מאמר זה מתאר את ההליכים המשמשים להערכת הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים בקו תאים ראשוני ואימורטלי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קביעת הרעילות של קרינת UV וכימיקלים על תאי אפיתל ראשוניים ואימורטליים של הקרנית האנושית
במאמר זה
סיכום
תקציר
מאמר זה מתאר את השיטות למדידת הרעילות של קרינה אולטרה סגולה (UV) ורעלנים עיניים על תרביות תאי אפיתל ראשוניים (pHCEC) ומונצחים (iHCEC). התאים נחשפו לקרינת UV ולמינונים רעילים של בנזלקוניום כלוריד (BAK), מי חמצן (H 2 O2) וסודיום דודציל סולפט (SDS). הפעילות המטבולית נמדדה באמצעות בדיקה מטבולית. שחרור ציטוקינים דלקתיים נמדד באמצעות אינטרלוקין רב-תכליתי (IL)-1β, IL-6, IL-8 ובדיקת גורם נמק גידולי אלפא (TNF-α), והתאים הוערכו לכדאיות באמצעות צבעים פלואורסצנטיים.
ההשפעות המזיקות של UV על פעילות מטבולית של תאים ושחרור ציטוקינים התרחשו ב -5 דקות של חשיפה לקרינת UV עבור iHCEC ו -20 דקות עבור pHCEC. ירידות באחוזים דומים בפעילות המטבולית של iHCEC ו-pHCEC התרחשו לאחר חשיפה ל-BAK, H 2O2 או SDS, והשינויים המשמעותיים ביותר בשחרור ציטוקינים התרחשו עבור IL-6 ו-IL-8. מיקרוסקופיה של תאים שנחשפו ל-iHCEC ו-pHCEC שנחשפו ל-BAK עם כתמים פלואורסצנטיים הראתה מוות תאי בחשיפה של 0.005% ל-BAK, אם כי מידת צביעת האתידיום הייתה גדולה יותר ב-iHCEC מאשר ב-pHCECs. באמצעות שיטות מרובות להערכת השפעות רעילות באמצעות מיקרוסקופיה, הערכות של פעילות מטבולית וייצור ציטוקינים, ניתן לקבוע את הרעילות של קרינת UV ורעלים כימיים הן עבור קווי תאים ראשוניים והן עבור קווי תאים אימורטליים.
מבוא
מחקרי טוקסיקולוגיה חוץ גופית מבוצעים כדי לחזות את ההשפעות הרעילות של כימיקלים וחומרים אחרים שיכולים לגרום נזק לתאים. בהערכת רעילות לקרנית, תאי אפיתל של הקרנית האנושית (HCECs) שימשו במודלים להערכת השפעות אלה 1,2,3,4. מודלים אלה בדרך כלל מעריכים השפעות פיזיולוגיות כגון שינויים בפעילות המטבולית של התא, התפשטות תאים, ותפקודי תאים אחרים כגון ייצור ושחרור של ציטוקינים דלקתיים. עבור מחקרים טוקסיקולוגיים אלה, תאים ממקורות שונים נבחרו כדי להעריך את ההשפעות המזיקות של כימיקלים וקרינת UV על HCECs 2,3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות של pHCECs ו- iHCECs
- לגדל את pHCECs ו- iHCECs בתווך אפיתל עיני אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: 6 mM L-גלוטמין, 0.002% תוסף מדיה התאית O (טבלה של חומרים), 1.0 μM אפינפרין, 0.4% תוסף מדיה התאית P (טבלה של חומרים), 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין rh, 5 מיקרוגרם / מ"ל apo-transferrin, ו 100 ng / mL הידרוקורטיזון hemisuccinate ב collagen-1 מצופה צלוחיות תרבית (18 מ"ל ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית).
- שנה את התווך בצלוחיות כל 2-3 ימים על ידי הסרת התווך לאחר שהתאים גדלים ל~ 80% מפגש. מוסיפים תמיסת דיסוציאציה ללא פנול אדום ודוגרים על הבקבוק בטמפרטורה של 37°C עד לניתוק מלא של התאים. נטרל את תמיסת הדיסוציאציה עם DMEM/F12....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
גודל תא
HCECs הראשוניים והמונצחים הודגמו באמצעות שלושה צבעים פלואורסצנטיים, המשקפים שלושה שלבים שונים של קיום התא. תאים חיים הם ירוקים (calcein-AM), תאים מתים הם אדומים (ethidium homodimer-1), ותאים אפופטוטיים הם צהובים (annexin V-מחשב מותאם צבע עבור הדמיה טובה יותר של אות פלואורסצנטי). תאים חיים מכילים אסטראזות בציטופלסמה של התא וממירים קלצאין-AM לקלצאין. לתאים מתים יש קרומי תאים חדירים לאתידיום הומודימר-1. לתאים אפופטוטיים יש כתמים בקרום התא מכיוון שפוספטידיל-סרין מועבר לקרום החיצוני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הוערכו הבדלים פוטנציאליים בשימוש בשני סוגים של HCEC. התאים מוקמו באותו תווך (HOEM) בריכוזים זהים של תאים ולאחר מכן נחשפו לפרקי זמן קצרים וארוכים של קרינת UV ושלושה רעלנים עיניים. מינונים של קרינת UV וכימיקלים נבחרו על סמך ההשפעות הפיזיולוגיות שלהם, שהיו מזיקות מספיק לתאים כדי לייצר תגובות ביניים שניתן להשוות. זמני חשיפה של 5 ו-20 דקות לקרינת UV ו-5 ו-15 דקות למינונים שנבחרו של BAK (0.001%), SDS (0.0025%) ו-H 2 O2(0.01%) היו זמני חשיפה אידיאליים וריכוזים שהראו תגובות שונות באופן משמעותי בין התאים לבי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחבר, לינדון ו. ג'ונס, במהלך 3 השנים האחרונות, באמצעות CORE, קיבל תמיכה במחקר או הרצאות כבוד מהחברות הבאות: Alcon, Allergan, Allied Innovations, Aurinia Pharma, BHVI, CooperVision, GL Chemtec, i-Med Pharma, J&J Vision, Lubris, Menicon, Nature's Way, Novartis, Ophtecs, Ote Pharma, PS Therapy, Santen, Shire, SightGlass SightSage ו- Visioneering. לינדון ג'ונס הוא גם יועץ ו/או מכהן בוועדה מייעצת עבור Alcon, CooperVision, J&J Vision, Novartis ו-Ophtecs. למחברים האחרים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים לא קיבלו מימון לעבודה זו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 75 ס"מ2 קורנינג בקבוק מאוורר | 354485 | זהו המותג BioCoat, מצופה קולגן | |
| 96 צלחת | באר costar | 3370 | |
| alamarBlue | Fisher Scientific | dal 1025 | |
| Annexin Staining Buffer Solution | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| Annexin V | Invitrogen, Burlington, ON, מיקרוסקופ קנדה | ||
| Axiovert 100 עם מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי Zeiss 510 מערכת | Carl Zeiss Inc., גרמניה | ||
| קורנינג 48 צלחות באר | קורנינג | 354505 | זהו המותג BioCoat, מצופה קולגן |
| Cytation 5 | BioTek | CYT5MPV | יכול לקרוא פלואורסצנטיות מ-280 - 700 ננומטר (לבדיקה 540/590) |
| היקון | סרום בקר עובריSH30396.03 | ||
| כיסויי תחתית זכוכית | תאגיד MatTek, אשלנד, מסצ'וסטס, ארה"ב | ||
| תאי אפיתל קרנית אנושיים | אוטווה | N/A | SV40 אימורטליים תאי אפיתל קרנית אנושיים מד"ר מ. גריפית (מכון מחקר העיניים של אוטווה, אוטווה, קנדה) ואופיינו גריפית M, אוסבורן R, מונגר R, שיונג X, דוילון CJ, לייקוק NL, חכים M, סונג Y, ווטסקי MA. מקבילות קרנית אנושיות פונקציונליות הבנויות מקווי תאים. מדע. 1999;286:2169-72. |
| אמצעי אפיתל עיניים אנושי (HOEM) עם התוספים הבאים: | Millipore, Billerica, MA, ארה" | SCMC001 | Epigro Base Media בתוספת 6 מ"מ L-גלוטמין, 0.002% EpiFactor O (תוסף מדיה תאית O במאמר) , 1.0 μ M אפינפרין, 0.4% אפיפקטור P (תוסף מדיה תאית P במאמר), 5 μ g/mL rh אינסולין, 5 μ גרם/מ"ל אפו-טרנספרין, ו-100 ננוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון המיסוקצינט בצלוחיות תרבית מצופות קולגן-1 (BioCoat, Corning, Tewksbury, MA, ארה"ב). |
| Live Dead calcien and ethidium homodimer | Invitrogen, Burlington, ON, Canada | ||
| MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument | Rockville, MD, ארה"ב | ||
| MSD Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay | Rockville, MD, ארה"ב | ||
| פניצילין סטרפטומיצין | Gibco | 15140-122 | ריכוז פי 100 אז הוסף 1 מ"ל לכל 99 מ"ל של מדיה |
| תאי אפיתל ראשוניים בקרנית | Millipore, Billerica, MA, ארה"ב | SCCE016 | |
| קורא צלחות פלואורסצנטי SpectraMax רב בארות | מכשירים מולקולריים, Sunnyvale, CA, ארה"ב | ||
| TrypLE Express (פתרון ניתוק תאים) | Fisher Scientific | 12605036 |
מקורות
- McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro. Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).
- Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
