פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הקלטה של מערך Microelectrode של קצב הירי של צמת Sinoatrial כדי לזהות פגמים מהותיים בקצב הלב בעכברים
במאמר זה
סיכום
תקציר
צומת sinoatrial (SAN), הממוקם באטריום הימני, מכיל את תאי קוצב הלב, וחוסר תפקוד של אזור זה יכול לגרום טכיקרדיה או ברדיקרדיה. זיהוי אמין של פגמים בקצב הלב דורש מדידה של קצב לב מהותי על ידי מניעת ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית, אשר יכול להסוות ליקויים בקצב. שיטות מסורתיות לניתוח תפקוד קוצב לב מהותי כוללות מצור אוטונומי המושרה על ידי סמים כדי למדוד את קצב הלב vivo, הקלטות לב מבודדות כדי למדוד קצב לב מהותי, ורצועת sinoatrial או הקלטות תיקון-מהדק תא יחיד של תאי קוצב לב sinoatrial כדי למדוד פעולה ספונטנית שיעורי ירי פוטנציאליים. עם זאת, טכניקות מסורתיות יותר אלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית וקשה לביצוע. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי על ידי ביצוע מערך microelectrode (MEA) הקלטות של תכשירי צומת sinoatrial הר שלם מעכברים. MEAs מורכבים ממיקרו-ectrodes מרובים המסודרים בתבנית דמוית רשת להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי במבחנה. לשיטה המתוארת כאן יש יתרון משולב של להיות מהיר יחסית, פשוט יותר ומדויק יותר מאשר גישות קודמות להקלטת קצב לב מהותי, תוך מתן אפשרות לחקירה תרופתית קלה.
מבוא
הלב הוא איבר מורכב הנשלט על ידי השפעות מהותיות וחיצוניות כגון אלה שמקורן במוח. צומת סינוטריאל (SAN) הוא אזור מוגדר בלב המאכלס את תאי קוצב הלב (המכונים גם תאי סינוטריאליים, או תאי SA) האחראים על החניכה וההנצחה של פעימות הלב של היונקים1,2. קצב הלב המהותי הוא הקצב המונע על ידי תאי קוצב הלב ללא השפעה על השפעות לבביות או נוירו-הומוריסטיות אחרות, אך מדדים מסורתיים של קצב הלב בבני אדם ובעלי חיים חיים, כגון אלקטרוקרדיוגרמה, משקפים הן את קוצב הלב והן את ההשפעות העצביות על הלב. ההשפעה העצבית הבולטת ביותר על תאי SA היא ממערכת העצבים האוטונומית, אשר כל הזמן מווסת דפוסי ירי כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של הגוף
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה המתודיסטית הדרומית.
1. ציפוי מערך ריבוי הבחירה (MEA) להקלטה
- הפוך חוצץ בוראט 25 מ"מ.
- יש להמיס 0.953 גרם של Na2B4O7·10 H2O ב-80 מ"ל של מים מזוקקים.
- כוונן את ה- pH ל- 8.4 עם HCl ולאחר מכן הוסף מים מזוקקים לנפח סופי של 100 מ"ל.
- הפוך פתרון מניות 0.1% של פוליאתילנין (PEI).
- הוסף 100 μL של 50% (w/v) PEI ל 4.9 מ"ל של מים מזוקקים כדי להפוך פתרון PEI 1%.
- לדלל את פתרון 1% PEI כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
לאחר מתן אפשרות לרקמה להתאקלם בצלחת במשך 15 דקות, 10 עקבות של דקה אחת נרשמים. פעילות הרישום הנוכחית שלנו של הפרוטוקול במשך יותר משעה, אך רשמנו דפוסי ירי יציבים במשך ≥4 שעות בנתונים שלא פורסמו שאינם מוצגים כאן. אם הכנה ניסיונית טובה לאיסוף נתונים, כל ערוץ הקלטה צריך להציג צורות גל חוזרות עקביות ומרווחות באופן שווה (כלומר, קוצים) של צורה אחידה עבור ערוץ נתון (איור 11D). צורות גל אלה תואמות פעימות לב בודדות המשקפות פעילות עשיית קצב לבבית מהותית. מרווחי הזמן הבין-כוכביים צריכים להיות זהים עבור כ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תרגול ושליטה בתהליך הניתוח SAN הוא הכרחי שכן הרקמה שברירית ורקמות בריאות נחוצות להקלטה מוצלחת. במהלך ניתוח SAN, אוריינטציה נכונה חיונית כדי להשיג את האזור הנכון של הרקמה. עם זאת, האוריינטציה המקורית של הלב יכולה ללכת לאיבוד בקלות במהלך תהליך הניתוח, אשר מסבך את המאמץ הזה. לכן, כדי להבטיח את הכיוון הנכון שמאלה-ימין, atria צריך להיבדק חזותית. בדרך כלל, האטריום הימני נוטה להיות שקוף יותר, ואילו האטריום השמאלי הוא בדרך כלל כהה יותר ואדום יותר בצבע25,48. יתר על כן, זה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, מספרי מענק R01NS100954 ו- R01NS099188.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4-Aminopyridine | Sigma | A78403-25G | |
| 22 מד מחט מזרק | פישר סיינטיפיק | 14-826-5A | משמש לדיסקציה |
| 23 מד מחט מזרק | פישר סיינטיפיק | 14-826-6C | משמש לדיסקציה |
| 60 מ"מ צלחות פטרי | Genesee Scientific | 32-105G | |
| 500 מ"ל בקבוק פיירקס | פישר סיינטיפיק | 06-414-1C | משמש לאחסון תמיסות |
| 1000 מ"ל בקבוק פיירקס | פישר סיינטיפיק | 06-414-1D | משמש לאחסון פתרונות |
| מלקחיים | לעצם Fine Science Tools | 16060-11 | |
| סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2· 2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | |
| קרבוגן (95% O2, 5% CO2) | |||
| מספריים Castroviejo, 4 " | Fine Science Tools | 15024-10 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| מחשב רכישת | נתוניםמעבד: Intel Xeon או Intel Core i7, זיכרון: 8GB, HDD: 1TB, כרטיס גרפי: NVIDIA או On-board, מסך: 1920x1080 | ||
| דיסקציה מיקרוסקופ | Jenco | ||
| סיכות ניתוח | מדע עדינים | 26002-20 | |
| Dumont #2 למינקטומיה מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11223-20 | |
| Dumont #55 מלקחיים | כלי מדע עדינים | 11295-51 | |
| מלקחיים משובחים במיוחד כלים | מדעיים עדינים | 11152-10 | |
| תא זכוכית | Grainger | 49WF30 | משמש להמתת חסד של עכבר |
| ערכת עוגן נבל | Warner Instruments | SHD-22CL/15 WI 64-0247 | |
| HCl | Fisher Chemicals | SA48-4 | משמש לאיזון pH |
| Hemostat | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Heparin | Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram | NDC 63739-953-25 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| מיקרוסקופ הפוך | Motic | AE2000 | |
| Isoflurane | Patterson וטרינרי | 07-893-1389 | |
| קלטת מעבדה | פישר סיינטיפיק | 15-950 | |
| אור לדיסקציה מיקרוסקופ | דולן-ג'נר | MI150DG 660000391014 | |
| מגזיום כלוריד (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337-100G | |
| MED64 מגבר ראש | MED64 | MED-A64HE1S | |
| MED64 מגבר ראשי | MED64 | MED-A64MD1A | |
| MED64 כובע זלוף | MED64 | MED-KCAP01 | |
| MED64 ערכת מחזיק צינור זלוף | MED64 | MED-KPK02 | |
| MED64 מחבר תרמי | MED64 | MED-CP04 | |
| רשת | וורנר אינסטרומנטס | 640246 | |
| מערך מיקרואלקטרודות (MEA) | אלפא מד סיינטיפיק | MED-R515A | |
| Mobius Software | WitWerx Inc. | תוכנה ספציפית עבור MED64 | |
| NaOH | Fisher Chemicals | S320-500 | המשמשת לאיזון pH |
| Normal Saline Ultigiene | NDC 50989-885-17 | ||
| מברשת צבע | Fisher Scientific | NC1751733 | |
| Parafilm | Genesee Scientific | PM-996 | |
| משאבה פריסטלטית | Gilson | F155009 | |
| צינורות משאבה פריסטלטית | פישר סיינטיפיק | 14-171-298 | 1/8 אינץ' קוטר פנימי |
| פוליאתילן | סיגמא סיגמא | P3143 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | סיגמא-אולדריץ' | P9333-500G | |
| אשלגן פוספט מונובסיסי (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655-500G | |
| נתרן ביקרבונט | סיגמא | S6297 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | פישר סיינטיפיק | S671-3 | |
| ערכת אלסטומר סילגרוד | דאו קורנינג | 184 סיל אלאסט ערכת 0.5 ק"ג | |
| נתרן פוספט מונו-בסיסי | סיגמא | S6566 | |
| נתרן טטרבוראט | סיגמא | S9640 | |
| מספריים כירורגיים | כלים | מדעיים עדינים14074-09 | |
| פיפטות העברה (בוגר 3 מ"ל) | Samco Scientific | 225 |
מקורות
- Marionneau, C., et al. Specific pattern of ionic channel gene expression associated with pacemaker activity in the mouse heart. Journal of Physiology. 562 (1), 223-234 (2005).
- Josea, A. D., Collison, D. The normal ran....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
