פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
פרוטוקולים מפורטים שלב אחר שלב מתוארים כאן לחקר אותות מכניים במבחנה באמצעות תאי פסגה עצביים O9-1 רב-תכליתיים והידרוגלים פוליאקרילמידים בעלי קשיחות משתנה.
תאי ציצית עצבית (NCCs) הם תאים רב-תכליתיים עובריים בעלי חוליות שיכולים לנדוד ולהבדיל למגוון רחב של סוגי תאים המעוררים איברים ורקמות שונים. נוקשות רקמות מייצרת כוח מכני, סימן פיזי הממלא תפקיד קריטי בבידול NCC; עם זאת, המנגנון עדיין לא ברור. השיטה המתוארת כאן מספקת מידע מפורט עבור הדור הממוטב של הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה, מדידה מדויקת של נוקשות כזו, ואת ההערכה של ההשפעה של אותות מכניים בתאי O9-1, קו NCC המחקה ב NCCs vivo.
נוקשות הידרוג'ל נמדדה באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) והצביעה על רמות נוקשות שונות בהתאם. O9-1 NCCs תרבית על הידרוג'לים של נוקשות משתנה הראה מורפולוגיה תאים שונים ביטוי גנים של סיבי מתח, אשר הצביעו על השפעות ביולוגיות שונות הנגרמות על ידי שינויים באותות מכניים. יתר על כן, זה קבע כי שינוי נוקשות הידרוג'ל הביא מערכת במבחנה יעילה כדי לתפעל איתות מכני על ידי שינוי נוקשות ג'ל וניתוח הרגולציה המולקולרית והגנטית ב NCCs. O9-1 NCCs יכול להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים תחת השפעת מדיית הבידול המתאימה, וזה נוח לתפעל אותות כימיים במבחנה. לכן, מערכת במבחנה זו היא כלי רב עוצמה לחקור את התפקיד של איתות מכני ב- NCCs ואת האינטראקציה שלה עם אותות כימיים, אשר יסייע לחוקרים להבין טוב יותר את המנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות ציצית עצבית ומחלות.
תאי ציצית עצבית (NCCs) הם קבוצה של תאי גזע במהלך עובר חוליות עם יכולת יוצאת דופן לנדוד ולתרום להתפתחות של איברים ורקמות שונים. NCCs יכול להבדיל לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים חושיים, סחוס, עצם, מלנוציטים ותאי שריר חלקים, בהתאם למיקום המקור האקסיאלי וההדרכה הסביבתית המקומית של NCC1,2. עם היכולת להבדיל למגוון רחב של סוגי תאים, חריגות גנטיות הגורמות לדיסרגציה בכל שלב של התפתחות פסגת עצבים (NC) יכולות להוביל למחלות מולדות רבות2. לדוגמה, הפרעות במהלך היווצרות, הגירה, ופיתוח של NCCs להוביל להפרעות התפתחותיות המכונה באופן קולקטיבי נוירוקריסטופתיות1,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. הכנת הידרוג'ל
הערה: כל השלבים חייבים להתבצע במכסה המנוע של תרבית התא שחוטא באתנול וחיטוי אולטרה סגול (UV) לפני השימוש כדי לשמור על סטריליות. כלים, כגון פינצטה ופיפטות, חייבים להיות מרוססים באתנול. פתרונות מאגר חייבים להיות גם מסוננים סטריליים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הכנת הידרוג'ל והערכת נוקשות באמצעות AFM ומודל הרץ
כאן, פרוטוקול מפורט מסופק כדי ליצור הידרוג'לים polyacrylamide של נוקשות משתנה על ידי ויסות היחס של אקרילאמיד וביס-אקרילאמיד. עם זאת, הידרוג'לים polyacrylamide אינם מוכנים להידבקות של תאים בשל היעדר חלבוני ECM. לכן, סולפו-SANPAH, הפועל כמקשר, נקשר באופן קוולנטי להידרוג'ל ומגיב עם האמינים העיקריים של חלבוני ECM כדי לאפשר הידבקות של חלבוני ECM למשטחי ההידרוג'ל באמצעות אסתר N-hydroxysuccinimide בסולפו-SANPAH לאחר הפעלת UV. סוג קולגן הייתי בשימוש כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מטרת המחקר הנוכחי היא לספק מערכת במבחנה יעילה ויעילה כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של אותות מכניים ב- NCCs. בנוסף בעקבות הפרוטוקול צעד אחר צעד שהוזכר לעיל, החוקרים צריכים לזכור כי התרבות התאית של O9-1 NCCs מושפעת מסוג כיסויי זכוכית המשמשים להכנת הידרוג'ל. לדוגמה, צוין כי תאים שנזרעו על סוג מסוים של כיסוי זכוכית (ראה טבלת החומרים) שרדו והתרבו היטב, בעוד תאים בתרבית שנזרעו על סוגים אחרים של כיסויי זכוכית הראו יותר מוות של תאים. יתר על כן, חשוב לעקוב בקפדנות אחר תנאי תרבית התא הנכונים עבור O9-1 NCCs.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
אנו מודים לד"ר אנה-מריה זסקה, מפעילת מתקן הליבה של הכוח האטומי מיקרוסקופ-UT במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס, על המומחיות שנתרמה ב- AFM בפרויקט זה. אנו מודים גם למקורות המימון של המכונים הלאומיים לבריאות (K01DE026561, R03DE025873, R01DE029014, R56HL142704 ו- R01HL142704 לג'יי וואנג).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 12 מ"מ #1 קורנינג 0211 כיסוי זכוכית | Chemglass מדעי החיים | CLS-1763-012 | |
| 2% ביס-אקרילאמיד | סיגמא אולדריץ' | M1533 | |
| צלחת 24 בארות | גריינר ביו-וואן | 662165 | |
| 25 מ"מ #1 קורנינג 0211 כיסוי זכוכית | Chemglass מדעי החיים | CLS-1763-025 | |
| 3-אמינופרופיל טריאתוקסיסילן (APTS) | סיגמא אולדריץ' | A3648 | |
| צלחת תרבית תאים 4 בארות | Thermo Scientific | 179830 | |
| 4% Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | J61899-AP | |
| 40% אקרילאמיד | סיגמא אולדריץ' | A4058 | |
| 50% גלוטראלדהיד | סיגמא אולדריץ' | G7651 | |
| צלחת תרבית תאים 6 בארות | גריינר ביו-וואן | 657160 | |
| שלוחה AFM (חרוז כדורי) | תוכנת Novascan | ||
| AFM | Catalyst NanoScope | דגם: 8.15 SR3R1 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher | A12379 | |
| אמוניום פרסולפט (APS) | אבקת Sigma Aldrich | ||
| 248614 אנטי-AP-2α נוגדן | Santa Cruz | sc-12726 | |
| נוגדן נגד וינקולין | Abcam | ab129002 | |
| מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) זרז ביוסקופ | Bruker Corporation | ||
| קולגן מסוג I (100 מ"ג) | קורנינג | 354236 | |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | תרמו פישר | D1306 | |
| דיכלורומתילסילן (DCMS) | סיגמא אולדריץ' | 440272 | |
| סרום חמור | סיגמא אולדריץ' | D9663 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-017-CV | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Leica | דגם DMi8 | |
| Fluoromount-G הרכבה בינוני | SouthernBiotech | 0100-35 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | אבקת |
| סרום סוס | קורנינג | 35-030-CI | |
| iScript שעתוק הפוך Supermix | Bio-Rad | 1708841 | |
| אנטיביוטיקה פניצילין-סטרפטומיצין | תרמו פישר | 15140148 | |
| RNeasy מיקרו קיט | Qiagen | 74004 | |
| סטרילי 1x PBS | Hyclone | SH30256.02 | |
| מים סטריליים נטולי יונים | Hardy Diagnostics | U284 | |
| sulfo-SANPAH | Thermo Fisher | 22589 | |
| SYBR ירוק | יישומי ביוסיסטמס | 4472908 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| טווין 20 | סיגמא אולדריץ' | P9416 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה