Method Article

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית להפנמת ATP בתיווך מקמפונוציטוזיס בתאי גידול אנושיים ועכברים קסנוגרפטים

DOI:

10.3791/62768

⸱

June 30th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Ohio University, 2Molecular and Cellular Biology Program, Ohio University, 3Neuroscience Program, Ohio University, 4Edison Biotechnology Institute, Ohio University, 5Translational Biomedical Sciences Program, Ohio University, 6Honors Tutorial College, Ohio University, 7Department of Biomedical Sciences, Heritage College of Osteopathic Medicine, Ohio University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו שיטה הניתנת לשחזור כדי לדמיין את ההפנמה של אדנוסין טריפוספט פלואורסצנטי לא הידרוליזנטי (ATP), תחליף ATP, עם רזולוציה תאית גבוהה. אימתנו את השיטה שלנו באמצעות במבחנה עצמאית ובקווי תאי גידול אנושיים של vivo ועכברים חיסוניים קסנוגרפטים עם רקמת גידול אנושית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אדנוסין טריפוספט (ATP), כולל ATP חוץ תאי (eATP), הוכח לשחק תפקידים משמעותיים בהיבטים שונים של tumorigenesis, כגון עמידות לתרופות, מעבר אפיתל-mesenchymal (EMT), גרורות. eATP תוך-טבעי הוא 103 עד10 פעמים גבוה יותר בריכוז מאשר ברקמות רגילות. בעוד eATP מתפקד כשליח כדי להפעיל איתות purinergic עבור אינדוקציה EMT, הוא גם מופנם על ידי תאים סרטניים באמצעות macropinocytosis upregulated, סוג מסוים של אנדוציטוזיס, כדי לבצע מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות. פונקציות אלה כוללות מתן אנרגיה לתגובות ביוכימיות הדורשות ATP, תרומת קבוצות פוספט במהלך העברת אותות, והקלה או האצה של ביטוי גנים כקופקטור תמלול. ATP זמין, והמחקר שלו בסרטן ובתחומים אחרים ללא ספק יגדל. עם זאת, מחקר eATP נשאר בשלב מוקדם, ושאלות לא פתורות נשארות ללא מענה לפני שניתן יהיה לפענח לחלוטין את הפעילויות החשובות והרב-תכליתיות שמפעילים eATP ו-ATP תאי מופנמ.

תרומות המעבדות של מחברים אלה למחקרי eATP מוקדמים אלה כוללות הדמיה מיקרוסקופית של ATP פלואורסצנטי לא הידרוליזנטי, יחד עם דקסטרנס פלואורסצנטי במשקל גבוה ונמוך, המשמשים כמעקבי מאקרופינוציטוזיס ואנדוציטוזיס, כמו גם מעכבי אנדוציטוזיס שונים, כדי לפקח ולאפיין את תהליך ההפנמה eATP. שיטת הדמיה זו הוחלה על קווי תאים של גידול ועל עכברים חיסוניים, קסנוגרפט עם גידולים סרטניים אנושיים, כדי לחקור הפנמה eATP במבחנה וב- vivo. מאמר זה מתאר את פרוטוקולי ההפנמה של הפריה ויוו, בדגש על שינוי ותנאי בדיקת מדוקפינוציטוזיס-/אנדוציטוזיס בתיווך eATP ניתן לבצע בהצלחה במערכות שונות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ספיגה אופורטוניסטית של חומרים מזינים חוץ תאיים תוך-סרטיים (כלומר) הוכרזה לאחרונה כסימן היכר מרכזי לחילוף החומרים של הסרטן1. אחד החומרים המזינים החשובים האלה הוא ATP, כמו הריכוז של ieATP הוא 103 ו10 4 פעמים גבוה יותר מזה שנמצא ברקמות רגילות, בטווח של כמה מאות מיקרומטרים עד mM נמוך2,3,4,5. כמולקולת אנרגיה ואיתות מרכזית, ATP ממלא תפקיד מרכזי בחילוף החומרים התאי בתאים סרטניים ובריאים6,7,8. ATP חוץ תאי מעורב ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים שדווחו כאן בוצעו בהתאם ל- IACUC של אוניברסיטת אוהיו ועם ה- NIH.

1. מבחר ATP פלואורסצנטי בלתי ניתן להידורה (NHF-ATP) ו- dextrans

  1. בחר מעקב NHF-ATP(איור 1A)ואנדוציטוזיס במשקל גבוה ונמוך, דקסטרנים פלואורו-מולקולריים בעלי משקל מולקולרי גבוה ונמוך (TMR-HMWFD ו- TMR-LMWFD) (איור 1B), בהתבסס על אורכי גל הפליטה המועדפים (למשל, מערכת הדמיה המצוידת במסננים מתאימים) ותהליך האנדוציטוזיס הספציפי שיש לחקור.

2. מחקרי לוקליזציה של ATP, במבחנה (איור 2)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר במבחנה
הפנמה תאית של NHF-ATP הודגמה על ידי לוקליזציה משותפת של NHF-ATP עם HMWFD או LMWFD (איור 4). ההצלחה של הליך זה מסתמכת בעיקר על השימוש בריכוזים מתאימים של NHF-ATP ו dextrans ועל קביעת הסוגים המתאימים של dextrans (פולי-ליסין לעומת נייטרלי). לדוגמה, כדי לחקור מקרופינוציטוזיס, HMWFD נבחר כפי שהוא מופנמת רק על ידי macropinosomes13,14,15,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פותחה שיטה לניתוח מרחבי, זמני וכמותי של הפנמה תאית של ATP שאינו הידרוליזליזה. שיטה זו ישימה באופן נרחב לשימוש במערכות ביולוגיות מגוונות, לרבות מודלים גידוליים שונים, אשר עבורם אנו מספקים הדרכה טכנית ונתונים מייצגים. כדי להשיג נתונים הניתנים לפרשנות במהלך מחקרי הפנמת ATP של vivo (סעיף 4 של הפרוטוקול), חשוב להגביל את הזמן הניסיוני שחלף מהזרקת דקסטרן תוך-אטומית להטבעת קריו. תיקון שקופיות רקמות-לאחר גידול-חתך-הוא צעד הכרחי לפני הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. יחד, שני שלבים קריטיים אלה מבטיחים שתאי הגידול ישמרו על ה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההקפאה בוצעה באתר בליבת ההיסטופתולוגיה של אוניברסיטת אוהיו. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרנות סטארט-אפ (המכללה לאמנויות ומדעים של אוניברסיטת אוהיו) ל- C Nielsen; מענק NIH R15 CA242177-01 ופרס RSAC ל X חן.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תאי A549, אפיתל ריאות אנושיות, קרצינומההמכון הלאומי לסרטןn/aמקור זול יותר
AcetoneFisher ScientificS25904
רדיד אלומיניום, ReynoldsGrainger6CHG6
מדיום הרכבה מימי, ProLong זהב נגד דהייה מגיבThermoFisherP36930
ATP אנלוגיJena BiosciencesNK-101
אוטוקלאב, סטריליזטורGrainger33ZZ40
להבים, קריוסטט, פרופיל גבוהC. L. Sturkey, Inc.
DT554550 קליפרים, מדיום תאים vernierGrainger4KU77
, תערובת התזונה של חזיר F12,Millipore Sigma51651C-1000ML
מקוררת עם רוטור דלי מתנדנדEppendorf5810R
ChloroformAcros Organics423555000
צינור חרוטי, 15 מ"לVWR21008-216
צינור חרוטי, 50 מ"לVWR21008-242
כיסויים, זכוכית, 12 מ"מקורנינג2975-245
קריוסטט, Leica CM1950Leica BiosystemsCM1950
מגבון משימות עדין, מגבוני קיםקימברלי-קלארק34155
דקסטרן, ליזין ניתן לתיקון, משקל מולקולרי גבוה (HMW)InvitrogenD1818MW = 70,000, Tetramethylrhodamine
Dextran, ניטרלי, משקל מולקולרי גבוה (HMW)InvitrogenD1819
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ללא סרוםFisher Scientific11885076
קרח יבשמשלוח מקומי מערכתבהזמנה
, Nikon NiU ותוכנת הרכישה Nikon NIS ElementsNikonהזמנה
אתנולפישר מדעיBP2818-4
סרום בקר עוברי (FBS)ThermoFisher16000044
מלקחיים, Dumont #7,כלי מדע עדינים11274-20
מלקחיים, Dumont #5, ישרFine Science Tools11254-20
כפפות (קטנות, בינוניות, גדולות)MicroflexN191, N192, כפפות N193
, MAPA Temp-Ice 700 תרמי (לטיפול בקרח יבש)Fisher Scientific19-046-563
HemocytometerDaiggerEF16034F EA
Incubator, תרבית תאיםEppendorfGalaxy 170 S
סרט תיוגFisher Scientific159015R
עט סימון, Sharpie (עדין במיוחד)סיכות
עכברים, חסרי חיסון (Nu/J)מעבדת ג'קסון2019
מיקרוצנטריפוגה, accuSpin Micro17פישר סיינטיפיק13-100-675
צינורות מיקרוצנטריפגים, צינורות אפנדורף (1.5 מ"ל)AxygenMCT-150-C
מיקרוסקופ קופסת שקופיותפישר סיינטיפיק50-751-4983
מחט, 27 מדBecton-Dickinson752 0071
PaintbrushGrainger39AL12
מגבות ניירStaples33550
ParaformaldehydeAcros Organics416785000
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140122
כף מחוררת, קוטר 15 מ"מ, אורך 135 מ"מRoboz Surgical Instrument Co.RS-6162
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Fisher ScientificBP3991
קצות פיפט (10 μ L)פישר סיינטיפיק02-707-438
טיפים לפיפט (200 μ L)פישר סיינטיפיק02-707-411
טיפים לפיפט (1000 μ L)פישר סיינטיפיק02-707-403
פיפטות, סרולוגיות (10 מ"ל)VWR89130-910
פיפטור, גילסון P2דייגרEF9930A
ערכת התחלה של פיפטורים, גילסון (2-10 μ L, 20-200 μ L, 200-1000 μ L)DaiggerEF9931A
- מסלול,ספסל Cole-ParmerEW-51710-23
שקופיות מיקרוסקופ טעונות חיובית, SuperfrostFisher Scientific12-550-15
אזמל, מידה 10, עיצוב כירורגי, בע"מ.Fisher Scientific22-079-707
מספריים, כירורגי - חד, מעוקלFine Science Tools14005-12
תוכנה לניתוח תמונה, Nikon ElementsNikonתוכנה בהזמנה
לניתוח תמונה, ImageJ (FIJI)המכונים הלאומיים לבריאותn/aלהורדה מקוונת (חינם)
דיסק דגימה 30 מ"מ (מחזיק צ'אק), אביזר קריוסטט14047740044Leica
Biosystems, 245 מ"ממזרק431111
, 1 סמ"ק309623Becton-Dickinson
, מעבדה, רוחב 19 מ"מFisher Scientific15-901-5R
טיימרFisher Scientific14-649-17
צלחת תרבית רקמות, קוטר 100 x 15 מ"מFisher Scientific08-757-100D
בקבוק תרבית רקמות, 225 ס"מ2ThermoFisher159933
צלחת תרבית רקמות, תבנית הטמעת353226Becton-Dickinson
, נירוסטהTissue Tek4161
מדיום הקפאת רקמות, טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)Fisher Scientific4585
Trypsin-EDTA (חומצה אתילנדיאמינטטראצטית), אמבט מים 0.25%Gibco25200072
, Precision GP 2SThermoFisherTSGP2S
צנטריפוגה ללא סרום , הדמיה אפיפלואורסצנטית אישיתמותאמת אישית מעוקלים 642736 שייקר פלטפורמת מותאמת אישיתמגש צביעה קורנינג כלים BioAssay סרט רקמות 24 בארות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pavlova, N. N., Thompson, C. B. The emerging hallmarks of cancer metabolism. Cell Metabolism. 23 (1), 27-47 (2016).
  2. Pellegatti, P., et al. Increased level of extracellular ATP at tumor sites: in vivo imaging with plasma membrane luciferase. PLoS ONE. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence MicroscopyATP InternalizationMacropinocytosisHuman Tumor CellsTumor Xenograft MiceExtracellular ATPEndocytosis TracersFluorescent DextranEpifluorescence ImagingCryosectioning Procedure

Related Articles