מודל מכרסם איסכמי שלם של קרום הלב

סיכום

פרוטוקול זה מתווה את השלבים לגרימת אוטם שריר הלב בעכברים תוך שמירה על קרום הלב ותכולתו.

תקציר

פרוטוקול זה הראה כי קרום הלב ותכולתו ממלאים תפקיד אנטי-פיברוטי חיוני במודל המכרסם האיסכמי (קשירה כלילית לגרימת פגיעה בשריר הלב). רוב המודלים הפרה-קליניים של אוטם שריר הלב דורשים הפרעה של שלמות קרום הלב עם אובדן הסביבה התאית ההומיאוסטטית. עם זאת, לאחרונה פותחה על ידינו מתודולוגיה כדי לגרום לאוטם שריר הלב, אשר ממזער נזק קרום הלב ושומר על אוכלוסיית תאי החיסון של הלב. נצפתה התאוששות תפקודית לבבית משופרת בעכברים עם חלל קרום הלב שלם לאחר קשירה כלילית. שיטה זו מספקת הזדמנות לחקור תגובות דלקתיות בחלל קרום הלב לאחר אוטם שריר הלב. פיתוח נוסף של טכניקות התיוג יכול להיות משולב עם מודל זה כדי להבין את גורלם ותפקודם של תאי מערכת החיסון קרום הלב בוויסות המנגנונים הדלקתיים המניעים שיפוץ בלב, כולל פיברוזיס.

מבוא

עד היום, מחלות לב וכלי דם (CVD) מוכרות כגורם המוות המוביל בעולם, וכתוצאה מכך נטל כלכלי משמעותי וירידה באיכות החיים של המטופלים¹. מחלת עורקים כליליים (CAD) היא תת-סוג של CVD וממלאת תפקיד חיוני בהתפתחות אוטם שריר הלב (MI), התורם העיקרי לתמותה. בהגדרה, MI נובע מפגיעה בלתי הפיכה ברקמת שריר הלב עקב תנאים ממושכים של איסכמיה והיפוקסיה. רקמת שריר הלב חסרה יכולת התחדשות, ולכן הפציעות הן קבועות וגורמות להחלפת שריר הלב בצלקת פיברוטית שיכולה להגן בתחילה אך בסופו של דבר תורמת לשיפוץ לב שלילי ובסופו של דבר לאי ספיקת לב².

למרות שהטיפול בחולים עם CAD השתפר באופן דרמטי בעשורים האחרונים, אי ספיקת לב כרונית (CHF) משנית לאיסכמיה משפיעה על חולים רבים ברחבי העולם. כדי למנוע ולנהל מגיפה זו, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים באופן נרחב יותר ולפתח גישות טיפוליות חדשות. יתר על כן, ממצאי העבר מדגישים את מגבלות הטיפול המערכתי ואת הצורך בפיתוח חלופות מדויקות. בהתחשב בכך שחקירת ההמשך המולקולרי של MI בבני אדם מושפעת מהיכולת לגשת לרקמות אוטמות, מודלים של בעלי חיים המסכמים את המאפיינים וההתפתחות של MI אנושי ו- CHF הקשורים ל- CVD הם הכרחיים.

מכיוון שמודלים אידיאליים של בעלי חיים דומים מאוד להפרעה אנושית עבור מאפיינים מבניים ותפקודיים, אטיולוגיה של מחלות צריכה להנחות את תפיסתם. ב- CAD, זוהי היצרות טרשת עורקים כרונית של עורקים כליליים או חסימה טרומבוטית חריפה. שיטות שונות פותחו ויושמו במינים שונים של חיות מעבדה כדי לגרום להיצרות או חסימה של עורקים כליליים. ניתן לסווג אסטרטגיות כאלה באופן נרחב לשתי קבוצות: (1) מניפולציה מכנית של עורק כלילי כדי לגרום ל- MI ו- (2) זירוז טרשת עורקים כדי להקל על היצרות כלילית המובילה ל- MI. האסטרטגיה הראשונה כוללת בדרך כלל קשירת עורק כלילי או מיקום של סטנט בתוך העורק. הגישה השנייה נוטה להסתמך על שינוי התזונה של בעל החיים כך שתכלול מזון עתיר שומן/כולסטרול. חלק מהמגבלות של גישה אחרונה זו כוללות את חוסר השליטה על העיתוי והאתר של חסימות כליליות.

לעומת זאת, לאינדוקציה כירורגית של MI או איסכמיה במודל של בעלי חיים יש מספר יתרונות, כגון מיקום, תזמון מדויק והיקף האירוע הכלילי, מה שמוביל לתוצאות הניתנות לשחזור יותר. השיטה הנפוצה ביותר היא קשירה כירורגית של העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי (LAD). מודלים אלה משחזרים תגובות אנושיות לפגיעה איסכמית חריפה, כמו גם את ההתקדמות ל- CHF³. ניתוח LAD בבעלי חיים קטנים כמו מכרסמים, שפותח בתחילה בבעלי חיים גדולים יותר, הפך אפשרי יותר עם התקדמות הטכנולוגיה⁴. בהקמת מודלים כאלה, עכברים הועדפו מסיבות שונות, כולל הזמינות היחסית שלהם, הוצאות נמוכות בדיור, ויכולתם למניפולציה גנטית.

מודלים כירורגיים עכשוויים של מחלת לב איסכמית באמצעות חסימת LAD מחייבים את החוקר לפתוח את קרום הלב כדי ללקות את העורק⁵ באופן זמני או קבוע. אסטרטגיות כאלה גורמות לשיבוש החלל הקרדיותי, הממלא פונקציה מכנית ושימון במהותה כדי להבטיח תפקוד לב תקין. חסרון נוסף בפתיחת קרום הלב הוא אובדן הנוזל הפריקרדיאלי הטבעי של החיה על מרכיביו התאיים והחלבונים השונים ^6,7. בתגובה, פותחה שיטה להשראת MI תוך שמירה על קרום הלב שלם. בנוסף למזעור ההפרעה לסביבה הומאוסטטית זו, גישה זו מאפשרת תיוג ומעקב אחר תאים ספציפיים לאחר גרימת MI. בנוסף, גישה זו מייצגת טוב יותר פגיעה איסכמית שריר הלב בסביבה האנושית.

פרוטוקול

עכברי C57BL/6J זכרים ונקבות בגילאי 8-14 שבועות שימשו לניסויים אלה. פרוטוקול זה קיבל אישור אתי מוועדת הטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי ועוקב אחר כל ההנחיות לטיפול בבעלי חיים.

1. הכנת עכבר וניתוח

1. לעקר כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב).
2. שקול עכבר למשקל טרום ניתוחי ומינון משכך כאבים.
3. הניחו את העכבר בקופסת אינדוקציה עם 4% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.
4. להזריק משכך כאבים תת עורית (0.1 מ"ג / ק"ג של Buprenorphine) (ראה טבלת חומרים).
5. הניחו את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח ושמרו על הרדמה עם 3% איזופלוראן המועבר דרך חרוט האף. יש למרוח משחה אופטלמית כדי למנוע יובש בעיניים בכל עין.
6. לגלח את השיער מאזורי הניתוח של החזה והצוואר.
7. רסנו את כפות העכבר והניחו אותן על שולחן הניתוחים.
8. אינטובציה של העכבר על ידי החדרת קטטר חלק של 23 גרם לתוך קנה הנשימה דרך הפה והלוע.
   1. לאוורר את העכבר לאחר אינטובציה עם 2% איזופלוראן ו-100% חמצן כגז נשא באמצעות מכונת הנשמה מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצב של 110 נשימות לדקה, נפח גאות של 250 μL, ולחץ סופי חיובי (PEEP) של 4 מ"מ כספית.
9. גלגלו את העכבר 30% על צדו הימני כדי למקם את הצד השמאלי של החזה לניתוח.
10. נקו את אזור הניתוח עם 3 פילינגים מתחלפים של 70% אתנול ובטאדין בתנועה מעגלית (ראוטבלת חומרים). הניחו וילונות כירורגיים סטריליים סביב אזור הניתוח.
11. בצע חתך רוחבי של 2-3 ס"מ בעור החזה כדי לדמיין את שרירי החזה בצד שמאל. חותכים את החזה מז'ור ומינור באמצעות חתך של 1 ס"מ מקו האמצע כלפי חוץ כדי לדמיין את השרירים הבין-קוסטליים בין הצלעות השלישית והרביעית.
    הערה: יש להקפיד על מניעת דימום עודף משריר החזה באמצעות צריבה של כלי דם מדממים.
12. בצע חתך של 2 ס"מ בשריר האינטרקוסטלי השמאלי כדי להכניס אוויר (על ידי תנועת אוויר פסיבית) לחלל החזה כדי לאפשר ללב ולריאות ליפול מהחתך הניתוחי. יתר על כן, להרחיב את הפתח בעזרת מכשיר צריבה (ראה טבלת חומרים) כדי להחדיר את intercostal ולמנוע דימום
    הערה: יש להפסיק את מכונת ההנשמה באופן זמני במהלך תקופת הצריבה כדי למנוע תגובות נפיצות עם חמצן. נזהרים שלא לפגוע בשק קרום הלב.
13. באמצעות retractors, לסגת את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
14. התבונן בקרום הלב ובלב הבסיסי תחת סטריאומיקרוסקופ.
    הערה: קרום הלב של העכבר דק מספיק כדי לדמיין את כלי הדם של הלב.
15. מניחים בעדינות מלקחיים על פני קרום הלב כדי להפחית את תנועתו ואת זו של הלב שמתחתיו.
16. ציון חזותי של העורק הכלילי הקדמי השמאלי (LAD) על ידי התחקות אחר הופעתו מתחת לתוספת השמאלית.
17. באמצעות דרייבר המיקרו-מחט, יש להנחות תפר מתאים (ראו טבלת חומרים) דרך קרום הלב, מתחת ל-LAD, כאשר התפר מופיע בצד השני של ה-LAD וקרום הלב. קשרו את התפר כדי להגביל את זרימת הדם דרך העורק הכלילי וחתכו את התפר העודף בעזרת מספריים (איור 1A).
    הערה: עם הגבלת זרימת הדם לעורק הכלילי, יש לראות את החלק הקדמי של החדר השמאלי. הליך זה מייצג מודל קשירת קבוע. עם זאת, ניתן ליישם בשלב זה גם גישת קשירה חולפת עם תקופות איסכמיה שונות.
18. מתחת לאתר החתך בתוך האזור הסטרילי, יש להכניס קטטר 24 גרם מלעורי לחזה (להסיר את מחט המדריך לאחר הכניסה לחלל החזה). לאחר מכן, סגרו את הצלעות ואחריהן את שכבות השרירים והעור באמצעות תפר מתאים (מחט מחודדת לשריר, מחט חיתוך קונבנציונלית לעור).
19. לאחר סגירת החזה, יש לפנות את האוויר שנותר מחלל החזה באמצעות קטטר 24 גרם באמצעות שאיבה עדינה עם מזרק 3 מ"ל ולחיצות חזה. לאחר הסרת האוויר, למשוך את קטטר 24 גרם.
20. הפחיתו את האיזופלוראן ל-1%.
21. כבה את האיזופלורן תוך שמירה על אוורור עם חמצן כדי לאפשר לעכבר להתאושש מההרדמה. ברגע שהחיה מראה סימני נשימה באופן עצמאי, הסר את צינור קנה הנשימה 23 G מהפה והנח את העכבר בכלוב התאוששות כדי להיות במעקב לחידוש הנשימה הרגילה.
22. אפשרו לעכבר להתאושש בכלוב כאשר חלק מהכלוב מונח על כרית חימום כדי לספק מקור חום חיצוני.
23. לספק זריקות תחזוקה של משכך כאבים (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג, תת עורית) כל 12 שעות במשך 72 שעות לאחר הניתוח.
24. עקוב אחר מצבם הבריאותי של עכברים מדי יום במשך 7 ימים, הכולל הערכת חתכים ואי נוחות של בעלי חיים.
    הערה: בשל הפולשנות של הליך זה (thoracotomy), הממשל של אנטיביוטיקה עשוי להיות נחוץ.

2. הערכה תפקודית של תפקוד הלב על ידי אקוקרדיוגרפיה (ECG)

1. השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן.
2. הניחו את העכבר במצב שכיבה על משטח במה מחומם וחברו את הכפות למוליכי האק"ג.
3. לגלח את החזה של העכבר.
4. קבל תמונות אקוקרדיוגרפיה באמצעות בדיקה מתמר ליניארית של 40 MHz וג'ל מגע ונתח באמצעות התוכנה המתאימה (ראה טבלת חומרים).
5. כבו את האיזופלוראן ואפשרו לעכבר להתאושש על משטח החימום לפני החזרת הכלוב למצב פעיל.
   הערה: הערכת אקוקרדיוגרפיה אינה פולשנית ולכן ניתן לבצע אותה לאורך כל הניסוי כדי לקבוע שינויים לפני ואחרי קשירת הכליליה.

3. איסוף רקמות לב לצביעת פיברוזיס

1. הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO₂ ונתחו בזהירות את הלב.
   הערה: באמצעות מספריים ומלקחיים, זה מושג על ידי חיתוך דרך כלי הדם הגדולים הנכנסים (vena cava, וריד ריאתי) ויציאה (עורק ריאתי, אבי העורקים) את הלב כדי לשחרר אותו ממערכת הדם בחלל החזה.
2. לקבע את הלב ב-10% פורמלין למשך 24 שעות לפחות.
3. חתכו דגימות באמצעות סכין גילוח ישר דרך החדר הימני, המחיצה הבין-חדרית והחדר השמאלי, כדי להבטיח שהחתך יעבור דרך מרכז אזור האוטם. לאחר מכן נשלחות דגימות למתקן הליבה להטמעת פרפין.
4. חותכים חלקי רקמה בעובי 5 מיקרומטר עם מיקרוטום ומניחים אותם על שקופיות זכוכית להכתמה.
5. יש לבצע דה-פראפין באמצעות שטיפות קסילן מסחריות ואלכוהול מדורג (2x 99%, 1x 95%, 1x 70%) עם מים שעברו דה-יוניזציה, ולאחר מכן לייבש מחדש.
6. כתם עם 0.1% סיריוס אדום בחומצה פיקרית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר.
7. יש לשטוף חלקים עם 0.5% חומצה אצטית במשך 3 דקות ולשטוף עם 70% אתנול במשך דקה אחת.
8. ייבשו את החלקים באמצעות הסדר ההפוך של שטיפות המתוארות ב-3.4, כאשר ריכוזי האתנול עולים ומדורגים ואז הקסילן.
9. מקטעי רקמת הרכבה עם תמיסת הרכבה (ראה טבלת חומרים) להערכה מיקרוסקופית.

4. זרימה ציטומטריה של שטיפת לב וחלל קרום הלב

1. הקריבו את העכברים בשאיפה של 100% CO₂ כדי להשפיע.
2. הנח את העכבר על גבו וקבע את הידיים והרגליים ללוח ניתוח באמצעות סרט הדבקה.
3. פותחים בזהירות את הצד השמאלי (צד ימין מנקודת המבט של הנסיין) של חלל בית החזה, החל מחיתוך הסרעפת לנקודת האמצע ולאחר מכן חותכים דרך הצלעות החיצוניות לכיוון עצם החזה.
   הערה: הימנעו מניקור של כלי דם גדולים, במיוחד אלה הפועלים במקביל לעצם החזה.
4. החזירו את הצלעות באמצעות המוסטאט כדי לחשוף את הלב התחתון ואת קרום הלב.
   הערה: קרום הלב שביר מאוד, אז הקפד לא לתפוס אותו עם מספריים במהלך החיתוך.
5. באמצעות צינור PE-10 (ראו טבלת חומרים) קטטר המוחדר לחלל קרום הלב בסמוך לצומת האטריום השמאלי והחדר השמאלי, מזריק 100 μL של מי מלח סטריליים לתוך חלל קרום הלב.
   1. אפשר מלח כדי בריכה לאסוף מן הצד האחורי של הלב, נזהר לא לנקב או לקרוע את קרום הלב בתהליך. חזור על שלב זה פעמיים והניח נוזל שטיפה על קרח תוך כדי עיבוד הלב.
6. כריתת הלב על ידי חיתוך כלי הדם העיקריים (אבי העורקים, עורק הריאה, הווריד והווריד הוורידי) הנכנסים ויוצאים מהלב. הסר את האטריה הימנית והשמאלית ושקול את רקמת הלב החדרית.
7. טחנו את הרקמה בחתיכות קטנות של 1 מ"מ² באמצעות מספריים והניחו 10 מ"ל של חיץ עיכול המכיל 450 U/mL של קולגן I, 125 U/mL של קולגן XI, 60 U/mL של DNase I, ו-60 U/mL של היאלורונידאז ב-PBS למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר אורביטלי.
8. מעבירים הומוגניות של רקמת לב דרך מסננת תאים בקוטר 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) ומסתובבים כלפי מטה ב-60 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי להסיר תאים פרנכימליים לבביים.
9. אספו את הסופר-נטנט, עברו דרך מסננת תאים בקוטר 40 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתרחיף של תא בודד, והסתובבו מטה בטמפרטורה של 400 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי לזרוק את התאים.
10. לבצע חסימת קולטן גבישית (Fc) והכתמה של סמנים תאיים על תאי קרום הלב ותאי הלב כפי שתואר קודם^{לכן 8}.
11. הפעל דגימות על ציטומטר זרימה.

5. תיוג מקרופאגים פריקרדיאליים בשיטת הגישה הבין-קוסטלית למרחב הפלאורלי (ICAPS)⁹

1. יש לחטא כלי ניתוח (באמצעות מעקר חרוזים או אוטוקלב) ולרסס 70% אתנול לפני ההתחלה.
2. השרה ותחזק את העכבר תחת הרדמה כללית עם 1.5-2% איזופלוראן ו-800 מ"ל/דקה של חמצן. אשר את מישור ההרדמה על ידי צביטה בהונות והתבוננות בבעל החיים מחוסר רפלקס.
3. להזריק משכך כאבים תת עורית (Buprenorphine 0.1 מ"ג / ק"ג).
4. הנח את העכבר על כרית כירורגית מחוממת במהלך הניתוח.
5. לגלח את אזור החזה האנטרולטרלי הימני.
6. נקו את אזור הניתוח עם אתנול ובטאדין.
7. לעשות חתך באורך 3 ס"מ בעור, ועם מלקחיים לחשוף את כלוב הצלעות.
8. טען 5 μL של חרוזים פלואורסצנטיים (מיקרוספרות פלואורסצנטיות זמינות מסחרית, 1 מיקרומטר, ראו טבלת חומרים) ו-45 μL של מלח לתוך קטטר מזרק צינורות PE-10 עם קצה משופע.
9. יש להנחות את הצנתר לתוך החלל הבין-קוסטלי כפי שתואר קודם^{לכן 9}, להזריק באיטיות את תמיסת החרוז ולהוציא את הצנתר בתנועה אחת.
10. סגור את העור באמצעות סיכות.
    הערה: סיכות משמשות במקום תפרים כדי למזער פתיחה מחדש פוטנציאלית של החתך.
11. כבה את האיזופלורן, הנח את העכבר בכלוב ההתאוששות ועקוב אחר סיבוכים במהלך 24 השעות הראשונות.

תוצאות

מודל קשירה כלילית שונה זה עבר אופטימיזציה כדי להשיג יכולת שכפול והישרדות בעלי חיים. עם זאת, בשל הפגיעה המשמעותית הנגרמת בלב, חלק מהתמותה התוך-ניתוחית והפוסט-ניתוחית הצפויה קשורה להליך. התמותה הסטנדרטית בדרך כלל גבוהה יותר אצל זכרים (~25-35%) מאשר אצל נקבות (~ 10-15%).

אינדוקציה מוצלחת של MI עם קשירת הכליליה המתוקנת צריכה להיות ניכרת על ידי שינויים בפרמטרים התפקודיים של הלב ובתכונות המבניות. עבור תפקוד, ירידה בפרמטרים כגון שבר פליטה של חדר שמאל (LV) כפי שהוערך על ידי אקוקרדיוגרפיה תורגש תוך 3-4...

דיון

גרימת MI בקרום לב סגור במכרסמים היא ייחודית ויכולה להיות בעלת יישומים משמעותיים פוטנציאליים. ההליך מסתמך במידה רבה על היכרותו של המנתח עם דגם המכרסם ועם אנטומיית הלב של המכרסמים. ההצלחה תלויה גם בטיפול שניתן במהלך שלושה שלבים קריטיים: חתך שריר אינטרקוסטלי ונסיגת צלעות (שלבים 1.11-1.13), יצירת אוטם (שלב 1.17 ), והתאוששות בעלי חיים (שלבים 1.22-1.24).

בית החזה חייב להיעשות בחריצות כדי למנוע ניקוב או שרוך קרום הלב. השלב המכריע ביותר בפרוטוקול זה הוא תפירת ה-LAD כדי לגרום לאוטם. כמו בכל מודלי הקשיר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Steri-350 מעקר חרוזים	Inotech	NC9449759
10% פורמלין Millipore	Sigma	HT501128-4L
40 ומיקרו; מסננת תאים m	VWR	CA21008-949	פלקון, 352340
70 ומיקרו; מסננת תאים m	VWR	CA21008-952	פלקון, 352350
ACK מאגר ליזה	תרמו פישר	A1049201
BD Insyte-W מחט קטטר 24 גרם X 3/4 אינץ'	CDMV Inc	108778
בטדין (תמיסה מקומית של 10% פובידון-יוד)	CDMV Inc	104826
מלקחיים קהים	כלים מדעיים עדינים	FST 11000-12
BNP משחת עיניים	CDMV Inc	17909
Castroviejo מחט נהג	Fine Science Tools	FST 12061-01
צנטריפוגה 5810R	Eppendorf	22625101
קולגנאז I	Millipore Sigma	SCR103
קולגנאז XI	Millipore Sigma	C7657
Covidien 5-0 Polysorb תפר - מחט מתחדדת CV-11	מדטרוניק קנדה	GL-890
Covidien 5-0 תפר פוליסורב - מחט חיתוך PC-13	מדטרוניק קנדה	SL-1659
מלקחיים קהים מעוקלים	כלי מדע עדינים	FST 11009-13
Dako הרכבה בינונית	Agilen	CS70330-2
DNase I	Millipore Sigma	11284932001
אתנול, 100%	Millipore סיגמא	MFCD00003568
אתיקון 8-0 תפר אתילון - BV-130-4 מחט מחודדת	Johnson & ג'ונסון בע"מ	2815G
סיבים אופטיים אור	ניקון	2208502
מלקחיים עדינים	כלי מדע עדינים	FST 11150-10
Fluoresbrite® YG קרבוקסילט מיקרוספירות 1.00 ומיקרו; מ	פוליסיינסס בע"מ	15702
גייגר יחידת קאטריה	תרמית מכשירי דיוק עולמיים	501293	דגם 150-ST
Hyaluronidase	Millipore Sigma	H4272
מכשיר אידוי איזופלואורן	הרווארד	75-0951
איזופלורן USP, 250 מ"ל	CDMV Inc	108737
מערכת נסיגה מגנטית מקבע	מדעיים עדינים	18200-20
MX550D- בדיקה 40 מגה-הרץ	Fujifilm- Visual Sonics
Needle	Driver Fine Science	Tools FST 12002-12
PE-10 Tubing	Braintree Scienctific, Inc.	PE10 50 FT
מספריים	כלי מדע עדינים	FST 14184-09
SMZ-1B מיקרוסקופ סטריאו	ניקון	SMZ1-PS
VentElite מאוורר בעלי חיים קטנים	הרווארד מכשיר	55-7040
וטרינרי (10 מ"ל, 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין))	CDMV Inc	124918	תרופה מבוקרת
Vevo 2100 תוכנה	Fujifilm-Visual סוניקס