מאמר שיטה

מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

DOI:

10.3791/62762

⸱

21 ביולי 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקוד חלבון הלם חום 90 (Hsp90)-cochaperone אינטראקציות מספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים תלוי Hsp90. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטרטריקופטיד (TPR) של מלווים משותפים. FK506-מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם שני מלווים שותפים TPR-מוטיב דומה המעורבים במחלות תלויות הורמונים סטרואידים עם פונקציות שונות. לכן, זיהוי מולקולות במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו FKBP51 או FKBP52 מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח עבור מספר מחלות אנושיות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קרבה זוהרת מוגברת כדי לחקור אינטראקציות בין Hsp90 ושותפו מלווים FKBP51 ו- FKBP52. ראשית, טיהרנו את החלבונים המכילים מוטיב TPR FKBP51 ו- FKBP52 בצורת גלוטתיון S-transferase (GST). באמצעות חרוזי התורם הקשורים לגלוטתיון עם חלבוני TPR-מוטיב מותכים GST וחרוזים מקבלים יחד עם פפטיד מסוף C 10-mer של Hsp90, חקרנו אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה הומוגנית. השתמשנו בבדיקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש את האינטראקציות Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 וזיהינו מעכבי אינטראקציה חזקים וסלקטיביים Hsp90-FKBP51.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מלווים מולקולריים תורמים להומאוסטזיס של חלבונים, כולל קיפול חלבונים, הובלה והשפלה. הם מווסתים מספר תהליכים תאיים ומקושרים למחלות רבות כגון סרטן ומחלות ניווניות1. חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא אחד המלווים החשובים ביותר שתפקידם תלוי בשינויים קונפורמיטיביים המונעים על ידי הידרוליזה ATP וקשירה עם חלבוני לקוח בתיווך המלווים השותפים שלה2. למרות הפוטנציאל הברור של Hsp90 כיעד הטיפולי, כוונון עדין של תפקידו מהווה אתגר גדול. ישנם מספר מעכבי Hsp90 המתמקדים באזור איגוד ה- ATP של N-terminal, אשר הוערכו בניסויים קליניים, אך אף אחד מהם לא אושר לשיווק3. בשל היעדר כיס4, המתמקדבאזור ה-C-terminal של Hsp90, זכה להצלחה מוגבלת4. לאחרונה, הפרעה של אינטראקציות Hsp90-cochaperone על ידי מולקולות קטנות נחקרה כאסטרטגיהחלופית 5. מיקוד אינטראקציות Hsp90-cochaperone לא לעורר תגובת מתח תא כללי ומספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים שונים. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטראטריאופפטייד (TPR) של מלווים משותפים6. מתוך 736 חלבונים המכילים מוטיב TPR המובאים במאגר החלבון האנושי, ~ 20 חלבונים שונים אינטראקציה עם Hsp90 באמצעות פפטידזה 7. מולקולות המתחרות על כריכת הפפטיד של MEEVD ישבשו את האינטראקציות בין Hsp90 למלווים שותפים המכילים תחום TPR. אתר כריכת הפפטידים בעל מבנה שלישוני דומה, אך ההומולוגיה הכוללת בין תחומי מוטיב TPR שונים נמוכה יחסית7, ומספקת הזדמנות לזהות מולקולות המסוגלות במיוחד לחסום אינטראקציות בין Hsp90 לבין מלווים משותפים מסוימים של TPR-מוטיב. בין אלה TPR-מוטיב מלווים משותפים, FK506 מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם רגולטורים של קולטן הורמון סטרואידים (SHR) איתות מעורב במספר מחלות תלויות הורמונים סטרואידים כולל סרטן, מחלות הקשורות ללחץ, מחלות מטבוליות, ומחלתאלצהיימר 8. למרות FKBP51 ו- FKBP52 מניות > דמיון רצף 80%, הפונקציות שלהם שונים: FKBP52 הוא רגולטור חיובי של פעילות SHR, בעוד FKBP51 הוא רגולטור שלילי ברוב המקרים8. לכן, זיהוי מולקולות, במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52, מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח למחלות קשורות.

Luminescent Proximity Hאומוגנוס Assay (אלפא מסך) פותח לראשונה בשנת 1994 על ידי אולמן EF ואח'9. עכשיו הוא נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות סוגים שונים של אינטראקציות ביולוגיות, כגון פפטיד10, חלבון11, DNA12,RNA13, וסוכר14. בטכניקה זו, ישנם שני סוגים של חרוזים (קוטר 200 ננומטר), אחד הוא חרוז התורם והשני הוא חרוז הקבלה. הביומולקולים משותקים על החרוזים האלה; האינטראקציות הביולוגיות שלהם מביאות את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. מכיוון שלחמצן הסינגל יש חיים קצרים, הוא יכול לפזר רק עד 200 ננומטר. אם חרוז הקבלה נמצא בסמיכות, נגזרת תיוקסן שלה מגיבה עם חמצן יחיד יצירת chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז מקבל לפלוט אור ב 520-620 ננומטר15. אם האינטראקציות הביולוגיות משובשות, החרוז המקבל וחרוז התורם אינם יכולים להגיע לקרבה, וכתוצאה מכך דעיכה בחמצן יחיד ואות המיוצר נמוך.

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות טכניקה זו להקרנת מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- TPR מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. 10 פפטידים ארוכים של חומצות אמינו המתאימים ל- Hsp90 C-terminus קיצוני מחוברים לחרוזים מקובלים. מלווים שותפים TPR מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון. כאשר האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב-Hsp90 לבין מלווים שותפים של TPR-מוטיב מאחדת את החרוזים, נוצר אות מוגבר(איור 1A). אם המולקולות הקטנות המוקרנות יכולות לעכב את האינטראקציות בין Hsp90 ל-TPR-מוטיב שותפים, האות המוגבר הזה יקטן (איור 1B). ניתן לחשב את IC50 שלהם לפי מדידה כמותית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לכל מלווה - אינטראקציות שיתוף המלווה TPR-מוטיב של עניין והוא בעל חשיבות רבה בפיתוח של מולקולות חדשניות, במיוחד חסימת האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.

figure-introduction-1
איור 1: העיקרון הבסיסי של ההסתה הזו. (A)GST-FKBP51 מטוהר מקיים אינטראקציה עם חרוזי תורמים הקשורים לגלוטתיון. 10 פפטידים ארוכים של חומצת אמינו המתאימים לטרמינל C הקיצוני של Hsp90 מחוברים לחרוזים מקובלים. האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב- Hsp90 לבין תחום TPR של FKBP51 מביאה את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. נגזרת תיוקסן על חרוז הקבלה מגיבה עם חמצן יחיד ומייצר chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז קבלה לפלוט אור ב 520-620 ננומטר. (B)כאשר מולקולות קטנות מעכבות את האינטראקציות בין Hsp90 ל- FKBP51, החרוזים התורמים והמקבלים אינם יכולים להגיע לקרבה. ואז החמצן היחיד עם ריקבון תוחלת חיים קצרה, ולא מיוצר אות לגילוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: מבט כולל על פרוטוקול זה מוצג באיור 2.

1. ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 (איור 2A)

  1. פלסמידים
    הערה: להשיג שיבוטים cDNA עבור FKBP51 אנושי (מזהה שיבוט: 5723416) עבור FKBP52 אנושי (מזהה שיבוט: 7474554) מקונסורציום IMAGE.
    1. להגביר את ה- DNA FKBP51 האנושי על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'GGATCCATGAACTACTACTGATGAAGGT-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTCTCCAC-3') המכילים אוברהי באמי ו- XhoI ושיבוט לווקטור pGEX6-1 באתרי ההגבלה של באמהי / XhoI.
    2. להגביר את ה- DNA האנושי FKBP52 על ידי PCR עם פריימרים (קדימה; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', הפוך; 5'-CTCGAGCTATATGCTTCTCTCTCCAC-3') המכיל אוקרי ו XhoI overhangs ושיבוט לתוך וקטור pGEX6-2 באתרי הגבלה EcoRI / XhoI.
      הערה: הגדרת תגובת PCR והתנאים מוצגים בטבלה 1 ובטבלה 2.
    3. לאמת את הרצף שהוכנס ולהפוך את plasmids לתוך E. coli מוסמך כימית על פי פרוטוקול הייצור.
  2. ביטוי וטיהור חלבונים
    1. הוסיפו 25 גרם לבסיס מרק לוריא (LB) ב-1 ליטר מים מזוקקים כדי להפוך את פתרון ה-LB. תבודד אותו אוטומטית ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר הקירור, מוסיפים אמפיצ'ילין של 50 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. קח מושבה של חיידקים המבטאות GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ולערבב עם 500 μL של פתרון LB בצינור 1.5 מ"ל. מערבולת.
    3. מוסיפים את התערובת של "1.2.2" לתוך 1 L של פתרון LB בבקבוק Erlenmeyer מכוסה רדיד אלומיניום. לדגור על בקבוקון ארלנמייר בשייקר לילה ב 37 °C (50 °F).
    4. לגרום ביטוי חלבון על ידי הוספת 1 mM איזופרופיל-β-D-thiogalactoside (IPTG) לבקבוק ארלנמאייר ולהמשיך את הדגירה במשך 2 שעות נוספות.
    5. כדי לקבל כדורי תא, צנטריפוגה ב 5,000 x g במשך 15 דקות. הסר את סופר-טבעי.
      הערה: כדורי התא ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F).
    6. resuspend כדורי התא ב 40 מ"ל של PBS ו sonicate 3 x 20 s על קרח. יש להוסיף 1 מ"מ PMSF, 1 mM EDTA וקוקטייל מעכב פרוטאז (טבליה אחת) כדי למנוע פרוטאוליזיס.
    7. צנטריפוגה ההשעיה במשך 30 דקות 50,000 x g כדי להסיר פסולת תא ולהחיל את supernatant על 5 מ"ל GST מלכודת לעמודה.
    8. לאחר שטיפת העמוד עם 30 מ"ל PBS, יש לברוח GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 עם 5 מ"ל של גלוטתיון 10 מ"מ ב- PBS.
    9. מרכז חלבונים ביחידת צנטריפוגה של 15 מ"ל 10,000 MWCO. כדי להסיר גלוטתיון בחינם, מעבירים תרכיזים דרך עמודת PD-10 משוויבים עם PBS 0.5x ושוב מתרכזים בהתקן הצנטריפוגה של המסנן.
    10. לאסוף שברים המכילים חלבון. אמת את החלבונים ב-SDS-PAGE והתאם את ריכוזי החלבון ל-1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: תפוקת חלבון טיפוסית היא 2-5 מ"ג / L תרבית. ניתן לאחסן את החלבון ב-20 מעלות צלזיוס.

2. צימוד של Hsp90 C-terminal פפטיד לחרוזים המקובלים (איור 2B)

  1. הכנת פפטיד Hsp90
    1. לסנתז עשר חומצות אמינו פפטיד NH2-EDASRMEEVD-COOH המתאים לחומצות אמינו 714-724 של איזופורם בטא Hsp90 אנושי (מזהה UniProt: P08238) על ידי שירות סינתזת פפטיד.
    2. לדלל את הפפטיד Hsp90 ב- PBS לריכוז של 1 מ"ג/מ"ל.
  2. הכנת חרוזי קבלה
    1. לדלל את חרוזי הקבלה ללא מנוול PBS לריכוז 1 מ"ג / מ"ל ולהעביר לצינור 1.5 מ"ל.
    2. בצע את הכביסה על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x g במשך 15 דקות. הסר בזהירות את סופר-טבעי.
  3. הטיות
    1. הגדר את היחס בין חרוזים ופפטיד כ- 10:1. בצינור 1.5 מ"ל המכיל 1 מ"ג של כדור חרוזים מקובל (מוכן כפי שתואר לעיל), להוסיף 1 מ"ל של PBS (pH 7.4), 0.1 מ"ג של פפטיד מדולל, 1.25 μL של Tween-20, 10 μL של פתרון 400 mM של נתרן cyanoborohydride (NaBH3CN) במים.
      זהירות: NaBH3CN רעיל; השתמש ברדס אדים וכפפות. פתרון NaBH3CN צריך להיות מוכן טרי.
    2. דגירה במשך 24 שעות ב 37 °C (37 °F) עם תסיסה סוף סוף (10-20 סל"ד) על שייקר סיבובי.
  4. מרווה תגובה ושטיפת חרוזים
    1. הוסף 20 μL של פתרון 1 M Tris-HCl (pH 8.0) לתגובה לחסימת אתרים שלא הוחזרו. דגירה במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F).
    2. צנטריפוגה ב 16,000 x g (או מהירות מקסימלית) במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את supernatant ו resuspend את גלולה חרוזים 1 מ"ל של פתרון Tris-HCl (100 mM, pH 8.0).
    3. חזור על שלב הכביסה שלוש פעמים.
    4. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, resuspend החרוזים ב 1 מ"ג / מ"ל במאגר אחסון (1 מ"ל של 0.5 × PBS עם 0.01% נתרן אזיד כחומר משמר). יש לאחסן את פתרון חרוז הקבלה המצומד ב-4 °C (4 °F) מוגן.
      זהירות: נתרן אזיד רעיל; השתמש ברדס אדים וכפפות.

3. ההבחנה בוחנת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ו- Hsp90 C-terminal פפטיד, ועיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות(איור 2C)

  1. חלבונים מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם גלוטתיון
    1. הגדר את התגובות בצלחות 384-well.
    2. הכן את הפתרון המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל של חרוזי תורם גלוטתיון ב 0.5x PBS, pH 7.4.
      הערה: לאחר אחסון ממושך, החרוזים מתיישבים וצריכים להיות מערבולת.
    3. הוסף GST-FKBP51 או GST-FKBP52 לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם /מ"ל.
    4. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 10 דקות.
      הערה: בשלב זה, חלבונים מתויגים GST אינטראקציה עם גלוטתיון מחובר חרוזים. עבור כל באר, 22.5 μL של תערובת זו ישמש. ריכוז השותפים הכרוכות חייב להיקבע אמפירית. Titrate GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 ולבחור את הריכוז שנותן את האות הטוב ביותר.
  2. תוספת מורכבת
    1. הפוך דילול טורי של תרכובות בדיקה ב- DMSO.
      הערה: הריכוזים המשמשים הם בדרך כלל 10, 30, 100, 300, 1,000 ו- 3,000 מיקרומטר.
    2. הוסף 0.25 μL של DMSO (שליטה שלילית) או Hsp90 C-מסוף פפטיד (שליטה חיובית, 30 מיקרומטר) או תרכובות ב- DMSO לפינה של כל באר של הצלחת. יש להשתמש בטריפליקאטים לכל ריכוז מורכב.
    3. הוסיפו 22.5 μL של הפתרון המכיל חרוזי תורם גלוטתיון עם חלבונים מתויגים GST לכל באר.
    4. לנער את הצלחת בעדינות עם היד אבל ביסודיות. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 15 דקות.
      הערה: במהלך תקופה זו, תרכובות יקיימו אינטראקציה עם תחום TPR באתר איגוד הפפטיד Hsp90 C-terminal.
  3. תוספת חרוזי קבלה
    1. לדלל את החרוזים הקבלים עם פפטיד Hsp90 C-מסוף מצורף ל 100 מיקרוגרם / מ"ל ב 0.5x PBS.
    2. הוסף 2.25 μL של חרוזי קבלה מדוללים לכל באר.
    3. מערבבים בעדינות אך ביסודיות. דגירה בחושך ב 25 °C (5 °F) במשך 15 דקות.
      הערה: בשלב זה, חרוזים תורמים ומקבלים מובאים לקרבה על ידי אינטראקציות חלבון-פפטיד. הנפח הסופי של תערובת התגובה הוא 25 μL. לכן, הריכוזים הסופיים של תרכובות נע בין 0.1 ל 30 מיקרומטר.
  4. קריאת לוחיות רישוי
    הערה: קרא את הצלחת באמצעות קורא לוחות שהוגדר במצב הרלוונטי.
    1. הפעל את המכשיר ופתח את התוכנה
    2. בחר את הפרוטוקול הרלוונטי.
    3. לחץ על ערוך מפת לוח ובחר את הרווחה המשמשת בלוח לצורך מדידה.
    4. לחץ על הבא כדי להמשיך ולהפעיל את הפרוטוקול הנבחר.
    5. לאחר המדידה, לחץ על הצג תוצאות כדי להציג תוצאות.
    6. יצא את הנתונים.

4. ניתוח נתונים

  1. יחס גורם Z ויחס אות לרקע (S/B)
    1. חשב את יחס ה- Z של גורם ו- S/B עבור ה- assay באמצעות המשוואה הבאה:
      Z'=1-(3σpos+3σשלילי)/│μpos-μשלילי│16
      S/B=μשלילי/קופת μ
      כאשר, σ ו- μ מייצגים את סטיות התקן והאמצעים של הפקדים החיוביים (Hsp90 C-terminal, 30 מיקרומטר) ושלילי (DMSO), בהתאמה. גורם Z > 0.5 יבטיח כי בדיקת ה- Assay חזקה מספיק להקרנה. כדי לעקוב אחר רגישות ה- Assay, גם יחס ה- S/B חושב.
  2. עקומת תגובת מינון ו-IC 50
    הערה: השתמש בניתוח רגרסיה לא ליניארית כדי להתאים לנתונים של מעכבי PPI Hsp90-cochaperones על ידי תוכנה.
    1. צרו טבלת נתונים XY בתיבת הדו-שיח 'ברוכים הבאים' ובחרו 'מספריX' ו- Y Enter 3 (אם טריפליקאטים) משכפלים ערכים בעמודות זו לצד זו.
    2. נרמל את נתוני האות של דגימות לקבוצת הביקורת השלילית. יבא ערכי ריכוז לעמודת X וערכי האות לעמודה Y.
    3. לחץ על נתח ובחר ריכוז שינוי צורה (X) תחת שינוי צורה | לנרמל. בחר המר ללוגריתמים.
      הערה: פעולה זו תהפוך את הריכוז לקנה מידה של יומן רישום. אם ריכוז ההתחלה שלך הוא אפס, הגדר אותו למספר קטן מאוד שהוא למעשה אפס (למשל, 0.1 nM) כדי לא לאבד ערכים אלה מכיוון שהלוגריתם של אפס אינו מוגדר.
    4. לחץ על נתח ובחר רגרסיה לא ליניארית (התאמת עקומה) תחת ניתוחי XY, פתח את המינון-תגובה-עיכוב ובחר Log(מעכב) לעומת תגובה - שיפוע משתנה.
    5. לחץ על אישור כדי להציג את התוצאות (המכילות ערך IC 50) וגרפים.

figure-protocol-1
איור 2: שרטוט של פרוטוקול זה. (A)ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52. (B)צימוד של פפטיד Hsp90 C-מסוף לחרוזים המקובלים. (C)ההסתה בוחנת את האינטראקציה בין GST-FKBP51 או GST-FKBP52 ו- Hsp90 C-terminal פפטיד. עיכוב עם תרכובות מסה מולקולרית קטנות. נוצר עם BioRender.com אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בבדיקה שלנו, יחס ה-Z וה-S/B הם 0.82 ו-13.35, בהתאמה (איור 3A),מה שמוכיח שבדיקת ה-Assay שלנו חזקה ואמינה להקרנה בתפוקה גבוהה. לאחר מכן השתמשנו בו כדי לסנן תרכובות מסה מולקולרית קטנות. איור 3B מציג עיכוב תלוי מינון של אינטראקציות קואצ'אפרון מלווה עם מולקולה קטנה שנבחרה (D10). עקומות תגובת המינון עבור D10 נוצרות על ידי ניתוח רגרסיה לא ליניארית, המבוססת על הערכים של IC50 מחושבים. D10 מציג עיכוב תלוי מינון הן על Hsp90 - GST-FKBP51 ו Hsp90 - GST-FKBP52 PPIs...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות בדיקה לבדיקה עבור סינון מולקולות קטנות מעכב אינטראקציות בין Hsp90 ו TPR-מוטיב מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. ציון ה-Z הגבוה שלו (>0.8) מדגים את החוסן והאמינות לפורמט בעל תפוקה גבוהה. התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, כמויות קטנות של חרוזים, חלבון ותרכובות נדרשים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מורחב לכל Hsp90 / Hsp70 - TPR-מוטיב אינטראקציות שיתוף מלווה של עניין. מספר מלווים שותפים של TPR-מוטיב של Hsp90 היו מעורבים בהפרעות אנושיות שונות החל ממחלת אלצהיימר ועד מחלות אוטואימ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים לא מדווחים על ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר השוודית (2018-02843), קרן המוח (Fo 2019-0140), הקרן למחלות גריאטריות במכון קרולינסקה, קרן גונוור ויוסף אנר, קרן מגנוס ברגוולס, קרן אקדח וברטל סטונס, קרן טורה נילסון למחקר רפואי, קרן מרגרטה af Ugglas והקרן למשרתים זקנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות 384 בארותPerkin Elmer6008350נפח בדיקה 25 מ"ל
Amicon 10.000 MWCO יחידת צנטריפוגהMilliporeUFC901008חלבון מרוכז
AmpicillinSigmaA0166שייקר חיידקים אנטיביוטיקה
Unimax 1010חיידקי תרבותהיידולף
cDNA שיבוטים לאדם FKBP51מקור BioScienceמזהה שיבוט: 5723416pCMV-SPORT6 וקטור
cDNA שיבוטים לבני אדם FKBP52מקור מזההשיבוטBioScience: 7474554 וקטור pCMV-SPORT6
מוכשר כימית E. coliInvitrogenC602003One Shot BL21 Star (DE3)
תוכנת ניתוח נתוניםGraphPad Prism9.0.0ניתוח נתונים ויצירת דמויות
תוכנה לניתוח נתוניםExcelנתוני ניתוח
DMSOSupelco1.02952.1000תרכובות מדוללות
DPBSGibco14190-144הכן תמיסה
EDTACalbiochem344504למנוע פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
גלוטתיוןSigmaG-4251חלבונים מתויגים GST
חרוזי תורם גלוטתיוןפרקין אלמר6765300חרוז
עמודת מלכודת GSTCytiva (GE Healthcare)17528201טיהור חלבונים מתויגים GST
איזופרופיל-ובטא;-D-thiogalactosideThermo Fisher ScientificR0392לגרום לביטוי חלבון
מרק LB (מילר)SigmaL3522בינוני גידול מיקרוביאלי
BIO-RADS1000 הגברת ציקלר תרמי/עמודת PCR
PD-10Cytiva (GE Healthcare)17085101החלפת פתרונות
pGEX-6P-1 וקטורCytiva (GE Healthcare)28954648פלסמיד
pGEX-6P-2 וקטורCytiva (GE Healthcare)28954650
קורא צלחותPerkin ElmerEnSpire 2300 Multilabel ReaderRead alpha
plate תוכנת קורא צלחותPerkin ElmerEnSpire Managerתוכנת קורא צלחות
פרוטוקול תוכנת קורא צלחותPerkin ElmerAlpha 384-well נפח נמוךהשתמש בפרוטוקול זה כדי לקרוא צלחת
PMSFSigmaP7626למנוע פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
קוקטייל מעכב פרוטאזSigmaS8830למנוע פרוטאוליזה במהלך סוניקציה
נתרן אזידSigmaS2002כחומר משמר
נתרן ציאנובורוהידריד (NaBH3CN)Sigma156159מפעיל מטריצה לצימוד
עשר חומצות אמינו פפטיד NH2-EDASRMEEVD-COOH המתאים לחומצות אמינו 714-724 של Hsp90 בטא איזופורםפפטיד 2.0 incסינתז Hsp90 C-terminal פפטיד
מבחן מסובבLABINCOבצע תסיסה מקצה לקצה
Tris-HClSigma10708976001חסום אתרים לא מגיבים של חרוזי מקבל
Tween-20SigmaP1379למנוע צבירת חרוזים
אולטרה צנטריפוגה Avanti J-20 XPBeckman Coulterצנטריפוגה כדי לקבל כדורי תאים חיידקים
משבש תאים אולטרסאונדתאי מיקרוסוןסוניקט לשחרור חלבון
חרוזי קבלה לא מצומדיםפרקין אלמר6762003מקבל חרוזים
XCell SureLock Mini-Cell ומודול XCell II BlotInvitrogenEI0002SDS-PAGE
תורם מכשיר PCR פלסמיד

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720(2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Chaperone Cochaperone InteractionsHsp90 InteractionsFKBP51 InhibitionFKBP52 InhibitionBead Based AssayHigh Throughput ScreeningProtein Protein InteractionTPR MotifSmall Molecule ScreeningIC50 Determination

מאמרים קשורים