מאמר שיטה

שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

DOI:

10.3791/62654

⸱

6 במאי 2021

 ,  ,  ,  , 
1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפונקציות הפוטנציאליות של תאים דמויי hepatocyte (HLCs) נגזר תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לקיים הבטחה גדולה עבור מידול מחלות ויישומי סינון תרופות. בתנאי שכאן היא שיטה יעילה הניתנת לשחזור לבידול של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. הקמת שושלת אנדודרם היא צעד מפתח בהבחנה ל- HLCs. בשיטה שלנו, אנו מווסתים את מסלולי האיתות העיקריים על ידי שכשהם רציף Activin A ו- CHIR99021 במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE), ואחריו דור של תאי אב כבד, ולבסוף HLCs עם מורפולוגיה hepatocyte טיפוסי בשיטה stagewise עם ריאגנטים מוגדרים לחלוטין. ה- HLCs הנגזרים מ- hESC המיוצרים על-ידי שיטה זו מבטאים סמנים ספציפיים לבמה (כולל אלבומין, קולטן גרעיני HNF4α, ונתרן טאורוכולאט cotransporting פוליפפטיד (NTCP)), ולהראות מאפיינים מיוחדים הקשורים hepatocytes בוגרת ותפקודית (כולל כתמים ירוקים אינדוקיאנין, אחסון גליקוגן, כתמי המטוקסילין-אאוסין ופעילות CYP3), והוא יכול לספק פלטפורמה לפיתוח יישומים מבוססי HLC במחקר של מחלות כבד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכבד הוא איבר מטבולי מאוד זה ממלא מספר תפקידים, כולל deoxidation, אחסון גליקוגן, הפרשת סינתזה של חלבונים1. פתוגנים שונים, תרופות ותושיות יכולים לגרום לשינויים פתולוגיים בכבד ולהשפיע על תפקודיו2,3. Hepatocytes, כיחידה הפונקציונלית העיקרית של הכבד, לשחק תפקיד חשוב במערכות תמיכה בכבד מלאכותי חיסול רעילות סמים. עם זאת, המשאב של hepatocytes אנושי ראשוני מוגבל בטיפול מבוסס תאים, כמו גם במחקר מחלות כבד. לכן, פיתוח מקורות חדשים של hepatocytes אנושי תפקודי הוא כיוון מחקר חשוב בתחום הרפואה רגנרטיבית. מאז 1998 כאשר hESCs הוקמו4, hESCs נחשבו נרחב על ידי חוקרים בגלל פוטנציאל הבידול המעולה שלהם (הם יכולים להבדיל לרקמות שונות בסביבה מתאימה) ודרגה גבוהה של חידוש עצמי, ובכך לספק תאי מקור אידיאליים לכבדים ביו-אפיים, השתלת hepatocyte ואפילו הנדסת רקמת כבד5.

נכון לעכשיו, יעילות בידול הכבד ניתן להגדיל מאוד על ידי העשרת endoderm6. בהבחנה שושלת של תאי גזע לתוך endoderm, רמות של גורם הגדילה טרנספורמציה β (TGF-β) איתות מסלולי איתות WNT הם הגורמים העיקריים בצומת של שלב היווצרות endoderm. הפעלה של רמה גבוהה של TGF-β ו WNT איתות יכול לקדם את הפיתוח של endoderm7,8. Activin A הוא ציטוקינים השייכים למשפחה העל TGF-β. לכן, Activin A נמצא בשימוש נרחב אינדוקציה endoderm של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה אנושי (hiPSCs) ו hESCs9,10. GSK3 הוא קינאז חלבון סרין-טרונין. חוקרים מצאו כי CHIR99021, מעכב ספציפי של GSK3β, יכול לעורר אותות WNT טיפוסי, והוא יכול לקדם בידול תאי גזע בתנאים מסוימים, מה שמרמז כי CHIR99021 יש פוטנציאל לגרימת התמיינות תאי גזע לתוך endoderm 11,12,13.

כאן אנו מדווחים על שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של hESCs לתוך HLCs פונקציונליים. התוספת הרציפה של Activin A ו- CHIR99021 ייצרה כ 89.7±0.8% SOX17 (DE סמן)-תאים חיוביים. לאחר התבגרות נוספת במבחנה, תאים אלה הביעו סמנים ספציפיים בכבד ומורפולוגיה דמוית hepatocyte מופעל (מבוסס על כתמי המטוקסילין-אאוסין (H &E)) ופונקציות, כגון ספיגת ירוק אינדוקיאנין (ICG), אחסון גליקוגן ופעילות CYP3. התוצאות מראות כי hESCs ניתן להבדיל בהצלחה לתוך HLCs תפקודית בוגרת בשיטה זו והוא יכול לספק בסיס למחקר הקשורות למחלות כבד הקרנת תרופות במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת תאי גזע

הערה: פרוטוקול תחזוקת התא המתואר להלן חל על קו התא hES03 המתוחזק בשכבה מונוטלת תואמת. עבור כל הפרוטוקולים הבאים בכתב יד זה, יש לטפל בתאים תחת ארון בטיחות ביולוגי.

  1. הכינו מדיום תרבית תאי גזע 1x mTesR על ידי דילול מדיום משלים 5x למדיום בסיסי mTesR.
  2. הכינו מדיום Matrigel מוסמך 30x hESC על ידי דילול 5 מ"ל של Matrigel מוסמך HESC עם 5 מ"ל של DMEM / F12 על הקרח. יש לאחסן ב-20°C.
  3. הכן מדיום Matrigel מוסמך 1x hESC על ידי דילול 33.3 μL של מטריגל 30x hESC מוסמך עם 1 מ"ל של DMEM / F12.
  4. מעיל סטרילי 6 גם, רקמות תרבות מטופלים צלחות עם 1 מ"ל של 1x hESC מוסמך Matrigel בכל באר מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לילה. השאירו בטמפרטורת החדר (RT) לפחות 30 דקות לפני השימוש.
  5. להפשיר את hESCs cryopreserved באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות בלי לרעוד. לאחר מכן להעביר מיד את התאים על ידי pipetting לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל מראש 37 °C MTesR בינוני, צינור למעלה ולמטה בעדינות 2 פעמים.
  6. צנטריפוגה hESCs ב 200 x g במשך 2 דקות ב RT.
  7. לשאוף את supernatant בעדינות resuspend התאים ב 1 מ"ל של מדיום mTesR.
  8. לשאוף את המדיום DMEM/F12 מהצלחת ולזרע את התאים לתוך באר של צלחת 6-באר בצפיפות של 1 x 105 תאים ב 2 מ"ל של mTesR.
  9. דגירה באינקובטור 5% CO2 ולשמור על התאים על ידי החלפת עם מדיום mTesR שחומם מראש מדי יום. מעבר התאים בערך 70-80% מפגש או כאשר מושבות התא מתחילים ליצור קשר.

2. מעבר תאי גזע ובידול

  1. עבור תאים חולפים, לשאוף את המדיום ואת הדגירה התאים עם 1 מ"ל לכל באר של פתרון אנזים (למשל, Accutase במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F). לאחר מכן להעביר את התאים על ידי pipetting לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל של DMEM / F12 מראש לחממה ל 37 °C (60 °F).
  2. צנטריפוגה התאים ב 200 x g ב RT במשך 2 דקות.
  3. לשאוף את המדיום בעדינות resuspend גלולת התא ב 1 מ"ל של מדיום mTesR.
  4. הכן צלחות 24-באר על ידי ציפוי עם 250 μL של 1x hESC מוסמך Matrigel בינוני מראש. זרעי hESCs כמתואר לעיל בצפיפות של 1 - 1.5 x 105 תאים לבאר ב 500 μL של מדיום mTesR.
  5. אפשר לתאים לדגר במשך 24 שעות ב 37 °C (69 °F) באינקובטור CO2.

3. היווצרות DE

  1. הכן פתרונות מלאי של 100 מיקרוגרם / מ"ל Activin A עם DPBS המכיל 0.2% BSA ו 3 מ"מ CHIR99021 עם DMSO.
  2. הכן שלב I בידול בינוני בסיסי על ידי השלמת מדיום RPMI עם 1x B27.
  3. הוסף Activin A לריכוז הסופי של 100 ng/mL ו CHIR99021 לריכוז הסופי של 3 מיקרומטר בנפח המתאים של שלב מחומם מראש אני בידול בינוני בסיסי.
  4. לשאוף mTesR בינוני מהתאים ולהחליף עם שלב I בידול מדיה המכילה גורמי בידול הוסיף (למשל, 0.5 מ"ל לכל באר של צלחת 24-well).
  5. אפשר לתאים לדגור במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור CO2, החלפת מדיה שלב I מדי יום עם גורמי בידול הוסיף טרי (ימים 0-2).
    הערה: לאחר 3 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים של תאי DE, כגון FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 ו- FOXA1 (מינימום 80% מ- SOX17 הדרושים להליך).

4. בידול של תאי אב בכבד

  1. הכן שלב II בידול מדיה בסיסית על ידי המסת החלפת סרום נוקאאוט (KOSR) לריכוז הסופי של 20% ב- DMEM נוקאאוט.
  2. הכן מדיום בידול שלב II המכיל 1% DMSO, 1x GlutaMAX, 1x פתרון חומצת אמינו לא חיונית (NEAA), 100 מיקרומטר 2-מרקפתנול ו 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) לנפח המתאים של KOSR / נוקאאוט DMEM.
  3. ביום 3 של בידול, לשאוף את המדיום ולהחליף עם שלב II בינוני (למשל, 0.5 מ"ל לכל באר של צלחת 24 גם). ואז דגירה במשך 24 שעות.
  4. ביום 4 של בידול, לשאוף את המדיום ולהחליף עם שלב II בינוני (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 24 באר).
  5. לשנות את המדיום כל יומיים (להחליף בינוני ביום 6).
    הערה: לאחר 8 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים מתאימים של תאי אב בכבד, כגון HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (מינימום 80% של HNF4α הדרושים להליך).

5. בידול הפטוציטים

  1. הכן 10 מיקרוגרם / מ"ל גורם גדילה hepatocyte (HGF), 20 מיקרוגרם / מ"ל Oncostatin (OSM) פתרונות מלאי עם DBPS (המכיל 0.2% BSA) ומסנן עם קרום מסנן 0.22 מיקרומטר.
  2. הכן שלב III בידול בסיסי בינוני (HepatoZYME-SFM (HZM) בינוני בתוספת 10 מיקרומטר הידרוקורטיזון-21-hemisuccinate ו 1x P/S).
  3. הוסף HGF לריכוז הסופי של 10 ng/mL ו OSM לריכוז הסופי של 20 ng/mL לנפח המתאים של מדיום בידול שלב III שחומם מראש.
  4. ביום 8 של בידול, לשאוף שלב II בינוני מתאים ולהחליף עם שלב III בינוני (למשל, 1 מ"ל לכל באר של צלחת 24 גם).
  5. אפשר לתאים לדגור במשך 10 ימים ב 37 °C (69 °F) באינקובטור CO2, שינוי מדיה שלב III כל יומיים עם גורמי בידול הוסיף טרי (ימים 8-18).
    הערה: לאחר 18 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים אופייניים של hepatocytes, כגון AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. אחוז התאים החיוביים של אלבומין הוא בדרך כלל יותר מ-90%.

6. בידוד RNA, סינתזת cDNA וניתוח RT-qPCR

  1. לשאוף מדיום מתאים ולהוסיף את הכמות הנכונה של ריאגנט RNAiso Plus, (למשל, 0.3 מ"ל לכל באר של צלחת 24-באר). לאסוף את supernatant בצינור 1.5 מ"ל ולתת לעמוד ב RT במשך 5 דקות.
  2. הוסף 60 μL של מגיב כלורופורם ולהשאיר אותו RT במשך 5 דקות. ואז צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 15 דקות.
  3. לאסוף את 125 μL supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה אחר. מוסיפים 160 μL של isopropanol, מערבבים היטב, ועומדים ב- RT במשך 10 דקות.
  4. צנטריפוגה ב 12,000 x g במשך 10 דקות.
  5. הסר את supernatant, להוסיף 75% אתנול לזרז, וצנטריפוגה ב 7,500 x g במשך 5 דקות.
  6. לאחר ייבוש ב RT, להוסיף 40 μL של מים שטופלו DEPC להתמוסס. עבור qPCR, לתמלל לאחור 2 מיקרוגרם של RNA הכולל עם ערכת שעתוק הפוכה על פי פרוטוקול היצרן.
  7. בצע RT-qPCR באמצעות ערכה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. לנרמל ביטוי גנים יחסית לתאי גזע שאינם המושרה ולקבוע וריאציה לקפל לאחר נורמליזציה GAPDH.

7. אימות כשל חיסוני של בידול

  1. הכן מאגר כביסה 1x PBST על-ידי הוספת 0.1% Tween-20 ל- PBS.
  2. לשאוף מדיום מתאים חסידיים ולשטוף בקצרה עם PBS ב RT על שייקר.
  3. לשאוף PBS ותאי דגירה עם 500 μL של מתנול קר כקרח לכל באר של צלחת 24-well לתקן את התאים ב -20 מעלות צלזיוס לילה.
  4. הסר את מתנול ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS על שייקר במשך 10 דקות בכל פעם ב RT.
  5. לחסום תאים עם 500 μL של 5% BSA מוכן PBS עבור 1-2 שעות ב RT על שייקר.
  6. לדלל את הנוגדן העיקרי ב 1: 200 באותו פתרון המשמש לחסימה.
  7. דגירה את התאים הקבועים בתמיסת נוגדנים ראשונית μL 300 μL לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
  8. לאחר הדגירה לילה, לשטוף תאים 3 פעמים עם PBST במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
  9. הכינו פתרון נוגדנים משני בחסימת הפתרון בשעה 1:1000.
  10. דגירה ב 300 μL של פתרון נוגדנים משני מוגן מפני אור במשך 1 שעה ב RT על שייקר.
  11. לשאוף פתרון נוגדנים משני ולשטוף תאים 3 פעמים עם PBST במשך 10 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
  12. דגירה תאים עם 300 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI במשך 3-5 דקות, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBST.
  13. לאחר שאיפת PBST, הוסף כמות מתאימה של PBS לצילום תמונות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

8. ניתוח כתמים מערביים

  1. הכן מאגר כביסה של 1x TBST על-ידי הוספת 0.1% Tween-20 לתמיסת מלח (TBS) עם מאגר Tris.
  2. הכן מאגר אלקטרופורזה SDS-PAGE ומאגר העברה מערבי באמצעות ערכה מסחרית על פי פרוטוקול היצרן.
  3. פתור את סך חלבון התא (40 מיקרוגרם) על 10% נתרן דודקיל סולפט פוליאקרילמיד ג'ל ולהפעיל מאגר אלקטרופורזה SDS-PAGE ב 15 mA זרם קבוע במשך כ 2 שעות.
  4. מעבירים את הג'ל לקרום פוליווינילידן דיפלוריד (PVDF) בזרם קבוע של 300 mA למשך 2 שעות בטמפרטורה נמוכה.
    הערה: זמן הריצה וזמן ההעברה עשויים להשתנות בהתאם לציוד המשמש ולסוג ואחוז הג'ל.
  5. חסום את הממברנה עם 3% BSA מוכן TBST עבור 1 שעה ב RT על שייקר.
  6. דגירה בתמיסת נוגדנים ראשונית (1:1000 דילול) לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר.
  7. לאחר הדגירה לילה, לשטוף קרום סופג 3 פעמים עם TBST במשך 15 דקות בכל פעם ב RT על שייקר.
  8. דגירה בתמיסת נוגדנים משנית (1:2000 דילול) במשך 2 שעות ב RT על שייקר.
  9. השלך פתרון נוגדנים משני ולשטוף את הממברנה 3 פעמים עם TBST, במשך 15 דקות בכל פעם, ב RT על שייקר.
  10. דמיינו להקות אימונואקטיביות המשתמשות בריאגנט של chemiluminescence ואחריו אוטורדיוגרפיה. השתמש β-actin כפקד הטעינה.

9. ספיגה ירוקה אינדוקיאנין

  1. הכן 200 מ"ג / מ"ל אינדוקיאנין ירוק פתרון מלאי DMSO.
  2. הכן פתרון עבודה על ידי השלמת שלב III בידול בינוני עם פתרון ירוק אינדוקיאנין לריכוז הסופי של 1 מ"ג / מ"ל.
  3. דגירה ב 37 °C (69 °F), 5% CO2 אינקובטור עבור 1-2 שעות.
  4. לשאוף בינוני ולשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS.
  5. תצלום מתחת למיקרוסקופ.

10. כתמי חומצה מחזורית-שיף (PAS) והכתמת המטוקסילין-אאוסין (H&E)

  1. לשאוף מדיום מתאים חסידיים ולשטוף לזמן קצר פעמיים עם PBS.
  2. עבור קיבוע תאים, לשאוף PBS ולדגור תאים עם מתנול קר כקרח ב -20 מעלות צלזיוס לילה.
  3. דמיינו אחסון גליקוגן על ידי כתמי PAS והתבוננו בתאים מנוצלים על ידי כתמי H &E באמצעות ערכה בהתאם להוראות היצרן.
  4. קח תמונות עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

11. מבחנים לפעילות CYP

  1. מדוד פעילות CYP450 באמצעות מבחנים מסחריים מבוססי תאים (P450-Glo Assays) בהתאם להוראות היצרן.
  2. השתמש בשלוש חזרות עצמאיות לבדיקה. הנתונים מיוצגים כ- SD ± הממוצע.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הדיאגרמה הסכימטית של אינדוקציה HLC מ- hESCs ותמונות שדה בהיר מייצגות של כל שלב בידול מוצגות באיור 1. בשלב I, Activin A ו- CHIR99021 נוספו במשך 3 ימים כדי לגרום לתאי גזע ליצור תאי אנדודרם. בשלב II, תאי אנדודרם מובחנים לתאי אב בכבד לאחר שטופלו במדיום בידול במשך 5 ימים. בשלב III, הפטוציטים מוקדמים התבגרו והתבדלו ל- HLCs לאחר 10 ימים ב- HGF וב- OSM (איור 1A). בשלב הסופי של הבידול, התאים הראו פנוטיפ hepatocyte טיפוסי (התאים הם מצולעים ומופצים באופן שווה וקהיל) (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה חורגת שגורמת ל- HLCs מ- hESCs בשלושה שלבים. בשלב הראשון, Activin A ו- CHIR99021 שימשו כדי להבדיל HESCs לתוך DE. בשלב השני, KO-DMEM ו- DMSO שימשו כדי להבדיל DE לתאי אב בכבד. בשלב השלישי, HZM בתוספת HGF, OSM והידרוקורטיזון 21-hemisuccinate מלח נתרן שימשו כדי להמשיך להבדיל בין תאי אב בכבד לתוך HLCs.

יש לקחת בחשבון את הצעדים הקריטיים הבאים בעת השימוש בפרוטוקול. צפיפות הבידול הראשונית של התאים והתזמון המדויק של שינויים בינוניים הם גורמים חשובים לבידול מוצלח. כאשר אנו מתחילים לה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ' 81870432 ו 81570567 X.L.Z.), (מס '81571994 P.N.S.); הקרן למדעי הטבע של מחוז גואנגדונג, סין (מס ' 2020A1515010054 כדי P.N.S.), קרן אוניברסיטת לי קה שינג Shantou (לא. L1111 2008 כדי P.N.S.). ברצוננו להודות לפרופ' סטנלי לין מהמכללה הרפואית של אוניברסיטת שאנטו על ייעוץ שימושי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-MercaptoethanolSigmaM7522לבידול אב הכבד
488 עז מסומנת כנגד עכבר IgGZSGB-BIOZF-0512עבור IF, נוגדן שני
488 עז מתויגת נגד ארנב IgGZSGB-BIOZF-0516עבור IF, נוגדן שני
Accutaseטכנולוגיות תאי גזע7920למעבר תאים
Activin ApeproTech120-14Eלהיווצרות אנדודרם סופית
אנטי אלבומין (ALB)סיגמא-אולדריץ'A6684ל- IF ו- WB, נוגדן ראשוני
אנטי - אנושי Oct4AbcamAb19587ל- IF, נוגדן ראשוני
אנטי - &אלפא - חלבון עוברי (AFP)סיגמא-אולדריץ'A8452ל- IF ו- WB, נוגדן ראשוני
אנטי -SOX17Abcamab224637עבור IF, נוגדן ראשוני
נגד הפטוציטים גורם גרעיני 4 אלפא (HNF4α)SAB1412164 סיגמא-אולדריץ'עבור IF, תוסף נוגדן ראשוני
B-27Gibco17504-044להיווצרות אנדודרם סופי
BSABeyotimeST023-200gלחסימת תאים
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046להיווצרות אנדודרם סופית
DAPIBeyotimeC1006לצביעה
DEPC-מיםBeyotimeR0021לפירוק RNA
DM3189MCEHY-12071להיווצרות אנדודרם סופי
DMEM/F12Gibco11320-033לתרבית תאים
DMSOSigma-AldrichD5879להתמיינות אב בכבד
DPBSGibco14190-144לתרבית תאים
GlutaMAXGibco35050-061להתמיינות אב כבד
H& ערכת צביעה EBeyotimeC0105Sעבור H& E צביעת
גורם גדילת הפטוציטים (HGF)peproTech100-39להתמיינות הפטוציטים
HepatoZYME-SFM (HZM)Gibco17705-021להתמיינות הפטוציטים
הידרוקורטיזון-21-המיסוקינטסיגמא-אולדריץ'H4881להתמיינות הפטוציטים
אינדוציאניןסנגון ביוטקA606326לצביעת אינדוציאנין
נוק אאוט DMEMGibco10829-018להתמיינות אב בכבד
נוק אאוט SR רב מיניםGibcoA31815-02להתמיינות אב בכבד
Matrigel מוסמךhESC Corning354277לתרבית תאים
MEM NeAAGibco11140-050להתמיינות אב בכבד
mTesR 5X תוסףטכנולוגיות תאי גזע85852לתרבית תאים
טכנולוגיות תאי גזעבינוניים בסיסיים85851לתרבית תאים
Oncostatin (OSM)peproTech300-10להתמיינות הפטוציטים
P450 - CYP3A4 (לוציפרין - PFBE)PromegaV8901לפעילות CYP450
ערכת צביעת PASSolarbioG1281עבור צביעת PAS
עט/סטרפטוקוקוסGibco15140-122להתמיינות תאים
פרוקסידאז מצומד עז אנטי עכבר IgGZSGB-BIOZB-2305עבור WB, נוגדן
שני מאגר דילול נוגדנים ראשוני עבור  כתם מערביBeyotimeP0256לדילול נוגדנים ראשוני
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101לסינתזה cDNA
RNAiso PlusTaKaRa9109לבידוד RNA
RPMI 1640Gibco11875093להיווצרות אנדודרם סופית
חלב רזהSangon BiotechA600669להכנת נוגדנים שני
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742לניתוח RT-PCR
Torin2MCEHY-13002להיווצרות אנדודרם סופית
TweenSigma-AldrichWXBB7485Vלהכנת מאגר כביסה
גרעיניתmTesR

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular and cellular mechanisms of liver dysfunction in COVID-19. Discovery Medicine. 30, 107-112 (2020).
  3. Todorovic Vukotic, N., Dordevic, J., Pejic, S., Dordevic, N., Pajovic, S. B. Antidepressants- and antipsychotics-induced hepatotoxicity. Archives of Toxicology. , (2021).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  5. Li, Z., et al. Generation of qualified clinical-grade functional hepatocytes from human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Cell Death & Disease. 10, 763(2019).
  6. Rassouli, H., et al. Gene Expression Patterns of Royan Human Embryonic Stem Cells Correlate with Their Propensity and Culture Systems. Cell Journal. 21, 290-299 (2019).
  7. Loh, K. M., et al. Efficient endoderm induction from human pluripotent stem cells by logically directing signals controlling lineage bifurcations. Cell Stem Cell. 14, 237-252 (2014).
  8. Mukherjee, S., et al. Sox17 and beta-catenin co-occupy Wnt-responsive enhancers to govern the endoderm gene regulatory network. Elife. 9, (2020).
  9. Ang, L. T., et al. A Roadmap for Human Liver Differentiation from Pluripotent Stem Cells. Cell Reports. 22, 2190-2205 (2018).
  10. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. Journal of Clinical Investigation. 124, 4953-4964 (2014).
  11. Gomez, G. A., et al. Human neural crest induction by temporal modulation of WNT activation. Developmental Biology. 449, 99-106 (2019).
  12. Lee, J., Choi, S. H., Lee, D. R., Kim, D. S., Kim, D. W. Generation of Isthmic Organizer-Like Cells from Human Embryonic Stem Cells. Molecules and Cells. 41, 110-118 (2018).
  13. Matsuno, K., et al. Redefining definitive endoderm subtypes by robust induction of human induced pluripotent stem cells. Differentiation. 92, 281-290 (2016).
  14. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 38, 1-18 (2016).
  15. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 12301-12306 (2008).
  16. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4, 939-952 (2015).
  17. Yu, J. S., et al. PI3K/mTORC2 regulates TGF-beta/Activin signalling by modulating Smad2/3 activity via linker phosphorylation. Nature Communications. 6, 7212(2015).
  18. Borowiak, M., et al. Small molecules efficiently direct endodermal differentiation of mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 4, 348-358 (2009).
  19. Tahamtani, Y., et al. Treatment of human embryonic stem cells with different combinations of priming and inducing factors toward definitive endoderm. Stem Cells and Development. 22, 1419-1432 (2013).
  20. Song, Z., et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells. Cell Research. 19, 1233-1242 (2009).
  21. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51, 329-335 (2010).
  22. Xia, Y., et al. Human stem cell-derived hepatocytes as a model for hepatitis B virus infection, spreading and virus-host interactions. Journal of Hepatology. 66, 494-503 (2017).
  23. Li, S., et al. Derivation and applications of human hepatocyte-like cells. World Journal of Stem Cells. 11, 535-547 (2019).
  24. Ogawa, S., et al. Three-dimensional culture and cAMP signaling promote the maturation of human pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Development. 140, 3285-3296 (2013).
  25. Kim, D. E., et al. Prediction of drug-induced immune-mediated hepatotoxicity using hepatocyte-like cells derived from human embryonic stem cells. Toxicology. 387, 1-9 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

מאמרים קשורים