מדיה דרך המערכת באמצעות יציאת מחבר Fluidics שזוהתה בשלב 3.5 כדי לנפח את ה- AS, למלא מדיה בצינורות, ובסופו של דבר למאגר.
    הערה: אם התקשורת דולפת לתוך צלחת ASOC, AS אינו מאובטח מספיק בחוזקה עם טבעת הידוק.
  8. הסר בועות על ידי דוחף בעדינות מדיה לתוך המנה ולהפוך את המנה לדחוף את הבועות לתוך המאגר.
  9. מניחים את המנה ולעמוד זקוף. מניחים את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לרגלי הדוכן, נזהרים לא לנהם את הצינורות.

4. התחלת תרבות איברים של מגזרי תחליפית

  1. ASOC הוא עכשיו מוכן לדגירה. מניחים את צלחת ASOC לתוך אינקובטור תרבית התא (37 °C (37 °C), 5% CO2). ודא את הגובה של צלחת ASOC באינקובטור מעל מתמרי הלחץ ידוע וחשב לחישוב IOP במדויק (פרוטוקול משלים 4).
  2. כוון את קווי הצינורות החוצה דרך החלק התחתון של 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור הדלת, כך שהם לא מפריעים הפתיחה והסגירה של הדלת. חבר את המזרק 20 מ"ל למשאבת המזרק להגדיר ב 2.5 μL / min.
  3. מקם את קו הצינורות עם המאגר במכשיר מתמר הלחץ. חבר את שסתום 3 כיווני הצד להגדרת מתמר הלחץ תוך הזרמת PBS דרך הקו כדי למנוע בועות אוויר נכנס קווי צינורות.
    הערה: רוקן את ה- PBS מהמאגרים לאחר הקמת המערכת כדי להפחית את הסבירות לזיהום מאגר עם צמיחה מיקרוביאלית למשך תרבית האיברים.
  4. הפעל איסוף נתוני IOP על-ידי הבטחת תחילה שכרטיס microSD קיים לשמירת קבצי נתונים. לאחר מכן, הפעל את הגדרת מתמר הלחץ כדי להתחיל באיסוף נתונים.
    הערה: פרטים להגדרת התקן איסוף הנתונים של מתמר הלחץ מסופקים בפרוטוקול משלים 2.

5. תחזוקה יומית של ASOC

  1. לאחר ASOC היה 24 שעות כדי שיווי משקל, להסיר את הכלים מן 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור ולהניח אותם לתוך ארון BSC II.
    הערה: ברכישת נתוני לחץ, תקופות זמן אלה נראות כמו קוצים כאשר ASOCs מוסרים מהאינקובטור (שינוי גובה) ומותאמים בארון.
  2. בדוק אם יש דליפות מתחת לכל מנה על צלחת הפטרי. אם יש, יש לבדוק אם יש קשרים נוזליים הדוקים מתחת לצלחת ולהדק מחדש במידת הצורך. בדוק אם יש דליפות בחלק העליון של המנה באמצעות מקש L סטרילי כדי להדק את הברגים בטבעת ההידוק.
    הערה: רקמת הסקלרה AS תדוחס ותפחית את העובי ב-24 שעות, ויהיה צורך להדק את טבעת ההידוק.
  3. שאפו היטב את התקשורת מהמנה.
    הערה: רשת המיזוג הטראבקולרית מסננת נוזלים מהמדיה הנישבת לתוך ה- ASOC. לכן, המדיה תהיה נוכחת בצלחת ASOC לאורך הקצוות.
  4. חזור על שלבים 3.7 ו- 3.8 כדי להסיר את כל בועות האוויר הלכודות.
  5. מילוי מזרקים על משאבות המזרק, להבטיח את משאבות המזרק פועלות, ולאשר את היישור של שסתומים עבור זלוף לתוך ASOC. מחזירים את מנת ASOC לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור.
    הערה: באופן אופטימלי, שלבים אלה צריכים להתבצע מדי יום. עם זאת, השימוש בנפח התחלתי של 20 מ"ל של מדיה, נפח צלחת ASOC היטב, וקצב משאבה של 2.5 μL / min צריך להיות מספיק כדי לאפשר למערכת לפעול במשך כמה ימים ללא הפרעה.

6. אינדוקציה לפציעת OG עם התקן ניקוב המופעל על ידי פנאומטיים

הערה: בניית התקן ניקוב פנאומטי מפורטת בפרוטוקול משלים 3. פציעות OG נגרמות לאחר IOP התייצב, אשר מתרחשת בדרך כלל לאחר 3 ימים בתרבות. ערכי IOP מקובלים הם 5-20 מ"מ כ"ג בהתבסס על IOP פיזיולוגי, אשר ניתן לקבוע על ידי הערכת קבצי הנתונים IOP או הגדרת מחווני LED במערכת מדידת הלחץ כמתואר בפרוטוקול משלים 2.

  1. הכן את ארון BSC II עבור אינדוקציה פציעה OG כמפורט בשלב 1.10. חבר את פלטפורמת הנקב לקו אוויר דחוס. חבר את חפץ הנקב הסטרילי לצ'אק.
    הערה: מדחס אוויר יכול לשמש להפעלת המכשיר, אבל אוויר דחוס טנק או קווי מעבדה מובנים יכול להספיק אם הלחץ גדול מ 50 פסאיי.
  2. הגדר את וסת הלחץ על פלטפורמת הדקירה ל-50 פסאיי לכוח דקירה נאות על עצמים בקוטר של עד 4.5 מ"מ. מקם את גוזמת המעקב הצולבת על שקע המעבדה מול פלטפורמת הנקב כדי להחזיק את צלחת ASOC במהלך אינדוקציה לפציעה.
  3. הסר את הגדרת ASOC מ- 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור, והצב במקשפי המעקב הצולבים בניצב לפלטפורמת הנקב(איור 2)לאחר הסרת המכסה והנחתו בצד. שמור על המקטע החיצוני זלוף אבל לסגור את יציאת שסתום 3 כיוונים כדי מתמר הלחץ כדי למנוע נזק לחץ יתר על המתמר.
  4. הרחיבו את זרוע הבוכנה למרחק המקסימלי שלה וממקמים את פסגת הקרנית בטווח של 1 מ"מ מחפץ הדקירה. יש לסגת מזרוע הבוכנה ולקרב את המקטע הימני 1 ס"מ לעצם הדקירה.
    הערה: מרחק זה עבר אופטימיזציה עבור אינדוקציה פציעה יעילות גבוהה מבלי להכות את צלחת ASOC.
  5. פטר את מכשיר הדקירה על ידי הפעלתו ופתיחת שסתום סולנואיד עם המתג השני במכשיר. כדי לבטל את ההתקן, לחץ שוב על המתג השני כדי להסיר את התקן הדקירה מהעין. לאמת פציעה נאותה אינדוקציה על ידי בדיקה חזותית ודליפת מדיה מאתר הפציעה.
  6. הסר צלחת ASOC מן המגוזף; מניחים את המכסה בחזרה על הרכבת המנה ופותחים את הקו הנוזלי אל מתמר הלחץ. מחזירים את ה-ASOC לאינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    הערה: בשלב זה, טיפול יכול להיות מיושם על AS כדי להעריך את יעילותו לאיטום פציעות OG.

7. הסרת ASOC מהתרבות

הערה: בהתאם לניתוח נקודות קצה (ראה תוצאות מייצגות עבור שיטות נקודת קצה אפשריות), AS צריך להישאר בצלחת ASOC מנופח בעוד שיטות אחרות דורשות רקמת AS מבודדת מתא התרבות. המתודולוגיה שלהלן מתארת כיצד להוציא את AS מהמנות של תרבות האיברים ולהסיר את שאר ההתקנה.

  1. הסר את מנות ASOC מן 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור. סגור את השסתום ה-3 למזרק ולמאגר ותנתק את הצינורות מהמערכת. השלך את המזרק, המאגר והמסנן. מניחים את השסתומים, הצינורות ורכזות המחט ה-30 במיכל נפרד לשטיפה וחיטוי.
  2. נתק את רכזות המחט מהחיבורים הנוזליים בתחתית המנה. בטל את המחברים הנוזליים וטבעות ה-O. מניחים את כל הפריטים במיכל לשטיפה וחיטוי.
  3. הסר את ארבעת הברגים מטבעת הידוק באמצעות L-key. הסר בזהירות את טבעת הידוק.
  4. באמצעות מלקחיים, להסיר את AS מן המנה, בהתאם לניתוח נקודות קצה ותמונה, למקם פסולת biohazard קבוע או מתאים.

8. ניתוח נתוני IOP

  1. חבר את כרטיס microSD למחשב כדי להסיר את קובץ .txt המכיל נתונים מההפעלה הניסיונית האחרונה.
    הערה: הקובץ נקרא בקוד השולט במיקרו-בקר ויש לעדכן אותו עבור כל ניסוי (ראה פרוטוקול משלים 2).
  2. יבא את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
  3. ארגן את הנתונים ל- 12 עמודות: אות זמן (בדקה) ו- mV עבור כל אחד מ- 11 ערוצי מתמר לחץ. עשרת הערוצים הראשונים תואמים לעשרה מערכים ניסיוניים של ASOC. אות המתמר הסופי הוא עבור חיישן פתוח לאוויר כערוץ בקרה כדי לאשר אות mV לא השתנה עקב שינויים באות הקלט. ערוץ בקרת התוויה לעומת זמן לאישור אות MV היה עקבי לאורך כל הדרך.
  4. המר את אותות ה- mV עבור עשרה ערוצים ל- mmHg באמצעות משוואות יירוט שיפוע שנוצרו מהכיול הראשוני של כל חיישן (ראה פרוטוקול משלים 4).
  5. זמן התוויה (המר לימים כדי לפשט את פרשנות הנתונים) לעומת כל אחד מעשרת הערוצים כדי לקבוע כיצד ה- IOP התנודתי לאורך מסלול הזמן הניסיוני.
  6. קבע ערכי IOP ממוצעים בנקודות מפתח בנתונים כדי להשוות בקלות רבה יותר ערכים בין כל אחד מהם לבין האופן שבו הם משתנים לפני ואחרי אינדוקציה של פגיעה ב- OG. ממוצע 2-3 שעות של נתונים עבור כל מרווח זמן של 24 שעות כדי לקבוע IOP בכל יום של ASOC.
    הערה: תוצאות IOP מייצגות מוצגות באיור 4.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תמונות שצולמו באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) מוצגות לעיניים פצועות של OG כדי להמחיש כיצד נראית אינדוקציה מוצלחת של פציעה. איור 3 מציג תמונות לשליטה ורקמות AS פצועות של OG מיד לאחר הפציעה ו-72 שעות מאוחר יותר. מוצגות שתי תצוגות: תמונות חתך דרך אתר הפציעות והקרנת עוצמה מרבית מלמעלה למטה (MIPs) כדי לדמיין את שטח הפנים של התמונה. עיני בקרה מראות שאין הפרעה ניכרת בקרנית, בעוד פציעות ברורות ניתן לאתר כי לחצות את הקרנית כולה לאחר פציעת OG. מ- MIPs, ניכר כי פציעות אינן סדירות בצורתן ובגודלן...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם צעדים קריטיים עם פלטפורמת הפציעות ASOC OG שיש להדגיש כדי לשפר את הסבירות להצלחה בעת שימוש במתודולוגיה. ראשית, במהלך ניתוח המקטעים הראשונים, שמירה על רשת trabecular היא חיונית אך מאתגרת לעשות כראוי. אם TM הוא שיבש, העין לא תשמור על לחץ פיזיולוגי ולא תעמוד בקריטריוני הזכאות לשימוש ניסיוני. מומלץ לתרגל תחילה את תהליך הניתוח בתנאים רגילים במקום להציג תחילה אתגרי הטכניקה האספטית הנוספת עד לקבלת ניתוחים נאותים. שנית, כאשר הגדרת העיניים במנות ASOC, זה הכרחי כי הם הדוקים מספיק כדי למנוע נוזלים דולף אבל רופף מספיק כדי למנוע ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים. הדעות המובעות במאמר זה הן של המחברים ואינן משקפות את המדיניות הרשמית או העמדה של המחלקה הרפואית של צבא ארה"ב, מחלקת הצבא, משרד ההגנה או ממשלת ארה"ב.

תודות

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי משרד ההגנה של ארצות הברית באמצעות הסכם בין-משרדי (#19-1006-IM) עם תוכנית הרכישה הזמנית לתיקון קרנית (הסוכנות לפיתוח מטריאל רפואי של צבא ארצות הברית).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10-32 תקע ישר מפוליקרבונט, מחבר צינור הברגה זכרMcMaster-Carr51525K431
10-32 בורג מכסה שקע, ו-frac12; "מקמאסטר-קאר92196A269
מזרק 10 מ"לBD302995
20 מ"ל מזרקBD302830
אנטיאנטי גיבקו15240-096
מפתח L קצה כדורימקמאסטר-קאר5020A25
בטדיןפישר סיינטיפיקNC1696484
BD  אינטרמדיק  PE 160 צינורותפישר מדעי14-170-12E
צמר גפן ספוגיותפוריטן25-8061WC
DMEM מדיהATCC30-2002
FBSATCC30-2020
מלקחיים עדיניםמכשירים מדויקים בעולם15914
גזהCovidien8044
GentamicinGibco15710-064
GlutamaxGibco35050-061
טבעת O סיליקון בטמפרטורה גבוהה, רוחב 2 מ"מ, מזהה 4 מ"מMcMaster-Carr5233T47
מלקחיים גדוליםמכשירי דיוק עולמיים500365
מספריים כירורגיים גדוליםמכשירי דיוק עולמיים503261
מלקחיים בעלי שיניים בינוניותדיוק עולמי מכשירים501217
מסמר (חפץ פנצ'ר)מקמאסטר-קאר97808A503
מסנני מזרק ניילוןפישר09-719C
PBSGibco10010-023
צלחת פטרי (100 מ"מ)פישרFB0875713
פוליקרבונט, תלת כיווני, פקק עם זכר  לואר  לנעולפישרNC9593742
סכין גילוחפישר12-640
נירוסטה 18 גרם  90 מעלות  מחט חלוקת זוויתMcMaster-Carr75165A81
נירוסטה 18 G ישר ½ '’ מחט חלוקהMcMaster-Carr75165A675
כוסות סטריליות 100 מ"ל עם מכסיםVWR15704-092
Vannas  מספרייםמכשירי דיוק עולמייםWP5070

מקורות

  1. Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 1 Suppl 78-85 (2010).
  2. Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
  3. Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
  4. Townsend, S., Lasher, W. The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), US Army. (2018).
  5. Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
  6. Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954(2012).
  7. Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
  8. Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), Philadelphia, Pa. 193-197 (1999).
  9. Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
  10. Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218(2020).
  11. Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98(2020).
  12. Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
  13. Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546(2021).
  14. Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
  15. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
  16. Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
  17. Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251(2018).
  18. Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
  19. Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
  20. Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18(2021).
  21. Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
  22. Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
  23. Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732(2020).
  24. Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), Thorofare, NJ. 59-64 (2018).
  25. Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
  26. Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
  27. Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
  28. Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496(2011).
  29. Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
  30. Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
  31. Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
  32. Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
  33. Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
  34. Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
  35. Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541(2013).
  36. Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
  37. Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
  38. Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
  39. Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

פלטפורמת תרבות איברים מגזריי חיצוני למעקב אחר פציעות גלובוס פתוח וביצועים טיפוליים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.