מאמר שיטה

הערכה כמותית של מקרופינוציטוזיס בתאים היפראקטיביים mTORC1 באמצעות ציטומטריית זרימה

DOI:

10.3791/62793

⸱

2 באוגוסט 2021

 , 
1Pulmonary and Critical Care Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, 2Metcalf Science Center, Chemistry Department, Boston University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק כלים ניסיוניים להערכת ספיגה מקרופינוציטית של חומרים מזינים (פחמימות וחלבון) על ידי תאים היפראקטיביים mTORC1. מתוארים שלבים מפורטים לכימות הספיגה של אלבומין דקסטרן וסרום בקר (BSA) המסומנים בפלורסנט פלואורסצנטי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופינוציטוזיס הוא תהליך אנדוציטי שמור מאוד, תלוי אקטין המאפשר ספיגה של חומר חוץ-תאי, כולל חלבונים ושומנים. בתאים מתרבים, מקרופינוציטוזיס יכול לספק חומרים מזינים חוץ-תאיים לליזוזום, המעובדים לאבני בניין מקרומולקולות קריטיות. מחקרים אחרונים הדגישו את התלות של סוגי סרטן מרובים במקרופינוציטוזיס, כולל סרטן השד, המעי הגס והלבלב. מוטציות Ras נחשבות לאירועים המניעים מאחורי התחלת מקרופינוציטוזיס, מה שמוביל להפעלת תהליכים אנבוליים תאיים באמצעות מסלול האיתות mTORC1. מעניין ש-mTORC1 יכול להיות מופעל גם על ידי מקרופינוציטוזיס ללא תלות ב-Ras. לכן, מקרופינוציטוזיס מייצגת פגיעות מטבולית שניתן למנף כדי למקד גידולים מקרופינוציטיים על ידי הגבלת הגישה שלהם לחומרים מזינים מבחינה טיפולית.

בקומפלקס טרשת שחפת (TSC) ו-Lymphangioleiomyomatosis (LAM), פעילות יתר של mTORC1 מובילה לשיפור המקרופינוציטוזיס ולתכנות מחדש מטבולי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס ציטומטריית זרימה להערכת מקרופינוציטוזיס בתאי יונקים באופן כמותי. נעשה שימוש ב-MEFs חסרי TSC2, המציגים הפעלה חריגה של mTORC1 והוכח כי יש להם מקרופינוציטוזיס מוגבר בהשוואה לתאים המבטאים TSC2. תאים שטופלו במעכבים פרמקולוגיים של מקרופינוציטוזיס מודגרים עם תווית פלואורסצנטית, ניתנת לתיקון ליזין, דקסטרן 70 kDa, או אלבומין בסרום בקר (BSA) עם תווית פלואורסצנטית שנבדקה על ידי ציטומטריית זרימה. עד כה, פותחו טכניקות מבוססות תמונה חזקות להערכה כמותית של מקרופינוציטוזיס בתאי גידול במבחנה וב-vivo. ניתוח זה מספק הערכה כמותית של מקרופינוציטוזיס בתנאי ניסוי מרובים ומשלים טכניקות מבוססות תמונה קיימות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקרופינוציטוזיס הוא תהליך אנדוציטי המוקדש לספיגה בתפזורת של חומר חוץ-תאי ואחריו היווצרות מקרופינוזומים, ממוחזרים לקרום הפלזמה או מתמזגים עם ליזוזומים כדי לפרק את המטען המופנם 1,2. למרות שקליטת המטען אינה סלקטיבית, מקרופינוציטוזיס הוא תהליך רב-שלבי, המוסדר היטב על ידי Rab GTPases ופוספוליפידים ממברניים 3,4. יש לציין שתאי סרטן משתמשים במקרופינוציטוזיס כדי להפנים חומרים מזינים חוץ-תאיים, כולל חלבונים, פוליסכרידים ושומנים. מקרופינוציטוזיס בתאי סרטן מופעל על ידי אונקוגנים במורד הזרם של Ras או v-Src כמנגנון לתמיכה בשגשוגם, במיוחד בתנאי עקה תזונתית 5,6. לכן, מקרופינוציטוזיס מייצגת גישה טיפולית חדשה למיקוד תאים סרטניים על ידי שיבוש מסלולי קליטת חומרים מזינים 7,8.

בקומפלקס טרשת שחפת (TSC) ו-Lymphangioleiomyomatosis (LAM), אובדן מוטציות תפקוד ב-TSC1 או TSC2 מוביל לפעילות יתר של המטרה היונמית/מכניסטית של קומפלקס רפמיצין 1 (mTORC1)9. ידוע כי הפעלה חריגה של mTORC1 מניעה תכנות מחדש מטבולי נרחב, כולל ספיגה וניצול של גלוקוז וגלוטמין, סינתזה משופרת של חומצות גרעין, סינתזת שומנים ואוטופגיה10,11. כדי לפצות על הדרישות האנאבוליות המוגברות הללו, תאים היפראקטיביים mTORC1 מגבירים את הספיגה של חומרים מזינים אקסוגניים באמצעות מקרופינוציטוזיס ומשפרים את הפירוק הליזוזומלי של מטען מופנם12. בעבודה שנערכה לאחרונה, זיהינו ריטנסרין, מעכב של דיאצילגליצרול קינאז אלפא (DGKA) כחומר המעכב באופן סלקטיבי את התפשטותם של תאים חסרי TSC2 13. DGKA הוא ליפיד קינאז המבצע חילוף חומרים של דיאצילגליצרול לחומצה פוספטית (PA)14. PA היא מולקולת שליח שנייה חיונית הממלאת גם תפקיד חיוני בשמירה על הומאוסטזיס של קרום התא. באופן מפתיע, ריטנסרין מעכב מאוד את המקרופינוציטוזיס על ידי תכנות מחדש של חילוף החומרים של פוספוליפידים בתאים חסרי TSC2. לכן, התמקדות במסלול ספיגת החומרים המזינים של מקרופינוציטוזיס בתאים חסרי TSC2 עשויה לספק גישות טיפוליות חדשות ב-TSC ו-LAM.

כימות ספיגה מקרופינוציטית במבחנה וב-vivo יכול לספק תובנות מכריעות לגבי ויסות היווצרות מקרופינוזומים ולהאיץ את גילוי המנגנונים המולקולריים תוך זיהוי גישות טיפוליות חדשות 2,6. עד כה פותחו מתודולוגיות מרובות המכמתות כראוי את הספיגה המקרופינוציטית של דקסטרן פלואורסצנטי הן במבחנה והן בגוףהחי 2,15. כאן אנו מתארים גישה מבוססת ציטומטריית זרימה להערכה ישירה של כמות הדקסטרן והאלבומין המופנמים בתאים היפראקטיביים mTORC1 (איור 1). ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תנאי ניסוי מרובים במקביל ומשלימה גישות מבוססות תמונה קיימות.

figure-introduction-1
איור 1. זרימת עבודה להערכת מקרופינוציטוזיס בתאי יונקים. התאים נזרעים בצלחות של שש בארות ולאחר מכן מטופלים בתרכובות מעניינות. דקסטרן פלואורסצנטי או BSA מתווספים למשך 60 דקות, והספיגה מעוכבת על ידי שטיפה עם PBS קר כקרח. תאים מקובעים באמצעות פרפורמלדהיד, ועוצמת הקרינה מכומתת על ידי ציטומטריית זרימה. התאים מגודרים, והנתונים מנותחים באמצעות התוכנה המתאימה. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיפול בתאים

יום 1

  1. זרעים של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs) חסרי TSC2 ומבטאים TSC2 בשלושה עותקים, בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת שש בארות באמצעות DMEM, בתוספת 10% FBS. התאים צריכים להיות 60-70% מתכנסים עד היום השלישי.
    1. זרע בארות בקרה נוספות לכל מצב תרופה שלא יוכתם ב-FITC-Dextran או TMR-BSA.

יום 2

  1. שאפו בזהירות את המדיה ושטפו את התאים פעמיים עם PBS בטמפרטורת החדר.
    1. טפל בתאים עם רכב (DMSO), 100 מיקרומטר של חומצה פוספטית (PA), 25 מיקרומטר של EIPA, 10 מיקרומטר של ריטנסרין או שילוב של PA וריטנסרין. יש להשתמש ב-DMEM בתוספת 1% FBS.
      הערה: נפח DMSO צריך להיות שווה לנפח המקסימלי של הממס המשמש בתנאי טיפול. לדוגמה, אם משתמשים ב-10 מיקרוליטר של EIPA, נפח ה-DMSO בתנאי הרכב צריך להיות גם 10 מיקרוליטר.

יום 3

  1. החלף את המדיה ב-DMEM ללא סרום המכיל את התרופות שהוזכרו לעיל ו-0.5 מ"ג/מ"ל של FITC-Dextran או 0.5 מ"ג/מ"ל של TMR-BSA 16 שעות לאחר הטיפול. דגרו את התאים בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 למשך 60 דקות.
    הערה: כדי למזער את ההלבנה של הפלואורופורים, יש לעטוף את צינורות FITC-Dextran ו-TMR-BSA בנייר אלומיניום ולבצע את הניסוי בארון תרבית תאים כשהאורות כבויים.
  2. שאפו מדיה ושטפו פעמיים עם PBS קר כקרח.
    1. נתק תאים באמצעות 500 מיקרוליטר טריפסין. יש להניח תאים בחממת תרבית תאים של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 למשך 2-3 דקות.
      הערה: ודא שכל התאים מנותקים על ידי התבוננות בהם תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
    2. בעזרת קצה פיפטה נקי בכל פעם, אספו תאים בצינורות של 1.5 מ"ל באמצעות DMEM בתוספת 1% FBS על קרח.
    3. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב-425 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    4. שאפו את הסופרנטנט.
  3. השעו מחדש את גלולת התא באמצעות 50 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד.
    זהירות: פרפורמלדהיד רעיל מאוד ויש לטפל בו מתחת למכסה אדים מתאים. יש להשליך פסולת המכילה פורמלדהיד בהתאם להנחיות המוסדיות.
    1. דגרו תאים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    2. הוסף 1 מ"ל PBS קר כקרח לכל צינור והשהה מחדש את כדור התא בעדינות. הניחו את הצינורות על קרח.
  4. תאי צנטריפוגה ב-425 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  5. שאפו את הסופרנטנט.
    1. השעו מחדש את כדור התא ב-300 מיקרוליטר של PBS קר כקרח.
    2. העבירו תאים לצינורות ה-FACS המתאימים על קרח.
    3. המשך עם ציטומטריית זרימה.

2. ציטומטריית זרימה

  1. מערבל בקצרה את התאים לפני הכנסתם למחזיק הדגימה של FACS.
  2. באמצעות זרימה במהירות נמוכה, שער תאים חיים מכל דגימה לא מוכתמת (בקרה שלילית) באמצעות עוצמת לייזר מתאימה כפי שניתן לראות באיור 2A. שלב זה שונה בין מכשירים ויהיה צורך לבצע אופטימיזציה עבור כל ניסוי. כוונן את ההספק הן עבור פיזור קדימה (FSC) והן עבור פיזור צדדי (SSC) כך שתאים חיים יהיו נבדלים מפסולת או אשכולות תאים.
  3. באמצעות תכונת השער האוטומטי, בחר את אוכלוסיות התאים החיות עבור כל דגימה תוך הימנעות מפסולת תאים ואשכולות תאים.
    הערה: כל אירועי התא (ללא קשר לשער) נרשמים בסופו של דבר על ידי הציטומטר. לכן בחירת שער בשלב זה אינה קריטית.
  4. רשום את עוצמת הקרינה מכל דגימה באמצעות הלייזרים הירוקים או האדומים המתאימים.

3. ניתוח ציטומטריית זרימה

  1. תאי שער באמצעות פרמטרי פיזור קדימה וצדדית. החל את אותו שער על כל הדגימות.
  2. צור היסטוגרמות עבור פלואורסצנטיות בכל דגימה כמו באיור 2B.
  3. בתוך כל שער תא חשב את עוצמת הקרינה הממוצעת/חציונית עבור כל הדגימות.
  4. ייצוא נתונים לניתוח סטטיסטי מתאים.
    הערה: במהלך ניתוח הנתונים, יש לנרמל את עוצמת הקרינה הממוצעת/חציונית של כל דגימה על ידי הפחתת ערכי הדגימה הלא מוכתמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ריטנסרין מעכב מקרופינוציטוזיס בתאים חסרי TSC2
הראינו בעבר כי ספיגת מקרופינוציט של חומרים מזינים מוגברת פי שלושה בתאים חסרי TSC2 בהשוואה לתאים המבטאים TSC2 16. ב-TSC ו-LAM, מקרופינוציטוזיס מתווכת באמצעות דיאצילגליצרול קינאז אלפא (DGKA). התוצר המטבולי של DGKA הוא חומצה פוספטית (PA), מרכיב חיוני בקרומי התאים. לכן, שיערנו כי עיכוב של DGKA על ידי ריטנסרין עשוי להשפיע על סחר שלפוחית מקרופינוציטי בתאים חסרי TSC2. כד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים גישה כמותית להערכת מקרופינוציטוזיס באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מספקת מדידה מדויקת ומהירה של דקסטרן המטען המקרופינוציטי המסומן פלואורסצנטי ואלבומין. מחקרים קודמים אפיינו בקפידה את האינדקס המקרופינוציטי של תאים סרטניים באמצעות גישות מיקרוסקופיה קונפוקלית15,20. למרות ששיטות אלו מכמתות במדויק את ההפנמה, הגודל וההתפלגות המרחבית של מקרופינוזומים, הן דורשות ניתוח של תמונות מרובות עבור כל תנאי ניסוי. לעומת זאת, הטכנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרס פיתוח הקריירה של קרן LAM. איור 1 נוצר עם BioRender.com. הקריאה הביקורתית בוצעה על ידי הילר סי לאם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMGibco11965-092מצע גידול
EIPA (אמילוריד)Sigma AldrichA3085מעכב מקרופינוציטוזיס
FBSR& D SystemsS11150סרום בקר עוברי
FITC-DextranInvitrogenD1822פוליסכריד פלואורסצנטי (70kDa)
ParafolmadehydePierce28906חומר קיבוע
PBSGibco10010-023מאגר פוספט
פניצילין/סטרפטומיציןסיגמא אולדריץ'P4458-100MLאנטיביוטיקה
לתרבית תאיםחומצה פוספטיתAvanti840101Pפוספוליפיד שמקורו בביצה
ריטנסריןטוקריס1955מעכב DGKA
TMR-BSAInvitrogenA23016אלבומין פלואורסצנטי
טריפסיןסיגמא אולדריץ'25300-054חומר דיסוציאציה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yoshida, S., Pacitto, R., Inoki, K., Swanson, J. Macropinocytosis, mTORC1 and cellular growth control. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (7), 1227-1239 (2018).
  2. Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497 (7451), 633-637 (2013).
  3. Maxson, M. E., Sarantis, H., Volchuk, A., Brumell, J. H., Grinstein, S. Rab5 regulates macropinocytosis by recruiting the inositol 5-phosphatases OCRL/Inpp5b that hydrolyze PtdIns(4,5)P2. Journal of Cell Science. , (2021).
  4. Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24 (11), 1712(2013).
  5. Ramirez, C., Hauser, A. D., Vucic, E. A., Bar-Sagi, D. Plasma membrane V-ATPase controls oncogenic RAS-induced macropinocytosis. Nature. 576 (7787), 477-481 (2019).
  6. Kamphorst, J. J., et al. Human pancreatic cancer tumors are nutrient poor and tumor cells actively scavenge extracellular protein. Cancer Research. 75 (3), 544-553 (2015).
  7. Kim, S. M., et al. Targeting cancer metabolism by simultaneously disrupting parallel nutrient access pathways. Journal of Clinical Investigation. 126 (11), 4088-4102 (2016).
  8. Selwan, E. M., Finicle, B. T., Kim, S. M., Edinger, A. L. Attacking the supply wagons to starve cancer cells to death. FEBS Letters. 590 (7), 885-907 (2016).
  9. Henske, E. P., Jozwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16035(2016).
  10. Duvel, K., et al. Activation of a metabolic gene regulatory network downstream of mTOR complex 1. Molecular Cell. 39 (2), 171-183 (2010).
  11. Sancak, Y., et al. The Rag GTPases bind raptor and mediate amino acid signaling to mTORC1. Science. 320 (5882), 1496-1501 (2008).
  12. Choo, A. Y., et al. Glucose addiction of TSC null cells is caused by failed mTORC1-dependent balancing of metabolic demand with supply. Molecular Cell. 38 (4), 487-499 (2010).
  13. Kovalenko, A., et al. Therapeutic targeting of DGKA-mediated macropinocytosis leads to phospholipid reprogramming in Tuberous Sclerosis Complex. Cancer Research. , (2021).
  14. Swanson, J. A. Phorbol esters stimulate macropinocytosis and solute flow through macrophages. Journal of Cell Science. 94, Pt 1 135-142 (1989).
  15. Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9 (1), 182-192 (2014).
  16. Filippakis, H., et al. Vps34-mediated macropinocytosis in Tuberous Sclerosis Complex 2-deficient cells supports tumorigenesis. Scientific Reports. 8 (1), 14161(2018).
  17. Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biol Int. 39 (5), 531-539 (2015).
  18. Jachimska, B., Wasilewska, M., Adamczyk, Z. Characterization of globular protein solutions by dynamic light scattering, electrophoretic mobility, and viscosity measurements. Langmuir. 24 (13), 6866-6872 (2008).
  19. Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87 (6), 4259-4270 (2004).
  20. Lee, S. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and Quantification of Macropinosomes in Pancreatic Tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
  21. Williams, T. D., Kay, R. R. The physiological regulation of macropinocytosis during Dictyostelium growth and development. Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).
  22. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. Journal of Cell Biology. 188 (4), 547-563 (2010).
  23. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  24. Murphy, R. F. Analysis and isolation of endocytic vesicles by flow cytometry and sorting: demonstration of three kinetically distinct compartments involved in fluid-phase endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (24), 8523-8526 (1985).
  25. Williams, T., Kay, R. R. High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry. Journal of Visualized Experiments. (139), e58434(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MEFs TSC2Ras
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים