Method Article

בידוד גרעינים ומיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה לבחינת שינויים בנוקלאופורין בניוון עצבי אנושי

DOI:

10.3791/62789

⸱

September 10th, 2021

 , 
1Brain Science Institute, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Neurology, Johns Hopkins University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה אופטימלית לבידוד גרעינים ומיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה להערכת נוקלאופורינים בודדים בתוך הנוקלאופלזמה וה-NPCs בנוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ורקמות אנושיות לאחר המוות.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קומפלקס הנקבוביות הגרעיניות (NPC) הוא מבנה מקרומולקולרי מורכב המורכב ממספר עותקים של ~30 חלבוני נוקלאופורין שונים (Nups). באופן קולקטיבי, ה-Nups הללו מתפקדים כדי לווסת את ארגון הגנום, ביטוי הגנים והובלה נוקלאוציטופלזמית (NCT). לאחרונה, פגמים ב-NCT ושינויים ב-Nups ספציפיים זוהו כפתולוגיות מוקדמות ובולטות במחלות ניווניות מרובות, כולל טרשת אמיוטרופית צידית (ALS), מחלת אלצהיימר (AD)/דמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD) ומחלת הנטינגטון (HD). ההתקדמות הן במיקרוסקופ אור והן במיקרוסקופ אלקטרונים מאפשרת בחינה יסודית של מבנים תת-תאיים, כולל ה-NPC ומרכיבי ה-Nup שלו, עם דיוק ורזולוציה מוגברים. מבין הטכניקות הנפוצות, מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SIM) מספק הזדמנות שאין שני לה לחקור את הלוקליזציה והביטוי של Nups בודדים באמצעות אסטרטגיות תיוג קונבנציונליות מבוססות נוגדנים. בידוד גרעינים לפני ה-SIM מאפשר הדמיה של חלבוני Nup בודדים בתוך ה-NPC והנוקלאופלזמה במרחב תלת מימדי משוחזר באופן מלא ומדויק. פרוטוקול זה מתאר הליך לבידוד גרעינים ו-SIM להערכת ביטוי והפצה של Nup בתאי מערכת העצבים המרכזית האנושיים שמקורם ב-iPSC וברקמות שלאחר המוות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השכיחות של מחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לגיל עולה ככל שהאוכלוסייה מזדקנת1. בעוד שהיסודות הגנטיים וסימני ההיכר הפתולוגיים מאופיינים היטב, האירועים המולקולריים המדויקים המובילים לפגיעה עצבית נותרים לא מובנים היטב2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. לאחרונה, א ג4C2 הרחבה חוזרת של הקסנוקלאוטיד באינטרון הראשון של הגן C9orf72 זוהתה כגורם הגנטי השכיח ביותר למחלות ניווניות קשורות: טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) ודמנציה פרונטו-טמפורלית (FTD)13,14. מספר מחקרים תומכים כעת בתפקיד מרכזי לשיבושים במנגנון ההובלה הגרעינית, כולל קומפלקסים של נקבוביות גרעיניות (NPCs) וקולטני הובלה גרעינית (NTRs, karyopherins), כגורמים ל-C9orf72 ALS15,16. בתאים שאינם מתחלקים בתוך מוח העכברוש, נוקלאופורינים של פיגומים (Nups) הם בעלי חיים ארוכים במיוחד. כתוצאה מכך, דווח על שינויים ב-NPCs וב-NCT במהלך ההזדקנות17,18,19,20. יתר על כן, חלק מהנוקלאופורינים או הטרנספורטינים קשורים למחלות נוירולוגיות ספציפיות21,22. לדוגמה, מוטציות ב-Nup62 נקשרו לנמק סטריאטלי דו-צדדי אינפנטילי (IBSN), הפרעה נוירולוגית המשפיעה על גרעין הזנב והפוטמן23; מוטציות ב-Gle1 היו מעורבות במחלת הנוירונים המוטוריים של העובר תסמונת התכווצות מולדת קטלנית אנושית-1 (LCCS1)24; ומוטציות באלאדין גורמות לתסמונת טריפל-A25. שינויים ב-NCT תפקודי מחמירים במחלות נוירודגנרטיביות הקשורות לגיל כגון ALS, מחלת הנטינגטון (HD) ומחלת אלצהיימר (AD)16,26,27,28,29,30,31. בנוסף, Nups ו-NTRs ספציפיים דווחו כמשנים של רעילות מתווכת C9orf72 ב Drosophila עין28 או לשנות ביוכימית את מצב הצבירה של חלבונים הקשורים למחלות כגון FUS ו-tau27,32,33,34. באופן קולקטיבי, מחקרים מוקדמים אלה מצביעים על כך ששינוי ב-NCT עשוי להיות מאפיין פתולוגי ראשוני ומוקדם של ALS ו-FTD. מחקרים במערכת מודלים מבוססת ביטוי יתר הציעו כי מיקום שגוי של Nups וקריופרינים ספציפיים עשוי להשפיע על NCT16,35,36,37,38. עם זאת, מחקרים פתולוגיים אלה אינם מקשרים למעשה הצטברות ציטופלזמית של חלבוני NPC לפגמים במבנה או בתפקוד של ה-NPC. לדוגמה, פתולוגיה זו עשויה פשוט לשקף חוסר ויסות של מאגרים ציטופלזמיים של חלבוני Nup עם השפעה מועטה על הרכב ותפקוד NPC. לעומת זאת, מחקר שנערך לאחרונה המשתמש במיקרוסקופ תאורה מובנית ברזולוציה גבוהה (SIM) מדגים את הופעתה של פגיעה משמעותית ב-NPC עצמו המאופיינת בהפחתה ברמות Nup ספציפיות בתוך הנוקלאופלזמה וה-NPCs של נוירונים אנושיים C9orf72 ALS/FTD המובילים בסופו של דבר לשינוי בתפקוד NPC כאירוע התחלתי מוקדם במפלי מחלות פתוגניות15.

מעבר המקרומולקולות בין הגרעין לציטופלזמה נשלט על ידי קומפלקס הנקבוביות הגרעיני (NPC). ה-NPC הוא קומפלקס מקרומולקולרי גדול המוטבע במעטפת הגרעין המורכב ממספר עותקים של 30 חלבוני נוקלאופורין (Nups)39,40,41. למרות שסטוכיומטריית Nup משתנה בין סוגי התאים 42,43,44, שמירה על הרכב ה-NPC הכולל היא קריטית עבור NCT, ארגון הגנום והכדאיות התאית הכוללת 39,41,45,46. כתוצאה מכך, הרכב NPC שונה ופגמים שלאחר מכן בהובלה פונקציונלית עשויים להשפיע על מספר עצום של תפקודים תאיים במורד הזרם. מרכיבי ה-Nup של ה-NPC מאורגנים מאוד במספר תת-קומפלקסים, כולל הטבעת הציטופלזמית והחוטים, התעלה המרכזית, הטבעת החיצונית, הטבעת הפנימית, הטבעת הטרנסממברנית והסל הגרעיני. באופן קולקטיבי, פיגומים של הטבעות הפנימיות, החיצוניות והטרנסממברניות מעגנים NPCs בתוך המעטפת הגרעינית ומספקים נקודות עיגון ל-Nups של הטבעת הציטופלזמית, התעלה המרכזית והסל הגרעיני. בעוד שמולקולות קטנות (<40-60 kD) יכולות להתפזר באופן פסיבי דרך ה-NPC, ההובלה הפעילה של מטענים גדולים יותר מתאפשרת על ידי אינטראקציות בין קולטני הובלה גרעינית (NTRs, קריופרינים) ו-FG Nups של החוטים הציטופלזמיים, הערוץ המרכזי וסל הגרעין 39,40,41,45. כמו כן, קומץ Nups יכולים לתפקד בנוסף מחוץ ל-NPC, בתוך הנוקלאופלזמה, כדי לווסת את ביטוי הגנים46,47.

בהתחשב בכך שהממד הרוחבי של NPC אנושי יחיד הוא כ-100-120 ננומטר40, מיקרוסקופיה סטנדרטית של שדה רחב או קונפוקלי אינה מספיקה כדי לפתור NPCsבודדים 48. טכניקות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) כגון TEM או SEM משמשות לעתים קרובות להערכת המבנה הכללי של NPCs39,40. למרות היתרונות של טכניקות אלו לפתרון אולטרה-מבנה NPC, הן פחות נפוצות להערכת נוכחותם של חלבוני Nup בודדים בתוך ה-NPC. המגבלות הטכניות של שילוב תיוג מבוסס נוגדנים או תגים עם הטכנולוגיות המתקדמות הללו, TEM ו-SEM, לא תמיד מאפשרות הערכה מדויקת ואמינה של Nups בודדים עצמם בתוך NPCs או הנוקלאופלזמה. יתר על כן, טכניקות אלה יכולות להיות מאתגרות מבחינה טכנית ועדיין אינן נגישות באופן נרחב לכל החוקרים. עם זאת, ההתקדמות האחרונה במיקרוסקופיה של אור ופלואורסצנטי הגבירה את הנגישות של טכנולוגיות הדמיה ברזולוציה גבוהה. באופן ספציפי, SIM מעניק הזדמנות שאין שני לה לצלם Nups בודדים ברזולוציה המתקרבת לממדים הרוחביים של NPC אנושי אחד 40,48,49,50,51. בניגוד לגישות אחרות ברזולוציה גבוהה כגון מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי (STORM) ודלדול פליטה מגורה (STED), ה-SIM תואם לצביעה חיסונית קונבנציונלית מבוססת נוגדנים49. לפיכך, SIM מאפשר ניתוח מקיף של כל ה-Nups שעבורם קיים נוגדן Nup ספציפי. היכולת לדגום ולדמות מספר Nups שונים באותה תכשיר מספקת יתרונות משמעותיים לשיטות הדמיה אחרות בעת סקירת החלבונים הרבים המרכיבים את ה-NPC. ההליך הבא מפרט פרוטוקול אופטימלי להערכת רכיבי Nup בודדים של ה-NPC באמצעות גרעינים מבודדים מתאי עצב שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) ורקמות מערכת העצבים המרכזית האנושית (CNS) לאחר המוות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל דגימות הדם לייצור iPSC ואיסוף רקמות שעברו נתיחה לאחר המוות מאושרות על ידי IRB של ג'ונס הופקינס עם פיקוח האתיקה של ג'ונס הופקינס. כל המידע על המטופל תואם HIPPA. הפרוטוקול הבא מקפיד על כל נהלי הבטיחות הביולוגית של ג'ונס הופקינס.

1. הכנת שקופיות לצביעה חיסונית והדמיה

  1. מקם שקופית מיקרוסקופ זכוכית טעונה חיובית בציטו-משפך ריק וצייר עיגול עם עט מחסום הידרופובי כדי לשרטט אזור להפקדת הגרעינים.
  2. יש להוסיף 50 מיקרוליטר של תמיסת קולגן של 1 מ"ג/מ"ל (מדולל ב-1x PBS) למרכז העיגול שצויר בשלב 1.1 ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  3. שאפו את תמיסת הקולגן ותנו למגלשות להתייבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך כשעה.

2. הכנת מאגר ליזה ושיפועי סוכרוז

  1. הכן את תמיסות מאגר הליזיס ושיפוע הסוכרוז על פי פרוטוקול ערכת בידוד הגרעינים
    1. עבור כל דגימה, הכינו צינור חרוטי של 50 מ"ל של מאגר ליזה על ידי שילוב של 11 מ"ל של מאגר הליזיס המצורף, 110 מיקרוליטר של תמיסת 10% Triton X-100 המסופקת, ו-11 מיקרוליטר של 1 M DTT טרי מוכן או מופשר (Dithiothreitol).
    2. עבור כל דגימה, השתמש בצינור חרוטי של 50 מ"ל להכנת תמיסת כרית סוכרוז של 1.85 M על ידי שילוב של 27.75 מ"ל של תמיסת כרית סוכרוז 2 M המסופקת, 2.25 מ"ל של מאגר כרית הסוכרוז המצורף, ו-30 מיקרוליטר של 1 M DTT טרי מוכן או מופשר.
      הערה: תמיסת כרית סוכרוז 1.85M היא אופטימלית עבור iPSNs ורקמת מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות, אך התאימו אותה לסוגי תאים אחרים או לדגימות רקמה. פרטים נוספים על תאי HEK293, אסטרוציטים שמקורם ב-iPSC והעשרה של גרעיני אוליגודנדרוציטים מרקמות מערכת העצבים המרכזית שלאחר המוות פורסמולאחרונה 15.
  2. ערבבו בעדינות תמיסות חיץ ליזה וכריות סוכרוז על ידי היפוך צינורות חרוטיים ואחסנו אותם על קרח.

3. ליזה של iPSNs ורקמת מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות

  1. לפני שתמשיך עם הליזה, הנח את רוטור האולטרה-צנטריפוגה (ללא מחזיקי דגימה) באולטרה-צנטריפוגה ואפשר לו להתקרר מראש ל-4 מעלות צלזיוס.
  2. ליזה של iPSNs.
    הערה: פרוטוקולי ליזה שונים עבור iPSNs ורקמת מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות. עקוב אחר הפרוטוקול עבור סוג הדגימה המפורט להלן (שלב 3.2: iPSNs, שלב 3.3: רקמת מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות).
    1. הסר את ה-iPSN מהאינקובטור ושאף את המדיה. שוטפים קצרות עם 1x PBS ומוסיפים את מאגר הליזיס ישירות לבאר או לצלחת.
      הערה: הקפידו לשטוף כראוי את מכשירי ה-iPSN בכמות מספקת של 1x PBS כדי להסיר פסולת ותאים מתים. נפח מאגר הליזיס שיתווסף ללוחות iPSN ישתנה. אנא עיין בטבלה 1. ודא שחומר ההתחלה הוא >2.5 מיליון iPSN.
    2. מגרדים את ה-iPSN בעזרת מגרד תאים ומעבירים אותם למאגר הליזיס הנותר בצינור החרוטי של 50 מ"ל.
    3. מכסים כל צינור חרוטי ומערבלים את הדגימות למשך 20 שניות כדי להקל על ליזיס iPSN.
    4. הניחו לדגימות לשבת על קרח למשך 1-2 דקות לפני שתמשיכו.
  3. ליזה של רקמות מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות.
    1. שקלו ~100 מ"ג של רקמת מערכת עצבים מרכזית אנושית קפואה לאחר המוות על ידי חיתוך עם סכין גילוח בצלחת פטרי המונחת על מצע של קרח יבש. הקפידו לעבוד על משטח מוקף ברפידות חד פעמיות כדי למנוע זיהום רקמות מקומי. שימו לב לחומר אפור ספציפי לעומת דיסקציה של חומר לבן (למשל, מעטפת קליפת המוח לעומת החומר הלבן הבסיסי) הנראים בזמן דיסקציה של רקמות.
      הערה: ללבוש את ה-PPE המתאים, כולל לבוש מגן עיניים וכפפות בעת טיפול בדגימות רקמות אנושיות קפואות לאחר המוות. ניתן גם להשלים שלב זה מבעוד מועד ולאחסן את הרקמות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. עם זאת, רקמה של יותר מ-100 מ"ג מניבה לעתים קרובות בידוד לא שלם של גרעינים, כפי שמעידה נוכחות של ציטופלזמה שלמה המקיפה גרעינים מסוימים.
    2. הכינו את ההומוגנייזר של Dounce על ידי ניקוי ושטיפה יסודית במים מזוקקים. מצננים את ההומוגנייזר על ידי הנחתו על קרח.
    3. הוסף 100 מ"ג רקמה להומוגניזטור Dounce טרי, שטוף ומצונן (על קרח) המכיל 2 מ"ל של מאגר הליזיס המוכן.
    4. הומוגניזציה בהומוגנייזר Dounce באמצעות ההליך הסטנדרטי על קרח.
      הערה: בדרך כלל, 10-20 פעימות לכל עלי מספיקות כדי לעבור דרך הדגימה ללא התנגדות.
    5. העברת 2 מ"ל של מוח אנושי לאחר המוות הומוגנית ל-9 מ"ל הנותרים של מאגר ליזה בצינורות חרוטיים.
    6. מערבולת במרץ במשך 30 שניות ותן לו לשבת על קרח במשך 5 דקות כדי להקל על ליזה.

4. בידוד גרעינים מ-iPSN ורקמת מערכת העצבים המרכזית האנושית לאחר המוות

  1. שכבה של 10 מ"ל של תמיסת כרית סוכרוז 1.85 M (מיוצרת בשלב 2.1.2) בתחתית צינור אולטרה-צנטריפוגה והוסף 18 מ"ל של תמיסת כרית סוכרוז 1.85 M לכל ליזאט.
  2. מערבבים בעדינות את תמיסת כרית הליזאט/סוכרוז (משולבת בשלב 4.1) על ידי היפוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
  3. הוסף לאט לאט 28 מ"ל של תערובת תמיסת כרית ליזאט/סוכרוז לחלק העליון של 10 מ"ל של תמיסת כרית סוכרוז 1.85 M בצינור האולטרה-צנטריפוגה (משלב 4.1).
    הערה: יש בסך הכל תערובת תמיסת כרית ליזאט/סוכרוז של 29 מ"ל בצינור החרוטי של 50 מ"ל (שלבים 4.1-4.2). השאירו 1 מ"ל מתמיסת כרית ליזאט/סוכרוז זו בצינור החרוטי של 50 מ"ל. זה מבטיח פיפטינג מדויק ועקבי בין כל הדגימות בשל הצמיגות של תמיסת כרית הסוכרוז.
  4. הנח את צינורות האולטרה-צנטריפוגה במחזיקים והוסף תמיסת כרית סוכרוז נוספת של 1.85 M (מיוצרת בשלב 2.1.2) לפי הצורך כדי לאזן את הדגימות.
  5. הנח את מחזיקי הדגימה ברוטור באולטרה-צנטריפוגה המצוננת וסובב ב-30,000 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  6. הסר את צינורות האולטרה-צנטריפוגה ממחזיקי הדגימה והשליך את הסופרנטנטים. גרעינים ייראו ככדורים בצדדים התחתונים של צינור האולטרה-צנטריפוגה.
  7. השעו מחדש את כדורי הגרעינים ב-1 מ"ל של מאגר אחסון הגרעינים המסופק על ידי מערבולת והעברה לצינור מיקרו-צנטריפוגה.
  8. צנטריפוגה את צינורות המיקרו-צנטריפוגה ב-2,500 x גרם, 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  9. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגרעינים על ידי מערבולת של 1 מ"ל טרי של מאגר אחסון הגרעינים המסופק.
  10. המשך עם צביעה חיסונית או אחסן את הגרעינים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן לאחסן גרעינים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד 6 חודשים ולהיות נתונים לשני מחזורי הקפאה/הפשרה לפני פגיעה בשלמות המבנית.

5. צביעה חיסונית של הגרעינים המבודדים

  1. קח מנה של 10 מיקרוליטר של תרחיף הגרעינים וספור באמצעות המציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
  2. הרכיבו את השקופיות המוכנות (משלב 1.3) לתוך הציטו-משפכים.
  3. לכל ציטומשפך, שכבה של 200 מיקרוליטר של מאגר אחסון גרעינים טריים ו~100,000 גרעינים.
  4. סובב בעדינות את הגרעינים על השקופיות על ידי הנחת הציטו-משפכים לתוך ציטוספין וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב-100 x גרם.
  5. נתק את הציטו-משפכים והוסף מיד ~100 מיקרוליטר של 4% PFA (פרפורמלדהיד) לשקופיות ודגר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן לתקן גרעינים גם עם מתנול. השתמש בשיטת קיבוע המתאימה לכל נוגדן. אם אתה משתמש במתנול, דלג על שלב החדירות (5.7). ציטומשפכים הם חד פעמיים; השליכו אותם בשלב זה.
  6. שטפו את הגרעינים 3x למשך 5 דקות עם 1x PBS.
  7. לחדור לגרעינים עם 0.1% Triton X-100 ב-1x PBS למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. חסום את הגרעינים בתמיסת בלוק (10% סרום עזים או חמור ב-1x PBS) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  9. דגרו על הגרעינים עם נוגדנים ראשוניים מדוללים בתמיסת בלוק למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  10. שטפו את הגרעינים 3x למשך 5 דקות עם 1x PBS.
  11. דגרו על הגרעינים עם נוגדנים משניים מדוללים בתמיסת בלוק למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    הערה: עדיפים נוגדנים משניים של Alexa Fluor 488, 568 ו-647.
  12. שטפו את הגרעינים 3x למשך 5 דקות עם 1x PBS.
  13. אופציונלי: דגרו את הגרעינים למשך 5 דקות עם DAPI או Hoechst ולאחר מכן שתי שטיפות נוספות של 5 דקות עם 1x PBS.
  14. החזק מגבון נטול מוך בקצה העיגול המכיל גרעינים כדי להסיר לחלוטין את שטיפת ה-PBS האחרונה.
  15. הוסף טיפה אחת (~10 μL) של מדיית הרכבה מונעת דהייה להרכבה קשיחה (ללא DAPI) לכל שקופית והנח בעדינות כיסויים מרובעים בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ על כל שקופית.
    הערה: בעת שימוש במדיה להרכבה קשיחה, אין צורך באיטום שקופיות אם השקופיות מצולמות במסגרת זמן מתאימה. תגובתיות חיסונית של Nup נשארה בדרך כלל יציבה בשקופיות לא אטומות המאוחסנות ב-4 מעלות צלזיוס למשך ~6 חודשים. עם זאת, ניתן לאטום את שולי הכיסוי בשכבה דקה של לק אם משתמשים במדיה להרכבה רטובה או לאחסון ממושך.
  16. שמור על המגלשות מוגנות מפני אור ותן להן להתרפא למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  17. דמיין את הגרעינים יכולים על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SIM).
    הערה: Zeiss, Nikon ו-GE Healthcare מייצרות כולן מיקרוסקופי SIM. עקוב אחר הפרוטוקולים הספציפיים למערכת לרכישת ועיבוד תמונות. השתמש בפרמטרי הדמיה (עוצמת לייזר, ערכות מסננים, זמן חשיפה) המתאימים לכל Nup ופלואורופור. בעת הדמיה, הימנע מקצוות המעגל (משלב 1.1) מכיוון שגרעינים אלה בדרך כלל שטוחים ומתפשטים כתוצאה משלב הצנטריפוגה (5.4). תמונות מפותלות ומעובדות לחלוטין יכולות להיות נתונות למספר ניתוחים, כולל זיהוי נקודתי ומדידות נפח באמצעות מודולי ניתוח תלת מימד סטנדרטיים בתוכנת ניתוח תמונות FIJI או Imaris. פרטים נוספים על שיטות ניתוח פורסמו לאחרונה15.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לבחון את ההתפלגות והביטוי של NPC ונוקלאופלזמה של POM121 בגרעיני עצב אנושיים, בקרה ו-C9orf72 iPSNs הובחנו כמתואר קודם לכן15. קליפת המוח המוטורית האנושית לאחר המוות ו-iPSNs ביום 32 עברו ליזה ועברו בידוד גרעינים וצביעה חיסונית כמתואר לעיל. גרעינים מבודדים חיוביים של NeuN צולמו על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (SIM) באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציה גבוהה (Zeiss) ועובדו באמצעות פרמטרי ברירת מחדל של דה-קונבולוציה של תאורה מובנית כפי שתוארו קודם לכן15 (ראה ג...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתחשב בזיהוי האחרון של ליקויים ב-NCT כתופעה מוקדמת ובולטת במחלות נוירודגנרטיביות מרובות 16,27,28,30,31, קיים צורך קריטי לבחון ביסודיות את המנגנון שבאמצעותו מתרחשת פתולוגיה זו. מכיוון שה-NPC וחלבוני ה-Nup הבודדים שלו שולטים באופן קריטי ב-NCT תפקודי39,41, חקירה של הרכב ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות CNS אנושיות לאחר המוות סופקו על ידי בנק נתיחת ה-ALS של ג'ונס הופקינס וליבת הרקמה שלאחר המוות של ALS. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הפוסט-דוקטורט של ALSA Milton Safenowitz (ANC), כמו גם מימון מ-NIH-NINDS, משרד ההגנה, איגוד ALS, האגודה לניוון שרירים, F Prime, מרכז רוברט פקארד לתוכנית ALS למחקר ALS ויוזמת צ'אן צוקרברג.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 מ"ל צינורות חרוטייםפישר סיינטיפיק14-959-49A
בקמן אולטרה-צנטריפוגהבקמן
מגרדי תאיםSarstedt83.183
קולגןמתקדם ביומטריקס5005
כיסוייםMatTekPCS-170-1818
CytofunnelThermo Fisher Scientific
Cytospin 4Fisher ScientificA78300003
Dounce HomogenizersDWK Life Sciences357542
DTTSigma AldrichD0632
Eppendorf TubesFisher Scientific05-408-129
Goat Anti-Chicken Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21449
עיזים נגד עכבר Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11029
עיזים נגד עכבר Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11031
עז נגד עכבר Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21236
עז נגד ארנב Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11034
עז נגד ארנב Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11036
עז נגד ארנב Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21245
עז נגד חולדה Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11006
עז נגד חולדה Alexa 568Thermo Fisher ScientificA-11077
עז נגד חולדה Alexa 647Thermo Fisher ScientificA-21247
HemacytometerFisher Scientific267110
מיקרוסקופ שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-15
מעבדות וקטורסרום עיזים רגילותS-1000
Nuclei PURE Prep Nuclei Nuclei Isolation KitSigma AldrichNUC201מכיל מאגר ליזה, 10% טריטון X-100, שיפוע סוכרוז 2 מ', תמיסת כרית סוכרוז ומאגר אחסון גרעינים; מתייחס בפרוטוקול כ"ערכת בידוד גרעינים"
PBSThermo Fisher Scientific10010023
PFAElectron Microscopy Sciences15714-S
Prolong Gold AntifadeInvitrogenP36930מוזכר בפרוטוקול כ"מדיית הרכבה אנטי-דהייה קשיחה"
SW 32 Ti Ultracentrifuge רוטורבקמן קולטר369694מוזכר בפרוטוקול כ"רוטור אולטרה-צנטריפוגה"
Triton X-100Sigma AldrichT9284
Trypan BlueThermo Fisher Scientific15-250-061
צינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר344058
נוגדניםראשוניים נוקלאופוריןנוגדנים ראשוניים המתאימים לזיהוי אימונו-פלואורסצנטי של נוקלאופורינים אינווידואליים זמינים במספר חברות.
קולטר A78710020

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hou, Y., et al. Ageing as a risk factor for neurodegenerative disease. Nature Reviews. Neurology. 15 (10), 565-581 (2019).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Bang, J., Spina, S., Miller, B. L. Frontotemporal dementia. Lancet. 386 (10004), 1672-1682 (2015).
  4. Blauwendraat, C., Nalls, M. A., Singleton, A. B. The genetic architecture of Parkinson's disease. The Lancet Neurology. 19 (2), 170-178 (2020).
  5. Cacace, R., Sleegers, K., Van Broeckhoven, C. Molecular genetics of early-onset Alzheimer's disease revisited. Alzheimer's & Dementia. 12 (6), 733-748 (2016).
  6. Di Resta, C., Ferrari, M. New molecular approaches to Alzheimer's disease. Clinical Biochemistry. 72, 81-86 (2019).
  7. Karch, C. M., Cruchaga, C., Goate, A. M. Alzheimer's disease genetics: from the bench to the clinic. Neuron. 83 (1), 11-26 (2014).
  8. Kovacs, G. G. Molecular pathology of neurodegenerative diseases: principles and practice. Journal of Clinical Pathology. 72 (11), 725-735 (2019).
  9. McColgan, P., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: a clinical review. European Journal of Neurology. 25 (1), 24-34 (2018).
  10. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. The Lancet. Neurology. 10 (1), 83-98 (2011).
  11. Dugger, B. N., Dickson, D. W. Pathology of neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (7), 028035(2017).
  12. Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).
  13. DeJesus-Hernandez, M., et al. Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS. Neuron. 72 (2), 245-256 (2011).
  14. Renton, A. E., et al. A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD. Neuron. 72 (2), 257-268 (2011).
  15. Coyne, A. N., et al. G(4)C(2) repeat RNA initiates a POM121-mediated reduction in specific nucleoporins in C9orf72 ALS/FTD. Neuron. 107 (4), 1124-1140 (2020).
  16. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  17. D'Angelo, M. A., Raices, M., Panowski, S. H., Hetzer, M. W. Age-dependent deterioration of nuclear pore complexes causes a loss of nuclear integrity in postmitotic cells. Cell. 136 (2), 284-295 (2009).
  18. Hetzer, M. W. The role of the nuclear pore complex in aging of post-mitotic cells. Aging (Albany NY). 2 (2), 74-75 (2010).
  19. Savas, J. N., Toyama, B. H., Xu, T., Yates, J. R., Hetzer, M. W. Extremely long-lived nuclear pore proteins in the rat brain. Science. 335 (6071), 942(2012).
  20. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  21. Nofrini, V., Di Giacomo, D., Mecucci, C. Nucleoporin genes in human diseases. European Journal of Human Genetics. 24 (10), 1388-1395 (2016).
  22. Sakuma, S., D'Angelo, M. A. The roles of the nuclear pore complex in cellular dysfunction, aging and disease. Seminars in Cell & Developmental Biology. 68, 72-84 (2017).
  23. Basel-Vanagaite, L., et al. Mutated nup62 causes autosomal recessive infantile bilateral striatal necrosis. Annals of Neurology. 60 (2), 214-222 (2006).
  24. Nousiainen, H. O., et al. Mutations in mRNA export mediator GLE1 result in a fetal motoneuron disease. Nature Genetics. 40 (2), 155-157 (2008).
  25. Cronshaw, J. M., Matunis, M. J. The nuclear pore complex: disease associations and functional correlations. Trends in Endocrinology and Metabolism. 15 (1), 34-39 (2004).
  26. Chou, C. C., et al. TDP-43 pathology disrupts nuclear pore complexes and nucleocytoplasmic transport in ALS/FTD. Nature Neuroscience. 21 (2), 228-239 (2018).
  27. Eftekharzadeh, B., et al. Tau protein disrupts nucleocytoplasmic transport in Alzheimer's disease. Neuron. 99 (5), 925-940 (2018).
  28. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  29. Gasset-Rosa, F., et al. Polyglutamine-expanded huntingtin exacerbates age-related disruption of nuclear integrity and nucleocytoplasmic transport. Neuron. 94 (1), 48-57 (2017).
  30. Grima, J. C., et al. Mutant huntingtin disrupts the nuclear pore complex. Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).
  31. Jovicic, A., et al. Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS. Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).
  32. Guo, L., et al. Nuclear-import receptors reverse aberrant phase transitions of RNA-binding proteins with prion-like domains. Cell. 173 (3), 677-692 (2018).
  33. Hofweber, M., et al. Phase Separation of FUS Is Suppressed by Its Nuclear Import Receptor and Arginine Methylation. Cell. 173 (3), 706-719 (2018).
  34. Yoshizawa, T., et al. Nuclear Import Receptor Inhibits Phase Separation of FUS through Binding to Multiple Sites. Cell. 173 (3), 693-705 (2018).
  35. Chew, J., et al. Aberrant deposition of stress granule-resident proteins linked to C9orf72-associated TDP-43 proteinopathy. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 9(2019).
  36. Zhang, Y. J., et al. Poly(GR) impairs protein translation and stress granule dynamics in C9orf72-associated frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis. Nat Medicine. 24 (8), 1136-1142 (2018).
  37. Zhang, Y. J., et al. C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins. Nature Neuroscience. 19 (5), 668-677 (2016).
  38. Zhang, Y. J., et al. Heterochromatin anomalies and double-stranded RNA accumulation underlie C9orf72 poly(PR) toxicity. Science. 363 (6428), (2019).
  39. Beck, M., Hurt, E. The nuclear pore complex: understanding its function through structural insight. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (2), 73-89 (2017).
  40. Lin, D. H., Hoelz, A. The structure of the nuclear pore complex (an update). Annual Review of Biochemistry. 88, 725-783 (2019).
  41. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complex composition: a new regulator of tissue-specific and developmental functions. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 13 (11), 687-699 (2012).
  42. Kinoshita, Y., Kalir, T., Dottino, P., Kohtz, D. S. Nuclear distributions of NUP62 and NUP214 suggest architectural diversity and spatial patterning among nuclear pore complexes. PLoS One. 7 (4), 36137(2012).
  43. Ori, A., et al. Cell type-specific nuclear pores: a case in point for context-dependent stoichiometry of molecular machines. Molecular Systems Biology. 9, 648(2013).
  44. Rajoo, S., Vallotton, P., Onischenko, E., Weis, K. Stoichiometry and compositional plasticity of the yeast nuclear pore complex revealed by quantitative fluorescence microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (17), 3969-3977 (2018).
  45. Li, C., Goryaynov, A., Yang, W. The selective permeability barrier in the nuclear pore complex. Nucleus. 7 (5), 430-446 (2016).
  46. Raices, M., D'Angelo, M. A. Nuclear pore complexes and regulation of gene expression. Current Opinion in Cell Biology. 46, 26-32 (2017).
  47. Pascual-Garcia, P., Capelson, M. Nuclear pores in genome architecture and enhancer function. Current Opinion in Cell Biology. 58, 126-133 (2019).
  48. Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
  49. Maglione, M., Sigrist, S. J. Seeing the forest tree by tree: super-resolution light microscopy meets the neurosciences. Nature Neuroscience. 16 (7), 790-797 (2013).
  50. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative superresolution microscopy. Nature Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  51. Wu, Y., Shroff, H. Faster, sharper, and deeper: structured illumination microscopy for biological imaging. Nature Methods. 15 (12), 1011-1019 (2018).
  52. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled nuclear pores insert into the nuclear envelope during early development. Cell. 166 (3), 664-678 (2016).
  53. Hampoelz, B., et al. Nuclear pores assemble from nucleoporin condensates during oogenesis. Cell. 179 (3), 671-686 (2019).
  54. Agote-Aran, A., et al. Spatial control of nucleoporin condensation by fragile X-related proteins. The EMBO Journal. 39 (20), 104467(2020).
  55. Colombi, P., Webster, B. M., Fröhlich, F., Lusk, C. P. The transmission of nuclear pore complexes to daughter cells requires a cytoplasmic pool of Nsp1. The Journal of Cell Biology. 203 (2), 215-232 (2013).
  56. Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
  57. Löschberger, A., Franke, C., Krohne, G., van de Linde, S., Sauer, M. Correlative super-resolution fluorescence and electron microscopy of the nuclear pore complex with molecular resolution. Journal of Cell Science. 127, Pt 20 4351-4355 (2014).
  58. Löschberger, A., et al. Super-resolution imaging visualizes the eightfold symmetry of gp210 proteins around the nuclear pore complex and resolves the central channel with nanometer resolution. Journal of Cell Science. 125, Pt 3 570-575 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Nuclei IsolationStructured Illumination MicroscopyNuclear Pore ComplexNucleoporin AlterationsNucleocytoplasmic TransportSuper Resolution MicroscopyHuman NeurodegenerationiPSC Derived CNS CellsAntibody LabelingPostmortem Tissues
Video Coming Soon

Related Articles