מאמר שיטה

piggyBac טרנספוסאז בתיווך טרנספורמציה נבטים בתולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda

DOI:

10.3791/62714

⸱

23 בספטמבר 2021

 , 
1Department of Entomology, College of Agriculture, Food and Environment, University of Kentucky

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טרנספורמציה נבט מוצלחת תולעת צבא הסתיו, Spodoptera frugiperda, הושג באמצעות mRNA של piggyBac היפראקטיבי transposase.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

החדרה יציבה של מטען גנטי לגנומי חרקים באמצעות אלמנטים הניתנים להחלפה היא כלי רב עוצמה למחקרים גנומיים פונקציונליים ולפיתוח אסטרטגיות לניהול מזיקים גנטיים. האלמנט הנפוץ ביותר לשינוי חרקים הוא piggyBac, ושינוי נבטים מבוסס piggyBacנערך בהצלחה בחרקים לדוגמה. עם זאת, עדיין קשה להשתמש בטכנולוגיה זו בחרקים שאינם מודל הכוללים מזיקים חקלאיים. מאמר זה מדווח על טרנספורמציה נבט של מזיק חקלאי גלובלי, תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, באמצעות piggyBac transposase היפראקטיבי (hyPBase).

בעבודה זו, ה- hyPBase mRNA יוצר ושימש במקום פלסמיד עוזר במיקרו-בייג'ציות עובריות. שינוי זה הוביל לדור המוצלח של FAW מהונדס. יתר על כן, מתוארים גם שיטות הסינון של בעלי חיים מהונדסים, זיהוי מהיר מבוסס PCR של החדרת טרנסג'נים וקביעה אסימטרית תרמית של PCR (TAIL-PCR) של אתר האינטגרציה. לפיכך, מאמר זה מציג פרוטוקול לייצור FAW מהונדס, אשר יקל על transgenesis מבוסס piggyBacב- FAW וחרקים לפידופטרנים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תולעת צבא הסתיו (FAW), Spodoptera frugiperda, היא ילידת אזורים טרופיים וסובטרופיים של אמריקה. נכון לעכשיו, זהו אוכל עשב חרקים הרסני ביותר מ -100 מדינות ברחבי העולם1. זחלי FAW ניזונים מיותר מ־350 צמחים מארחים, כולל כמה גידולי מזון חשובים2. יכולת ההגירה החזקה של בוגרי FAW תורמת להתפשטות המהירה האחרונה שלה מיבשת אמריקה למקומות אחרים1,2. כתוצאה מכך, חרק זה מאיים כעת על ביטחון המזון ברחבי העולם. יישום טכנולוגיות חדשות עשוי להקל על מחקרים מתקדמים ב- FAW ולספק אסטרטגיות חדשניות לניהול מזיק זה.

שינוי חיידקי חרקים שימש לחקר תפקוד הגנים ולייצור חרקים מהונדסים לשימוש בשליטה גנטית3,4. בין השיטות השונות המשמשות להשגת טרנספורמציה גנטית בחרקים, השיטה המבוססת על אלמנט piggyBac היא השיטה הנפוצה ביותר5. עם זאת, בשל השיעור הנמוך של טרנספוזיציה, זה עדיין מאתגר לנהל טרנסגנזה בחרקים שאינם מודל. לאחרונה, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase (hyPBase) פותחה6,7. טרנספורמציה Germline הושגה לאחרונה FAW8, שהוא הדו"ח הראשון שהשתמש hyPBase חרקים lepidopteran. בדו"ח זה, מידע מפורט על שימוש hyPBase mRNA ביצירת FAW מהונדס מתואר. השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מיושמת כדי להשיג את השינוי של חרקים lepidopteran אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA

הערה: רצף הקידוד המלא של רצף hyPBase היה מסונתז והוכנס לווקטור pTD1-Cas9 (ראה טבלת החומרים) כדי לייצר את מבנה בסיס ה- pTD1-hyPBase, המכיל קלטת הבעת hyPBase, מקדם T7: פוליהדרין-5' UTR: hyPBase: polyhedrin-3' UTR: poly (A). הרצף המלא של מבנה pTD1-hyPBase מסופק בחומר המשלים.

  1. הכנת התבנית לסינתזה במבחנה
    1. בצע תגובת PCR כדי להגביר את הקלטת המביעה hyPBase באמצעות פריימר קדמי, 5'- atgctgtgaaataccgcacagatgcg-3', ו- פריימר הפוך 5'- tagaggccccaaggttatgtctag-3', פולימראז בעל נאמנות גבוהה ו- pTD1-hyPBase plasmid כתבנית.
      הערה: תגובת PCR (נפח סופי של 50 μL) מכיל 5.0 μL של 10x חיץ תגובה, 4.0 μL של 10 mM deoxynucleoside טריפוספט (dNTP), 1.0 μL של plasmid (50 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL של פולימראז אמינות גבוהה, 1.0 μL כל אחד של 10 מיקרומטר קדימה והפוך פריימרים, ו 33 μL של מים ללא נוקלאז. ההגדרות היו כדלקמן: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) במשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 98 °C (50 °F) במשך 10 מעלות צלזיוס, 60 °C (70 °F) במשך 15 °C (68 °F) למשך 2 דקות.
    2. בדוק את מוצר PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V טריס אצטט-אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (TAE) חוצץ במשך 30 דקות לטהר את המוצר עם ערכת החילוץ ג'ל.
      הערה: אין להשתמש בערכת טיהור המוצר PCR. אפילו כמות זעירה של pTD1-hyPBase plasmid מקטין באופן משמעותי את היעילות של סינתזה במבחנה.
  2. סינתזה במבחנה של hyPBase mRNA באמצעות ערכה מסחרית
    1. להפשיר לחלוטין את הריאגנטים הקפואים, לשמור את האנזים ואת תמיסת 2x NTP /CAP על קרח, ולהשאיר את חיץ תגובה 10x מופשר בטמפרטורת החדר.
    2. להרכיב את התגובה בטמפרטורת החדר על ידי הוספת הרכיבים הבאים: פתרון 2x NTP / CAP: 10 μL; מאגר תגובה 10x: 2 μL; DNA תבנית: 0.1-0.2 מיקרוגרם; תערובת אנזימים: 2 μL; מים ללא נוקלאז עד 20 μL.
    3. מערבבים את הריאגנטים ביסודיות על ידי צנרת עדינה של התערובת למעלה ולמטה ודגרה ב 37 °C (2-4 שעות).
  3. התאוששות של mRNA מסונתז על ידי משקעים ליתיום כלוריד
    1. הוסף 30 μL של פתרון משקעים LiCl, לערבב ביסודיות על ידי הבהוב הצינור, ולאחר מכן לשמור על -20 °C (50 °F) במשך ≥ 30 דקות.
    2. צנטריפוגה ב 4 °C (5 °F) במשך 15 דקות במהירות המרבית, ולהסיר בזהירות את supernatant.
    3. לשטוף את הכדור פעם אחת עם 1 מ"ל של 70% אתנול, מחדש צנטריפוגה, ולהסיר את supernatant בזהירות.
    4. יבש את הכדור בטמפרטורת החדר במשך 1-2 דקות, ולאחר מכן resuspend הכדור עם 20-40 μL של מים ללא נוקלאז.
    5. לדלל 1 μL של פתרון mRNA עם 9 μL של מים ללא נוקלאז. קח 2 μL כדי לקבוע את ריכוז mRNA ולהשתמש 8 μL כדי לבדוק את איכות mRNA על ג'ל אגרוז 1% ב 100 V במאגר TAE טרי במשך 40 דקות.
    6. Aliquot פתרון mRNA ולאחסן קפוא ב -70 °C (70 °F) עד שנה אחת.
      הערה: אין לייבש לחלוטין את גלולה mRNA; זה עלול להיות קשה יותר להמיס אותו במים.

2. מיקרו-ינון

  1. אוסף ביצים
    1. מניחים 12 גלמים זכרים ו-12 גלמים נשיים בקופסה 15 ס"מ על 15 ס"מ על 10 ס"מ. מכסים את הקופסה במגבת נייר. מניחים 10% תמיסת סוכרוז בתיבה להאכלת מבוגרים.
    2. ביום 2 לאחר העיקול, לחשוף את המבוגרים לאור אינטנסיבי לילה.
    3. ביום 3 לאחר העיקול, העבירו את המבוגרים מצעד 2.1.2 למקום חשוך. לאסוף את העוברים בתוך 2 שעות לאחר oviposition.
    4. מוסיפים טיפות מים לחתיכת מגבת נייר עם ביצים טריות שנשמרות בצלחת פטרי על קרח. מעבירים את הביצים בעדינות למגלשת זכוכית עם מברשת עדינה ומיישרים אותן אחת אחת על מגלשת זכוכית. שמור את שקופיות הזכוכית עם הביצים המיושרות על קרח לפני microinjection.
  2. הגדרת מיקרו-ערך
    1. הזריקו תערובת של חלבון פלואורסצנטי ירוק מהונדס (EGFP) המבטא פלסמיד (200 ננוגרם/μL), pBac: hr5ie1-EGFP-SV40, hyPBase mRNA (200 ננוגרם/ μL), ומים מזוקקים סטריליים לתוך הביצים,תוך שימוש בלחץ הפיצוי של המיקרו-נג'ר האוטומטי (ראה טבלת החומרים ).
    2. שמור את הביצים המוזרקות ב 27 ± 1 °C (60),60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
    3. האכילו את הזחלים בקעו בדיאטה מלאכותית, והעבירו כל זחל לכוס אחת קטנה בשלב ה-instar המוקדם שלה-3 (באורך של כ-6 מ"מ, וצבע הגוף הופך לשחור).

3. סינון פלואורסצנטיות ומעבר גנטי

  1. לאסוף את הגולם ומניחים ~ 150 גלמים נקבה ~ 150 גולם זכר בכלוב 35 ס"מ x 35 ס"מ x 35 ס"מ. לתלות כמה חתיכות של מגבות נייר (~ 30 ס"מ x 15 ס"מ) בכלוב כדי לאסוף את הביצים.
  2. לאסוף את מגבות הנייר עם ביצים מדי יום, ולשמור את הביצים ב 27 ± 1 °C (60°F), 60 ± 10% לחות יחסית עד הבקיעה.
  3. שמור את זחלי ניאון ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות כדי לשתק אותם, ולאחר מכן להעביר אותם על צלחת קרה כקרח.
  4. מסך זחלי ניאון משותקים תחת סטריאופיקום פלואורסצנטי. בחר את יילודים חיוביים EGFP, להעלות אותם לשלב הגועל ב ~ 2 שבועות ב 27 ± 1 °C (50 °F), ולהפריד אותם על ידי סקס על פי הבדלי פנוטיפ בקטעי הבטן הגחון.
    הערה: הגולם הנשי יש פתח איברי מין דמוי חריץ על קטע הבטן השמיני ואת השוליים cephalic של החלקים התשיעי והעשירי מתעקל לכיוון פתח איברי המין. פתיחת איברי המין של הגולם הגברי יש עלייה קלה על קטע הבטן התשיעי.
  5. מניחים את הגולם החיובי EGFP ואת הגולם הפראי של המין השני בזכר: יחס נשי של 1:1 בכלוב. Sib לחצות את המבוגרים ביטוי EGFP לייצר את הדורות הבאים.

4. זיהוי PCR של החדרה מהונדסת

  1. לחלץ DNA גנומי מן הסוג הפראי EGFP חיובי זחלים בודדים באמצעות כל ערכת מיצוי DNA גנומי מסחרי בעקבות הוראות היצרן.
  2. ביצוע תגובת PCR באמצעות ה- DNA הגנומי כתבנית; פריימר קדמי, 5'- acgtacgctcctcgtgttccgttc-3' הממוקם באזור האמרגן ie1; פריימר הפוך, 5'- aagcactgcacgegtaggtcag-3' הממוקם באזור EGFP של וקטור הטרנספורמציה.
  3. הגדר כל תגובת PCR (נפח סופי של 40 μL) כדי להכיל 20 μL של תערובת פולימראז, 1.0 μL של DNA גנומי (40 מיקרוגרם / μL), 1.0 μL כל אחד של 10 μM קדימה ופריימרים הפוכים, ו 17 μL של מים ללא נוקלאז. השתמש בהגדרות הבאות: דגירה ראשונית של 95 °C (70 °F) למשך 3 דקות, ואחריו 35 מחזורים של 95 °C (70 °F) עבור 20 s, 56 °C (56 °F) עבור 20 s ו 68 °C (70 °F) עבור 40 מעלות צלזיוס.
  4. בדוק את מוצרי PCR על ג'ל אגרוז 1% ב 120 V במשך 30 דקות.

5. קביעת אתר ההחדרה הטרנסגני

  1. בצעו TAIL-PCR ביעילות גבוהה באמצעות DNA גנומי כתבנית לקביעת אתר האינטגרציה של החדרת טרנסג'נים בחרקים החיוביים ל- EGFP.
    1. בצע את תגובות PCR בעקבות השלבים המתוארים במקום אחר9.
      1. השתמש בשלושה פריימרים, P1: 5'-atcagtgtacacttaccgcattgacaagcacgcc-3', P2: 5'-tcacgggagctccaagcggcgactg-3', ו- P3: 5'-atgtcctaaatgcacagcgatcgcgct-3', הספציפיים לווקטור piggyBac, בשלושת הסיבובים של תגובת PCR, בהתאמה.
  2. רצף את מוצרי ה- PCR הסופיים כדי לקבוע את אתר האינטגרציה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מבנה לביטוי של מקדם T7 המכיל hyPBase: polyhedrin-5'UTR: hyPBase: polyhedrin-3'UTR: אות פולי (A) נוצר (איור 1A) והוגבר כשבר PCR ~ 2.2 kb כדי לסנתז hyPBase mRNA במבחנה (איור 1B). לאחר מכן, ה- hyPBase mRNA יוצר ונחשף לאלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. ה- mRNA בגודל הצפוי (כ- 1.1 kb band) זוהה על ג'ל אגרוז 1% (איור 1C).

לאחר מכן הוכן מבנה ביטוי EGFP המבוסס על piggyBac(איור 2A).<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיעור הנמוך של טרנספוזיציה וקושי בהעברת רכיבים מהונדסים לעוברים טריים מגבילים את ההצלחה של טרנספורמציה נבטים בחרקים רבים שאינם מודל, במיוחד אלה מהסדר, לפידופטרה. כדי להגדיל את קצב הטרנספורמציה של חיידקים, גרסה היפראקטיבית של piggyBac transposase הנפוץ ביותר (hyPBase)פותחה 7,10. עד כה, טרנספורמציה חיידקית מוצלחת חרקים lepidopteran מדווח בעיקר במודל תולעת משי חרקים, Bombyx מורי11. עם זאת, ביצוע עבודות טרנסגנזה בחרקים לפידו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שדווח נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע I/UCRC, המרכז לטכנולוגיות ניהול פרוקי רגליים, תחת Grant No IIP-1821936 ועל ידי שותפים בתעשייה, חקלאות ויוזמת מחקר מזון מענק תחרותי מס ' 2019-67013-29351 והמכון הלאומי למזון וחקלאות, משרד החקלאות האמריקאי (2019-67013-29351 ו- 2353057000).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 אינץ' לחמניות כותנה דנטליותPlastCare ארה"ב8542025591מכסי
סופלה 1 גרםDARTPL1N
1 oz כוסות סופלהDARTP100Nמעדנייה
48 אונקיות מיכלי מעדנייה מפלסטיקGenpackAD48
מסנני תוסף (ירוק)NightSea LLCSFA-BLFS-GRהקרנה
מכשירי סאטרזכוכית בורוסיליקטBF100-50-10הזרקת
זכוכית בורוסיליקטמכשיר סאטרBF-100-50-10
ניתוח היקףניקוןSMZ745Tהקרנה
מלקחיים במשקל נוצהBioQuip4750
מגן מרזב מגן מרזבThermWell מוצריVX620
היפוך מיקרוסקופאולימפוסIX71הזרקת
מיקרו-מזרקNarishigeIM-300הזרקת
חולץ מיקרופיפטהמכשירי סאטרP-1000הזרקת
מיקרוסקופ שקופיותVWR16004-22הזרקה
NightSea מערכת מלאהNightSea LLCSFA-RB-DIMהקרנת
גז חנקןAWG/ סקוט-גרוסNI 225הזרקת
מגבות ניירבאונטי  43217-45074REARING
Spodoptera frugiperda תזונה מלאכותיתSouthland Products, IncN/A [בקשת מין/כמות]REARING
em>Spodoptera frugiperda EggsBenzon Research, IncN/A [בקשת מין/כמות]REARING
Taq MasterMixתערובת פולימראז
סט <

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
  2. Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
  3. Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513(2015).
  4. Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
  5. Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
  6. Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534(2018).
  7. Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
  8. Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
  9. Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
  10. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  11. Xu, H., O'Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487(2015).
  12. Wu, S. C. -Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  13. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
  14. Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
  15. Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

EGFP

מאמרים קשורים