הקלטה של מערך Microelectrode של קצב הירי של צמת Sinoatrial כדי לזהות פגמים מהותיים בקצב הלב בעכברים

Summary

פרוטוקול זה נועד לתאר מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי באמצעות הקלטת מערך microelectrode של כל רקמת הצומת sinoatrial כדי לזהות פגמים בקצב בעכברים. סוכנים פרמקולוגיים יכולים גם להיות הציג בשיטה זו כדי ללמוד את ההשפעות שלהם על קצב מהותי.

Abstract

צומת sinoatrial (SAN), הממוקם באטריום הימני, מכיל את תאי קוצב הלב, וחוסר תפקוד של אזור זה יכול לגרום טכיקרדיה או ברדיקרדיה. זיהוי אמין של פגמים בקצב הלב דורש מדידה של קצב לב מהותי על ידי מניעת ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית, אשר יכול להסוות ליקויים בקצב. שיטות מסורתיות לניתוח תפקוד קוצב לב מהותי כוללות מצור אוטונומי המושרה על ידי סמים כדי למדוד את קצב הלב vivo, הקלטות לב מבודדות כדי למדוד קצב לב מהותי, ורצועת sinoatrial או הקלטות תיקון-מהדק תא יחיד של תאי קוצב לב sinoatrial כדי למדוד פעולה ספונטנית שיעורי ירי פוטנציאליים. עם זאת, טכניקות מסורתיות יותר אלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית וקשה לביצוע. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה חדשה למדידת קצב ירי לב מהותי על ידי ביצוע מערך microelectrode (MEA) הקלטות של תכשירי צומת sinoatrial הר שלם מעכברים. MEAs מורכבים ממיקרו-ectrodes מרובים המסודרים בתבנית דמוית רשת להקלטת פוטנציאל שדה חוץ-תאי במבחנה. לשיטה המתוארת כאן יש יתרון משולב של להיות מהיר יחסית, פשוט יותר ומדויק יותר מאשר גישות קודמות להקלטת קצב לב מהותי, תוך מתן אפשרות לחקירה תרופתית קלה.

Introduction

הלב הוא איבר מורכב הנשלט על ידי השפעות מהותיות וחיצוניות כגון אלה שמקורן במוח. צומת סינוטריאל (SAN) הוא אזור מוגדר בלב המאכלס את תאי קוצב הלב (המכונים גם תאי סינוטריאליים, או תאי SA) האחראים על החניכה וההנצחה של פעימות הלב של היונקים^1,2. קצב הלב המהותי הוא הקצב המונע על ידי תאי קוצב הלב ללא השפעה על השפעות לבביות או נוירו-הומוריסטיות אחרות, אך מדדים מסורתיים של קצב הלב בבני אדם ובעלי חיים חיים, כגון אלקטרוקרדיוגרמה, משקפים הן את קוצב הלב והן את ההשפעות העצביות על הלב. ההשפעה העצבית הבולטת ביותר על תאי SA היא ממערכת העצבים האוטונומית, אשר כל הזמן מווסת דפוסי ירי כדי לענות על הדרישות הפיזיולוגיות של הגוף³. תמיכה ברעיון זה, הן תחזיות אוהדות והן תחזיות parasympathetic ניתן למצוא ליד SAN⁴. מערכת העצבים הלב הפנימית (ICNS) היא השפעה עצבית חשובה נוספת שבה plexi גנגליוני, במיוחד atria הימני, innervate ולווסת את הפעילות של SAN^5,6.

הבנת גירעונות קצב היא חשובה מבחינה קלינית, כמו תפקוד לקוי יכול לעמוד בבסיס הפרעות לב רבות, כמו גם לתרום לסיכון של סיבוכים אחרים. תסמונת סינוס חולה (SSS) היא קטגוריה של מחלות המאופיינת בתפקוד לקוי של צומת sinoatrial אשר פוגע בקצב תקין^7,8. SSS יכול להציג עם סינוס ברדיקרדיה, הפסקות סינוסים, מעצר סינוס, בלוק יציאה sinoatrial, לסירוגין bradyarrythmias ו tachyarrhythmias⁹ והוא יכול להוביל לסיבוכים כולל סיכון מוגבר לשבץ תסחיף ומוות^{פתאומי 8,10}. אלה עם תסמונת Brugada, הפרעת לב מסומן על ידי פרפור חדרית עם סיכון מוגבר למוות לבבי פתאומי, נמצאים בסיכון גבוה יותר לאירועים הפרעות קצב אם יש להם גם תפקוד לקוי SAN comorbid^11,12. תפקוד לקוי של Sinoatrial עשוי להיות גם השלכות פיזיולוגיות מעבר ללב. לדוגמה, SSS נצפתה לעורר התקפים בחולה עקב hypoperfusion מוחי¹³.

כדי לזהות גירעונות קצב sinoatrial, קצב הלב המהותי צריך להיקבע על ידי מדידת הפעילות של SAN ללא ההשפעה של מערכת העצבים האוטונומית או גורמים הומוריסטיים. מבחינה קלינית, זה יכול להיות בערך על ידי מצור אוטונומי פרמקולוגי¹⁴, אבל אותה טכניקה יכולה להיות מיושמת גם במודלים יונקים כדי לחקור תפקוד לב מהותי^15,16. בעוד גישה זו חוסמת חלק גדול של השפעות עצביות תורמות ומאפשרת בדיקת לב in vivo, זה לא מבטל לחלוטין את כל ההשפעות הקיצוניות על הלב. טכניקת מחקר נוספת המשמשת לחקר תפקוד הלב המהותי במודלים של בעלי חיים היא הקלטות לב מבודדות באמצעות לבבות חדורי לנגנדורף, הכוללים בדרך כלל מדידות באמצעות אלקטרוגרמות, קצב, או מערכים רב-אלקטרוניים אפיקרדיים^17,18,19,20. בעוד טכניקה זו היא ספציפית יותר לתפקוד הלב שכן היא כרוכה בהסרת הלב מהגוף, המדידות עשויות עדיין להיות מושפעות ממנגנוני פיקוח אוטומטי מכני-חשמלי שיכולים להשפיע על מדידות דופק מהותיות²¹. הקלטות הלב המבודדות עשויות עדיין להיות מושפעות גם מרגולציה אוטונומית באמצעות ICNS^5,6,22,23. יתר על כן, שמירה על טמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית של הלב, שהיא קריטית למדידות תפקוד הלב, יכול להיות קשה בגישות לב^{מבודדות 20}. שיטה ישירה יותר לחקר תפקוד SAN היא לבודד באופן ספציפי רקמת SAN ולמדוד את פעילותה. זה יכול להתבצע באמצעות רצועות SAN (רקמת SAN מבודדת) או תאים מבודדים SAN קוצב לב^24,25. שניהם דורשים רמה גבוהה של אימון טכני, שכן SAN הוא אזור קטן מאוד ומוגדר מאוד, ובידוד תאים מהווה אתגר גדול עוד יותר כמו ניתוק יכול לפגוע בבריאות הכללית של התא אם לא מבוצע כראוי. יתר על כן, טכניקות אלה דורשות מיומנויות אלקטרופיזיולוגיות מומחים על מנת להקליט בהצלחה מן הרקמה או התאים באמצעות microelectrodes הקלטה בודדים.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים טכניקה להקלטת ה- SAN במבחנה באמצעות מערך מיקרו-ectrode (MEA) כדי להשיג מדידות דופק מהותיות. גישה זו יש את היתרון של הפיכת הקלטות אלקטרופיזיולוגיות ספציפיות מאוד נגיש לחוקרים חסר כישורים אלקטרופיזיולוגיים אינטנסיביים. MEAs שימשו בעבר לחקר תפקוד cardiomyocyte בתרביות cardiomyocyte ראשוני^{26,27,28,29,30,31,32}, גיליונות לב^{33,34,35,36,37,38,39}, ורקמות שלמות הרכבות^{40, 41,42,43,44,45,46,47}. עבודה קודמת נעשתה גם כדי לבחון את פוטנציאל השדה ברקמת SAN^41,42. כאן, אנו מספקים מתודולוגיה להשתמש MEA להקליט ולנתח שיעורי ירי SAN מהותי מורין. אנו מתארים גם כיצד טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבדוק השפעות פרמקולוגיות של תרופות על שיעורי ירי פנימיים SAN על ידי מתן ניסוי מדגם מראה את ההשפעות של 4-אמינופירידאין (4-AP), חוסם K⁺ ערוץ מגודר מתח. באמצעות ציוני דרך אנטומיים מוגדרים, אנו יכולים להקליט במדויק את SAN מבלי לבצע את ניתוחי הרקמות הנרחבים או בידודי תאים הנדרשים בשיטות אחרות. בעוד MEA יכול להיות עלות אוסרת, ההקלטות מספקות אמצעים ספציפיים ואמינים מאוד של קצב שניתן להשתמש בהם במגוון עצום של יישומי מחקר קליניים ופיזיולוגיים.

Protocol

כל ההליכים הניסיוניים המתוארים כאן בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), כפי שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטה המתודיסטית הדרומית.

1. ציפוי מערך ריבוי הבחירה (MEA) להקלטה

1. הפוך חוצץ בוראט 25 מ"מ.
   1. יש להמיס 0.953 גרם של Na₂B₄O₇·10 H₂O ב-80 מ"ל של מים מזוקקים.
   2. כוונן את ה- pH ל- 8.4 עם HCl ולאחר מכן הוסף מים מזוקקים לנפח סופי של 100 מ"ל.
2. הפוך פתרון מניות 0.1% של פוליאתילנין (PEI).
   1. הוסף 100 μL של 50% (w/v) PEI ל 4.9 מ"ל של מים מזוקקים כדי להפוך פתרון PEI 1%.
   2. לדלל את פתרון 1% PEI כדי 0.1% במאגר borate על ידי הוספת 1 מ"ל של פתרון 1% PEI ל 9 מ"ל של 25 mM borate חוצץ.
3. Pipette ~ 1 מ"ל של פתרון 0.1% PEI לתוך מערך microelectrode (MEA) צלחת, כך האלקטרודות מכוסות לחלוטין(איור 1A ו 1B).
   הערה: microelectrodes של MEA מורכבים בדרך כלל פלטינה שחור או פחמן צינורות מבודד עם פולימיד (או אקריליק); שני החומרים הידרופוביים. על ידי ציפוי MEA עם פולימר קטיקטי כגון PEI, משטח MEA הידרופובי נעשה הידרופילי יותר, המאפשר דגימות רקמה ליצור מגע טוב יותר עם משטח MEA (איור 1A1).
4. מכסים את מנת MEA בסרט תרמופלסטי כדי להפחית את האידוי ולהשאיר את MEA לילה בטמפרטורת החדר(איור 1C).
5. שאפו את תמיסת PEI מצלחת MEA באמצעות פיפטה, נזהרו שלא לגעת ברשת האלקטרודה שעלולה לפגוע באלקטרודות, ולאחר מכן שטפו ≥4 פעמים במים מזוקקים(איור 1D).
6. יש לאחסן את MEA מצופה PEI מתחת ל-1-2 מ"ל של מים אולטרה-תותים ואטומים בסרט תרמופלסטי ב-4 מעלות צלזיוס עד הצורך. לחלופין, אחסנו את ה-MEA המצופה על ידי טביעתה בכוב מלא במים אולטרה-תפותיים(איור 1E).
   הערה: תהליך ציפוי PEI צריך להתבצע רק פעם אחת עבור MEA לפני השימוש הראשון שלה, ולאחר כל הקלטה, MEA צריך להיות מאוחסן שקוע במים אולטרה-ספיר.

2. הכנת פתרון שלם של טיירוד לפירוק רקמות

1. הפוך 1,000 מ"ל של פתרון שלם של טיירוד עבור ביתור; ראשית, להוסיף 8.1816 גרם של NaCl ל 800 מ"ל של מים אולטרה-תות.
2. הוסף את הכמות הבאה של כימיקלים לפתרון: 0.4025 גרם של KCl; 0.1633 גרם של KH₂PO₄; 1.1915 גרם של HEPES; 0.9999 גרם של גלוקוז; 0.0952 גרם של MgCl₂; 0.2646 גרם של CaCl₂·2H₂O.
3. התאימו את ה-pH ל-7.4 עם NaOH ולאחר מכן הוסיפו מים אולטרה-תפותיים עד שהנפח הכולל יהיה 1,000 מ"ל.
   הערה: ההרכב הסופי של הפתרון של טיירוד השלם יהיה כדלקמן (ב mM): 140 NaCl, 5.4 KCl, 1.2 KH₂PO₄, 5 HEPES, 5.55 גלוקוז, 1 MgCl₂, 1.8 CaCl₂.

3. הכנת הפתרון של טיירוד מחומצן להקלטה

1. הפוך 500 מ"ל של הפתרון של טיירוד; להוסיף 4.003 גרם של NaCl ל 400 מ"ל של מים אולטרה-תותים.
2. הוסף את כמויות הכימיקלים הבאות לפתרון: 0.651 גרם של NaHCO₃; 0.042 גרם של NaH₂PO₄; 0.132 גרם של CaCl₂·2H₂O; 0.149 גרם של KCl; 0.0476 גרם של MgCl₂; 0.999 גרם של גלוקוז.
3. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם HCl ולאחר מכן הוסף מים אולטרה-תפותיים עד שהנפח הכולל הוא 500 מ"ל.
4. לחמצן את הפתרון עם קרבוגן לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר לפני תחילת ההקלטה.
   הערה: ההרכב הסופי של הפתרון של טיירוד יהיה כדלקמן (ב mM): 137 NaCl, 15.5 NaHCO₃, 0.7 NaH₂PO₄, 1.8 CaCl₂, 4 KCl, 1 MgCl₂, 11.1 גלוקוז. לפתרון של טיירוד זה יש הרכב שונה במקצת מהפתרון של טיירוד השלם המשמש לפירוק.

4. הכנת פתרון 4-אמינופירידין (4-AP) לאפנונון פרמקולוגי

1. הפוך פתרון עבודה של 1 מ"מ של 4-AP; להוסיף 18.82 מ"ג של 4-AP עד 200 מ"ל של הפתרון של טיירוד מהשלב 3.
2. לחמצן את פתרון 4-AP לפחות 30 דקות לפני הניסוי.

5. הכנת צלחת הפטרי לפירוק

1. מערבבים רכיבי אלסטומר סיליקון ביחס של 10:1 (לפי משקל) של הבסיס לסוכן ריפוי.
2. יוצקים ~ 15 מ"ל של תערובת אלסטומר סיליקון לתוך צלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ.
3. אפשר לאלסטומר לרפא בטמפרטורת החדר במשך 48 שעות לפני השימוש.
   הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בצלחת פטרי מסיליקון עבור ניתוחים עתידיים.

6. לנתח את צומת sinoatrial (SAN)

1. הכן את הפתרון של טיירוד השלם ההפכן לפירוק SAN.
   1. הוסף 400 μL של הפרין (1,000 USP / mL) כדי 40 מ"ל של הפתרון של טיירוד להשלים ולהתחמם באמבט מים 37 °C.
2. הזריקו לעכבר תוך-איטרא-איטרה ב-200-300 מיקרו-לן הפרין (1000 USP/מ"ל) ואפשרו לחיה לשבת במשך 10 דקות.
3. המתת חסד העכבר הפריני על ידי מנת יתר איזופלוריין.
   1. מניחים את העכבר בתא זכוכית קטן המכיל אדי איזופלוראן שנוצרו על ידי הוספת 200-300 μL של איזופלוראן נוזלי לנייר מסנן בתוך צינור פלסטיק מחורר.
      הערה: מכיוון שאיזופלוראן יכול לגרום לגירוי בעור ויכול להיספג גם דרך העור, הנוזל לא צריך לפנות ישירות לעכבר. לכן, ניגוב ספוג איזופלוראן ממוקם בצינור מחורר לניהול.
   2. לאמת את המוות על ידי הפסקת תנועה ומאמץ נשימה ועל ידי היעדר רפלקס צביטת בוהן. המוות בדרך כלל לוקח בערך 1-2 דקות לאחר מיקום לתוך החדר.
      הערה: המוות מלווה בדרך כלל במתן שתן.
4. הנח את העכבר בתנוחה על לוח ניתוח עם כפות מושטות ותקן את כפות הרגליים ללוח באמצעות מחטי מזרק באורך 1 אינץ ', 23 מד. לאחר מכן להסיר את הפרווה בקרבת החלק התחתון של כלוב הצלעות באמצעות מספריים כירורגיים חיתוך הפרווה בשורשים.
   הערה: עבור לוח ניתוח, ניתן להשתמש במכסים קרירים יותר של פוליסטירן.
5. בעת החזקת העור עם hemostat, להשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך רוחבי בעור ממש מתחת לתחתית כלוב הצלעות בערך קשת קוסטל שמאל לקשת העלות הימנית(איור 3A).
6. חותכים את הצי עם מספריים כירורגיים ומפרידים בזהירות את הכבד מהסרעפת, נזהרים שלא לחתוך את הכבד, מה שיגרום לדימום מוגזם(איור 3B). יש לבלום את הסרעפת לאורך בית החזה כדי לחשוף את חלל בית החזה (איור 3C-D).
7. באמצעות מספריים כירורגיים, לחתוך את הקירות לרוחב של כלוב הצלעות משולי הקשתות היקרות עד הבריח כדי לחשוף את הלב, תוך הקפדה כדי למנוע פגיעה בלב(איור 3D). לאחר מכן השתמש במחט מזרק 23 מד להצמיד את כלוב הצלעות מעל הכתף, מחזיק אותו במקום ומחוץ לדרך של השדה הכירורגי.
8. השתמש פיפטה העברה כדי לטפטף חם (37 °C) הפנטזה פתרון של טיירוד מלא על הלב כדי לשמור אותו לח.
   הערה: אין לאפשר ללב להתייבש.
9. הסר את הריאות על ידי החזקתם עם מלקחי גראפה עדינים במיוחד וניתוק קנה הנשימה במספריים כירורגיים(איור 3E).
10. החזק את פסגת הלב עם מלקחי גראפה עדינים במיוחד ולהסיר אותו על ידי חיתוך avae aorta ו venae עם מספריים כירורגיים. העבירו את הלב לצלחת פטרי המכילה אלסטומר סיליקון נרפא(איור 4A)והשתמשו בפפטה להעברה כדי לרחוץ את הלב עם 2-3 מ"ל של תמיסה חמה (37 מעלות צלזיוס) של טיירוד ההפרין.
    הערה: היזהר לא לפגוע בקיר האחורי העדין של atria הימני, אשר מכיל את SAN, ואת ורידים ישר הימני המחובר. רחצת הלב עם הפתרון של Complete Tyrode מונעת מהלב להתייבש אך אינה שקועה לגמרי בלב בתמיסה מכיוון שהיא תפגע בנראות במהלך הניתוח.
11. כוון את הלב עם האטריום הימני מימין לנסיין והאטריום השמאלי משמאלו של הנסיין.
    הערה: ניתוח של רקמת SAN צריך להיעשות במהירות על מנת למנוע פגיעה הקשורה לאיסכמיה.
12. מחברים את פסגת הלב לצלחת עם סיכת ניתוח. לאחר מכן, בעודם מחזיקים את הוועד הנבוב הנחות עם דומונט #2 מלקחיים לכריתת למינקטומיה, הכנס מחט מזרק 22 גרם דרך הוועד הנבוב הנחות והעליון כדי לאתר את מיקומם באטריום הימני, המזהה גם את המיקום המשוער של ה- SAN (הממוקם בחלקת הרקמה בין הוועד הנחות והעליון (איור 4B).
13. בעזרת סיכות דיסקציה קטנות, מצמידים את נספחי האיתרים השמאליים והימנים לצלחת.
    1. בעוד מחזיק את התוספתן השמאלי של האיתורים עם דומונט #2 מלקחיים לכריתת למינקטומיה, הציב סיכת ניתוח דרך התוספתן השמאלי של האיתוזים כדי להחזיק אותו במקומו.
    2. בעוד מחזיק את התוספתן הנכון בפרוזוזים עם דומונט #55 מלקחיים, לשים סיכת ביתר דרך התוספתן האיזדונתי הנכון להחזיק אותו במקום.
       הערה: אותו סוג של מלקחיים יכול לשמש כדי להחזיק את נספחי האיתורים השמאלי והיני אם תרצה.
14. הסר את מחט המזרק המשתרעת על פני קווה הניר.
15. כדי לשחרר דם מהלב, השתמש במספריים Castroviejo כדי להסיר את פסגת הלב (כלומר, החצי התחתון) על ידי ביצוע חתכים רוחביים על פני החדרים(איור 4C). לאחר מכן, לשטוף את הלב על ידי הוספת חם (37 °C) הפנטזה פתרון של טיירוד מלא עם פיפטה העברה.
16. השתמש במספריים Castroviejo לחתוך לאורך מחיצת atrioventricular שמירה על החתך קרוב יותר לחדר מאשר אטריה. ממשיכים לחתוך לאורך מחיצת atrioventricular עד atria מופרדים מן החדרים.
17. חותכים לאורך המחיצה הבין-ארצית כדי להסיר את האטריום השמאלי.
18. הניחו סיכות דיסקציה בשולי האטריום הימני כדי להפוך אותו לשכב שטוח(איור 4D). הסר כל השומן הנותרים, כלי הדם או הרקמה מן האטריום באמצעות מספריים Castroviejo.
19. אתר את SAN באטריום הימני, אשר בכיוון זה גובל בערך על ידי הווריד העליון (בחלק העליון), vena cava נחות (בתחתית) ו cristae terminalis (בצד שמאל) (איור 4D).
    הערה: ה- crista terminalis מופיע כרכס שרירים כהה בין התוספתן הימני של האיתרים לבין ה- SAN. לעתים קרובות ניתן לראות גם את עורק SAN זורם דרך SAN(איור 4D).

7. הכנת מערכת MEA להקלטה

1. הוסיפו את הפתרון של טיירוד (החל מהשלב 3) לבקבוק תמיסה לקלט(איור 5C)וחמצן אותו על ידי הפעלת זרימת גז קרבוגן(איור 5A)למערכת.
   הערה: הפתרון של טיירוד המשמש להקלטה שונה במקצת בהרכבו מהפתרון של טיירוד השלם המשמש ליצירה.
2. אמת את זרימת הקרבוגן על ידי התבוננות בבועות בבקבוק החרוט, המשמש לחות הגז (איור 5B) ובקבוק פתרון הקלט (איור 5C).
3. הכנס את צינורות זרימת המשאבה הדיסטלטית (איור 5D) לפתרון ההקלטה של טיירוד(איור 5C). לאחר מכן, הכנס את זרימת המשאבה העגמה העגבת לבקבוק האיסוף(איור 5I).
4. הגדר את המשאבה peristaltic ל 25 סל"ד, אשר נותן קצב זרימה של 2 מ"ל / דקה ולהתחיל את המשאבה. בדוק אם קיימים במערכת דליפת מאגר או גלישה.
5. הגדר את בקר הטמפרטורה ל-37 °C (5 °F), הטמפרטורה הפיזיולוגית של עכברים(איור 5E).

8. הצבת רקמת הלב על רשת MEA

1. העבירו את רקמת SAN המנותחת בעזרת מברשת צבע (איור 6A) מצלחת הפטרי המנותחת לרשת MEA(איור 1A1).
   1. תוך כדי התבוננות תחת מיקרוסקופ הפוך, מקם בעדינות את הרקמה באמצעות מברשת צבע רכה כך שאזור SAN יכה את רשת האלקטרודה.
   2. מקם מחדש את הרקמה לפי הצורך כדי להבטיח שהיא שוכבת שטוחה על רשת האלקטרודה, יצירת קשר טוב עם האלקטרודות.
      הערה: מברשת צבע רכה נדרשת להזזת הרקמה כדי למנוע פגיעה ברשת האלקטרודה.
2. לאחר שהרקמה ממוקמת כראוי, השתמש במלקחיים עצם (או כל מלקחיים מעוקלים) כדי למקם את הרשת מעל הרקמה (איור 6A). לאחר מכן השתמשו במלקחיים העצם כדי למקם את עוגן הנבל(איור 6A)על הרשת כדי להחזיק את הכל במקום(איור 6B).
3. קח תמונה של מיקום הרקמה על MEA, כך הפעילות של אלקטרודות בודדות ניתן לתאם עם המיקום האנטומי שלהם במהלך ההקלטה. ניתן לעשות זאת על ידי החזקת טלפון חכם עד למטרת המיקרוסקופ ההפוך או באמצעות מצלמת מיקרוסקופ מחוברת.
   הערה: אם כיוון ה- MEA אינו משתנה לאחר צילום התמונה, האלקטרודה השמאלית העליונה תופיע כערוץ הראשון (Ch1) במהלך ההקלטה.
4. מניחים את צלחת MEA על צלחת המחבר (איור 5F ו- 6C) ומניחים בזהירות את מכסה ההטמה (איור 6C) על צלחת MEA מבלי להפריע לעוגן פרוסת הנבל. ניתן לאבטח עוד יותר את מכסה ההדבקה באמצעות סרט מעבדה(איור 6C).
   הערה: בנוסף לתזרים פתרונות מתכווננים וצינורות זרימה, למכסה יש גם יציאה לאספקת גז (איור 6C). בנוסף, טבעת האלקטרודה המתייחסת עוברת דרך המכסה(איור 6C).
5. אפשר לרקמה להתאושש מהטיפול ולהתאקלם בתא במשך 15-20 דקות לפני ההקלטה.

9. הגדרת פרוטוקול רכישת הנתונים להקלטה

הערה: השלבים הבאים מתארים את פתיחת פרוטוקול התוכנה להקלטת פעימה ספונטנית והגדרת תנאי ההקלטה. הפרטים של שלבים אלה עשויים להשתנות בהתאם לתוכנה הספציפית הנמצאת בשימוש, אך החלוקה הכללית צריכה להישאר זהה.

1. הפעל את המגבר (איור 5G) והגדר זרימת עבודה להקלטה בתוכנה במחשב (איור 5H).
   1. פתח את התוכנה ולחץ על זרימת העבודה.
   2. בחר פתח תיקיה חדשה.
   3. פתח את התיקיה מתבניות.
   4. בחר 64MD1-1920X1080 (בהתאם לרזולוציה של שולחן העבודה).
   5. פתח את תיקיית ה- QT.
   6. פתח את תיקיית ההקלטה הספונטנית.
   7. בחרו בתבנית Beat_recording.מופלו ופתחו אותה ( איור7A).
2. הגדר את פרמטרי ההקלטה כדי לציין את מספר המעקבים, משך המעקב, מרווח המעקב, מתח הכניסה, קצב הדגימה וכו ', בהתאם לתנאי ההקלטה הרצויים (איור 7B).
   הערה: עבור תדירות פעימה ורכישת נתונים בין-ספייק, השתמש בדרך כלל במתח טווח כניסה של 2.9 mV, מסנן מעבר גבוה של 1 הרץ, מסנן מעבר נמוך של 1000 הרץ וקצב דגימה של 20 קילו-הרץ.
3. כדי לסמן שלבים או תנאים שונים של הניסוי, כגון לפני ואחרי ניהול התרופות, לחץ על הכרטיסייה ביאורים כדי להוסיף את הסימונים הרצויים (איור 7C).
4. כדי לציין את יעד הקובץ לאיסוף הנתונים, בחר בתיבה הפוך אחסון לזמין והזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ.

10. ביצוע ההקלטה ואיסוף הנתונים

1. לחץ על לחצן הקלט ושחק בשורת התפריטים העליונה של תוכנת הרכישה כדי להתחיל את ההקלטה. השג נתונים עבור 10 עקבות של משך של דקה אחת עם מרווחים של 2 דקות בין עקבות.
2. מתוך עקבות ראשוניים אלה, ודא כי צורות הגל המוקלטות עולות בקנה אחד עם הכנת רקמות בריאה ואיכותית על ידי אישור כי רוב ערוצי ההקלטה מציגים משרעת אותות של ≥ 0.5 mV ומרווחי ספייק זהים (איור 8).
   הערה: הערכה ראשונית של הפעילות וצפורמי הגל של המיקרו-ectrodes הבודדים המתאימים למיקומם האנטומי יכולה להתבצע על ידי התייחסות לתמונה שנרכשה לאחר מיקום הרקמה על ה- MEA.
3. כדי למדוד את ההשפעות של תרופות על הרקמה, השהה את ההקלטה לאחר רכישת נתונים בסיסיים ראשוניים על-ידי לחיצה על לחצן ההשהיה בשורת התפריטים העליונה.
   הערה: ניתן לציין את שלב התגובה לתרופה של הניסוי בהקלטה על ידי לחיצה על הכרטיסייה ביאורים והוספת הציון הרצוי כמתואר לעיל (איור 7C).
4. השהה את המשאבה והעבר את צינורות זרימת המשאבה מפתרון ההקלטה הרגיל לפתרון של טיירוד המכיל את התרופה הרצויה לפי בחירה.
   הערה: בניסוי לדוגמה, הפתרון של טיירוד שימש עם 1 mM 4-אמינופירידין (4-AP).
5. הפעל מחדש את המשאבה ובבטל את ההשהיה של ההקלטה כדי להתחיל שוב לאסוף נתונים.
6. ברגע שהתמיסה של טיירוד חדורה בתרופה הגיעה לרקמה, תקליט 10 עקבות באותו אופן שנעשה בעבר להקלטות הבסיסיות.
   הערה: העקבות ייקח קצת זמן כדי להתייצב כמו התרופה מחדירה לתוך תא ההקלטה. מנגנון הפעולה של התרופה עשוי להשפיע גם על יציבות ההקלטה. עבור תרופות שיש להם מנגנוני פעולה הפיכים, יש לרשום גם תקופת שטיפה כדי לאשר שיקום הפעילות לרמות הבסיס, המהווה אינדיקטור לרקמה בריאה.
7. לחץ על עצור כדי לסיים את ההקלטות.
8. קח תמונה סופית של מיקום הרקמה על MEA מתחת למיקרוסקופ במקרה הרקמה השתנתה בעקבות הליך הגדרת ההקלטה הראשוני.

11. ניקוי ההתקנה לאחר ההקלטה

1. תנקה את ה-MEA.
   1. לאחר סיום ההקלטה, הסר בעדינות את פתרון ההקלטה מצלחת MEA באמצעות מיקרופיט 1 מ"ל.
      הערה: היזהר לא ליצור קשר עם אלקטרודות MEA אשר יכול לפגוע בהם.
   2. הסר את רשת הנבל עוגן עם מלקחיים עצם (או כל מלקחיים מעוקלים). לאחר מכן השתמש במברשת צבע כדי להוציא את הרקמה מפני השטח MEA תמיד נזהר לא לגעת microelectrodes בודדים.
   3. בעזרת בקבוק כביסה, יש לשטוף בעדינות את צלחת MEA במים אולטרה-תפותיים בערך פי 3 עד 4.
   4. יש לאחסן את MEA המנוקה שקוע במים אולטרה-תפומיים ב-4 מעלות צלזיוס.
2. לשטוף את צינורות המערכת על ידי הפעלת מים אולטרה-זרימה דרכו במשך 5 דקות לפחות באמצעות הגדרת המהירות המרבית על המשאבה peristaltic.
   הערה: כדי למנוע צמיחה פטרייתית, אין להשאיר מים או תמיסה חוצץ בתוך הצינורות לאחר הניקוי.

12. ניתוח הקלטות MEA כדי למדוד את תדירות פעימת SAN

1. פתח את קובץ הנתונים המוקלט שנשמר בתבנית "Beat_frequency_analysis" של תוכנת הניתוח (איור 9).
2. לחץ על לחצן הפעל ואפשר להקלטה כולה לפעול כדי להציג חזותית את ערכת הנתונים ולהקצות פרמטרי ניתוח מתאימים.
   1. בחר את חלון ההרחבה עבור תבנית התצוגה הרצויה של הנתונים, בין אם הוא מוצג כממוצע למעקב או לממוצע לשעה (איור 10A).
   2. בחרו בערוצים שייכללו בניתוח והגדירו את ערכי הסף הרצויים של משרעת או משרעת מינימה לזיהוי שיא אוטומטי בצורת גל(איור 10B).
      הערה: ניתן לבחור ערוץ בודד, שילוב של ערוצים או את כל 64 הערוצים לניתוח בשלב זה (איור 9). אם ערכי הסף שנבחרו קרובים מדי לערכי המקסימום והמינימה של צורת הגל, ייתכן שתוכנות הניתוח לא יזוהו פסגות מסוימות של צורת גל.
   3. הגדר את כמות זמן טרום ספייק ו לאחר ספייק להיכלל בניתוח.
      הערה: הגדרות של 50 אלפיות שני לפני ספייק ו 100 אלפיות שני לאחר ספייק בדרך כלל עובד טוב(איור 10B).
3. לאחר הגדרת תנאי הניתוח, לחץ שוב על לחצן הפעל כדי להפעיל מחדש את ערכת הנתונים ולאשר כי פרמטרי הניתוח מתאימים לחילוץ ספייק.
4. לצורך ניתוח, זהה את שלושת העקבות היציבים ביותר ברציפות המציגים קצב פעימות יציב עבור כל עקבות ברוב הערוצים הן במהלך תקופת הבסיס של הניסוי והן בשלושה עקבות יציבים רצופים נוספים במהלך תקופת החשיפה לתרופה (איור 10A).
5. ציין את מעקבי ההתחלה והסיום לניתוח והזן את משך הזמן של כל מעקב שיש לנתח (איור 9).
6. לפני תחילת הניתוח, בחר בתיבות הפוך לזמינות הן עבור שמור פעימה לדקה והן עבור שמור מרווח זמן בין-כוכבי ( איור10B).
7. הזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ ( איור10B). הנתונים שנותחו עבור תדירות פעימה ומרווח זמן בין-ספייק יישמרו בצורה של תבנית ASCII (טקסט).
   הערה: כדי לנתח תנאים שונים (כגון תגובה בסיסית ותרופה), יש להפעיל את הניתוח בנפרד עבור כל תנאי.
8. לחץ על לחצן הפעל והקלט בסרגל הטאב העליון כדי להתחיל בניתוח.
9. כדי לייצא את הנתונים עבור יישומים אחרים, בחר את התיבות עבור שמור פעימה לדקה ושמור מרווח זמן בין-כוכבי (איור 10B). הזן את שם הקובץ הרצוי בתיבה משנה שמות הקובץ ( איור10B) ולחץ על שמור כדי לשמור את הנתונים המנותחים בתבנית טקסט ASCII בתיקיה שנבחרה.

Results

לאחר מתן אפשרות לרקמה להתאקלם בצלחת במשך 15 דקות, 10 עקבות של דקה אחת נרשמים. פעילות הרישום הנוכחית שלנו של הפרוטוקול במשך יותר משעה, אך רשמנו דפוסי ירי יציבים במשך ≥4 שעות בנתונים שלא פורסמו שאינם מוצגים כאן. אם הכנה ניסיונית טובה לאיסוף נתונים, כל ערוץ הקלטה צריך להציג צורות גל חוזרות עקביות ומרווחות באופן שווה (כלומר, קוצים) של צורה אחידה עבור ערוץ נתון (איור 11D). צורות גל אלה תואמות פעימות לב בודדות המשקפות פעילות עשיית קצב לבבית מהותית. מרווחי הזמן הבין-כוכביים צריכים להיות זהים עבור כ...

Discussion

תרגול ושליטה בתהליך הניתוח SAN הוא הכרחי שכן הרקמה שברירית ורקמות בריאות נחוצות להקלטה מוצלחת. במהלך ניתוח SAN, אוריינטציה נכונה חיונית כדי להשיג את האזור הנכון של הרקמה. עם זאת, האוריינטציה המקורית של הלב יכולה ללכת לאיבוד בקלות במהלך תהליך הניתוח, אשר מסבך את המאמץ הזה. לכן, כדי להבטיח את הכיוון הנכון שמאלה-ימין, atria צריך להיבדק חזותית. בדרך כלל, האטריום הימני נוטה להיות שקוף יותר, ואילו האטריום השמאלי הוא בדרך כלל כהה יותר ואדום יותר בצבע^25,48. יתר על כן, זה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-Aminopyridine	Sigma	A78403-25G
22 מד מחט מזרק	פישר סיינטיפיק	14-826-5A	משמש לדיסקציה
23 מד מחט מזרק	פישר סיינטיפיק	14-826-6C	משמש לדיסקציה
60 מ"מ צלחות פטרי	Genesee Scientific	32-105G
500 מ"ל בקבוק פיירקס	פישר סיינטיפיק	06-414-1C	משמש לאחסון תמיסות
1000 מ"ל בקבוק פיירקס	פישר סיינטיפיק	06-414-1D	משמש לאחסון פתרונות
מלקחיים	לעצם Fine Science Tools	16060-11
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2· 2H2O)	Sigma-Aldrich	C5080-500G
קרבוגן (95% O2, 5% CO2)
מספריים Castroviejo, 4 "	Fine Science Tools	15024-10
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021-1KG
מחשב רכישת			נתוניםמעבד: Intel Xeon או Intel Core i7, זיכרון: 8GB, HDD: 1TB, כרטיס גרפי: NVIDIA או On-board, מסך: 1920x1080
דיסקציה מיקרוסקופ	Jenco
סיכות ניתוח	מדע עדינים	26002-20
Dumont #2 למינקטומיה מלקחיים	כלי מדע עדינים	11223-20
Dumont #55 מלקחיים	כלי מדע עדינים	11295-51
מלקחיים משובחים במיוחד כלים	מדעיים עדינים	11152-10
תא זכוכית	Grainger	49WF30	משמש להמתת חסד של עכבר
ערכת עוגן נבל	Warner Instruments	SHD-22CL/15 WI 64-0247
HCl	Fisher Chemicals	SA48-4	משמש לאיזון pH
Hemostat	Fine Science Tools	13013-14
Heparin	Aurobindo Pharma Limited IDA, Pashamylaram	NDC 63739-953-25
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-250G
מיקרוסקופ הפוך	Motic	AE2000
Isoflurane	Patterson וטרינרי	07-893-1389
קלטת מעבדה	פישר סיינטיפיק	15-950
אור לדיסקציה מיקרוסקופ	דולן-ג'נר	MI150DG 660000391014
מגזיום כלוריד (MgCl2)	Sigma-Aldrich	208337-100G
MED64 מגבר ראש	MED64	MED-A64HE1S
MED64 מגבר ראשי	MED64	MED-A64MD1A
MED64 כובע זלוף	MED64	MED-KCAP01
MED64 ערכת מחזיק צינור זלוף	MED64	MED-KPK02
MED64 מחבר תרמי	MED64	MED-CP04
רשת	וורנר אינסטרומנטס	640246
מערך מיקרואלקטרודות (MEA)	אלפא מד סיינטיפיק	MED-R515A
Mobius Software	WitWerx Inc.		תוכנה ספציפית עבור MED64
NaOH	Fisher Chemicals	S320-500	המשמשת לאיזון pH
Normal Saline Ultigiene	NDC 50989-885-17
מברשת צבע	Fisher Scientific	NC1751733
Parafilm	Genesee Scientific	PM-996
משאבה פריסטלטית	Gilson	F155009
צינורות משאבה פריסטלטית	פישר סיינטיפיק	14-171-298	1/8 אינץ' קוטר פנימי
פוליאתילן	סיגמא סיגמא	P3143
אשלגן כלורי (KCl)	סיגמא-אולדריץ'	P9333-500G
אשלגן פוספט מונובסיסי (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P5655-500G
נתרן ביקרבונט	סיגמא	S6297
נתרן כלורי (NaCl)	פישר סיינטיפיק	S671-3
ערכת אלסטומר סילגרוד	דאו קורנינג	184 סיל אלאסט ערכת 0.5 ק"ג
נתרן פוספט מונו-בסיסי	סיגמא	S6566
נתרן טטרבוראט	סיגמא	S9640
מספריים כירורגיים	כלים	מדעיים עדינים14074-09
פיפטות העברה (בוגר 3 מ"ל)	Samco Scientific	225