הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

Summary

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי שמור מאוד שהחל על ידי היווצרות של הקרנות ממברנה דמויות יריעות F-אקטין, הידועות גם בשם קפלים ממברנה. שיעור מוגבר של הפנמה מקרופינוציטוטית של מומסים היה מעורב במצבים פתולוגיים שונים. פרוטוקול זה מציג שיטה לכימות היווצרות קפלים בקרום במבחנה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.

Abstract

תפיחת ממברנה היא היווצרות של בליטות קרום פלזמה תנועתיות המכילות רשת של חוטי אקטין פולימריים חדשים. קפלים ממברנה עשויים להיווצר באופן ספונטני או בתגובה לגורמי גדילה, ציטוקינים דלקתיים ואסטרי פורבול. חלק מבליטות הממברנה עשויות להתארגן מחדש לקפלי ממברנה עגולים המתמזגים בשוליים הדיסטליים שלהם ויוצרים כוסות שנסגרות ונפרדות לתוך הציטופלסמה כשקעים גדולים והטרוגניים הנקראים מקרופינוזומים. במהלך התהליך, קפלים לוכדים נוזל חוץ-תאי ומומסים שמפנימים בתוך מקרופינוזומים. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (SEM) היא טכניקת הדמיה נפוצה להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים של ממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות סגורות על פני התא. הפרוטוקול הבא מתאר את תנאי תרבית התאים, את הגירוי של היווצרות קפל הממברנה במבחנה, וכיצד לתקן, לייבש ולהכין תאים להדמיה באמצעות SEM. מתוארים גם כימות של רפרוף ממברנה, נורמליזציה של נתונים, וממריצים ומעכבים של היווצרות קפלים בממברנה. שיטה זו יכולה לסייע לענות על שאלות מפתח לגבי תפקידה של מקרופינוציטוזה בתהליכים פיזיולוגיים ופתולוגיים, לחקור מטרות חדשות המווסתות את היווצרותם של ממברנות, ולזהות מגרים פיזיולוגיים שעדיין אינם אופייניים, כמו גם מעכבים פרמקולוגיים חדשניים של מקרופינוציטוזה.

Introduction

מקרופינוציטוזה היא תהליך אנדוציטי האחראי על הפנמת כמות גדולה של נוזל חוץ-תאי ותכולתו באמצעות היווצרות של בליטות ממברנת פלזמה דינמיות ומונעות אקטין הנקראות קפלים ממברנה¹. רבים מקפלי הממברנה האלה יוצרים כוסות שנסגרות ומתמזגות בחזרה אל התא ונפרדות מקרום הפלזמה כאנדוזומים תוך-תאיים גדולים והטרוגניים הידועים גם בשם מקרופינוזומים¹. למרות שמקרופינוציטוזה מושרית על ידי גורמי גדילה כגון גורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) וגורם גדילה אפידרמלי (EGF) במגוון רחב של סוגי תאים, תהליך ייחודי נוסף, תלוי סידן, המכונה מקרופינוציטוזה מכוננת נצפה גם בתאי חיסון מולדים 2,3,4,5,6,7,8.

Protocol

הערה: להלן פרוטוקול כללי המשמש לכימות היווצרות קפלים בממברנה במקרופאגים RAW 264.7 באמצעות מיקרוסקופיית SEM. אופטימיזציה עשויה להידרש עבור סוגי תאים שונים.

1. קו תאים ותרבית תאים

1. הגדל RAW 264.7 מקרופאגים במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% (vol/vol) סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 100 IU/mL של פניצילין ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור לח ב-37 °C ו-5% CO₂. החלף את מדיית הצמיחה כל יומיים.
2. כאשר התאים הופכים ל-80% מפגש, שטפו את הצלחת פעמיים באמצעות PBS סטרילי.
3. נתק תאים על ידי הוספת 1,000 μL של 0.5% טריפסין-EDTA ודגירה של צלחת תרבית התאים למשך 3-5 דקות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מ....

Results

כאן נתאר את התוצאות מהטכניקה המוצגת. תמונות SEM מייצגות המוצגות באיור 1 מדגימות היווצרות קפלים בקרום במקרופאגים RAW 264.7 לאחר טיפול ב-PMA וב-M-CSF. התמונות צולמו תחילה בהגדלה של פי 3,500 למטרות כימות ולאחר מכן ברמות גבוהות יותר של הגדלה (פי 8,500 עד פי 16,000) כדי להראות את קרום הפלזמה בפרטים גדולים יותר. טיפול מקדים של מקרופאגים עם מעכב המקרופינוציטוזה EIPA החליש את היווצרות קפל הממברנה (איור 1). ניתן לחלק את פעילויות ממברנת הפלזמה הקשורות למקרופינוציטוזה לחמי.......

Discussion

פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. אף על פי שהפרוטוקול הנוכחי מתמקד במקרופאג'ים, מחקרים הראו כי היווצרות קפלים בממברנה מתרחשת גם בסוגי תאים שונים אחרים, כולל תאים דנדריטיים, פיברובלסטים, נוירונים ותאים סרטניים 11,12,14,21,30. בהתחשב בכך, אופטימיזציה ש.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% טריפסין-EDTA	גיבקו	15400-054
2% גלוטראלדהיד	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	16320
4% פרפורמלדהיד	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	281692
5-(N-אתיל-N-איזופרופיל)-אמילוריד	סיגמא מדעי החיים	A3085
Accuri C6 ציטומטר
זרימהטבליות דבק פחמן	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית	77825-09
דימתיל סולפוקסיד	קורנינג	25-950-CQC Dulbecco's
Modified Eagle Medium	Cytiva Life Sciences	SH30022.01
Falcon 24-well שקוף תחתון שטוח מטופל TC צלחת תרבית תאים מרובת בארות	פלקון	353047
סרום בקר עוברי	תאומים ביו	900-108
FitC-dextran	Thermo Fisher Scientific	D1823
FM 4-64	Thermo Fisher Scientific	T13320
HERAcell 150i CO2 אינקובטור	Thermo Fisher Scientific	51026282
האמר דגם 6.2 Sputter Coater	Anatech USA	58565
JSM-IT500HR מיקרוסקופ			אלקטרונים סורק
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית	תרמו פישר מדעי	12-545-82
עט סטרפטוקוק	Gibco	15140-122
פורבול 12-מיריסטאט 13-אצטט	Millipore Sigma	524400
גולמי 264.7 מקרופאג	ATCC	ATCC TIB-71
רקומביננטי אנושי M-CSF	Peprotech	300-25
Samdri-790 מייבש נקודה קריטית	Tousimis Research Corporation	8778B
SEM אלומיניום דגימת תושבות	מיקרוסקופיה אלקטרונית מדעי	75220
נתרן קקודילאט	אלקטרונים מיקרוסקופיה מדעית	12300
טקסס אדום-דקסטר	תרמו פישר סיינטיפיק	D1864
טריפאן תמיסה כחולה	תרמו פישר מדעי	15250061
			קונפוקלי Zeiss LSM 780