מאמר שיטה

מדידת מתחמי העברת אלקטרונים מיטוכונדריאליים ברקמת לב קפואה בעבר מצאצאי החזירה: מודל להערכת שינויים ביו-אנרגטית מיטוכונדריאליים הנגרמים על ידי פעילות גופנית

DOI:

10.3791/62809

⸱

16 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1AdventHelath, 2University of Illinois Chicago School of Public Health, 3Lincoln Memorial University, 4Children’s Mercy Hospital, 5Scripps Clinic, 6Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 7Kansas City University, 8Roblex Rex Veterans Affairs Medical Center, 9California State University San Marcos, 10East Carolina University, 11Massachusetts Institute of Technology, 12Boehringer Ingelheim Norway KS, 13Heartland Center for Mitochondrial Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת דגימות מועשרות במיטוכונדריה מרקמות מוצקות שהוקפאו בעבר בארכיון אפשרה לחוקרים לבצע הערכות פונקציונליות ואנליטיות של המיטוכונדריה במודלים ניסיוניים שונים. מחקר זה מדגים כיצד להכין תכשירים מועשרים במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה ולבצע הערכות אנליטיות של המיטוכונדריה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל קומפלקס העברת האלקטרונים המיטוכונדריאלי (ETC) משתנה ברקמת הלב של הצאצא שנולד לזרועה מאומתנת. ההשערה שהוצעה ונבדקה הייתה שתרגיל אימהי קבוע של זריעה במהלך ההריון יגביר את היעילות המיטוכונדריאלית של ביו-אנרגטיקה של לב צאצאים. השערה זו נבדקה על ידי בידוד המיטוכונדריה באמצעות הליך בידוד מתון להערכת פרופילים מיטוכונדריאלי ETC וסופר-קומפלקס. ההליך המתואר כאן אפשר עיבוד של רקמות לב שהוקפאו בעבר בארכיון וביטל את הצורך בהכנת מיטוכונדריה טרייה להערכת מתחמי מיטוכונדריאלי ETC, מחשבי על ופרופילי פעילות מורכבים ETC. פרוטוקול זה מתאר את המדידה האופטימלית של קומפלקס חלבון ETC בחיסון מבוסס נוגדנים מרובי מולטיפלקסים והערכה סופר מורכבת באמצעות אלקטרופורזה ג'ל כחול-ילידי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה הייתה לספק צעדים מפורטים כדי להשיג הכנה מועשרת במיטוכונדריה מרקמת לב קפואה בעבר עם טכנולוגיה חדשה של הפרעה מכנית באנרגיה נמוכה של רקמות המשפרת תמה רקמה ומיצוי של מיטוכונדריה. בשיטה זו, יעילות מיצוי משופרת מבלי ליצור מתח גיסת גבוה או טמפרטורה גבוהה וזמן הומוגניזציה קצר (10-12 s) הופכים בר השגה1.

כדי להשיג מיטוכונדריה מרקמה קפואה בארכיון הוא נכס בעל ערך לביצוע הן מחקרים פונקציונליים2 והן ביוכימיים3 אחרת לא ניתן לחזור בקלות בתנאי הניסוי המדויקים. נעשה שימוש בהומוגניזר זכוכית קדר-אלווהג'ם טפלון קלאסי או הומוגניזר דונסה ועדיין נמצא בשימוש במעבדות מחקר להומוגניזציה של רקמות רכות כגון כבד, כליות ומוח. עם זאת, הומוגניזציה של רקמות קשות כגון שריר ולב דורשת יותר זמן הומוגניזציה, טיפול באנזים, הומוגניזציה במהירות גבוהה וחוויית משתמש נרחבת. זה חסרון לחילוץ אברונים שלמים כגון מיטוכונדריה מרקמה קשה כגון שריר ולב. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה משמשת להשגת הכנה מועשרת במיטוכונדריה בתפוקה גבוהה לניתוח מתחמי חלבון של שרשרת הובלת אלקטרונים מיטוכונדריאליים (ETC) ויצירת מחשב העל שלהם ברקמות הלב שנקצרו צאצאים שנולדו לזרועה מאומתנת בישיבה, קפואה בחנקן נוזלי, ומאוחסנת ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש עתידי. שיטה זו מאפשרת למשתמש לבודד את ההכנה המועשרת במיטוכונדריה מרקמות ארכיון שהוקפאו בעבר.

חשיפה ננו-חומרית חיצונית מכרסמים בהריון יכולה להשפיע לרעה על תפקוד הלב ועל הנשימה המיטוכונדריאלית ועל הביו-אנרגטיקה על צאצאים במהלך ההריון4. עם זאת, שינויים חיוביים הנגרמים על ידי פעילות אירובית ביו-אנרגטית מיוציטית עוברית במהלך ההריון טרם תועדו. עם זאת, מחקרים מתעוררים מספקים ראיות כי פעילות אירובית אימהית במהלך ההריון יש השפעה חיובית על תפקוד הלב העובר5. על מנת לספק ראיות נוספות, בוצע ניתוח ההשפעות האורך של פעילות גופנית אימהית על מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאליים של הצאצאים (כלומר, קומפלקס I באמצעות Complex V) במהלך ההריון.

מחקר זה יש רלוונטיות בריאותית משמעותית מאז התוצאות עשויות להציע כי פעילות גופנית אימהית משפרת את היעילות של ייצור אנרגיה במיטוכונדריה הלבבית של הצאצאים. במחקר זה, חזירות (חזירה נקבה) שימשו כמודל לבעלי חיים משתי סיבות: (i) פיזיולוגיה לבבית דומה לאדם6, ו -(ii) קציר רקמת לב צאצאים מנקודות זמן שונות אפשרי תחת אישור IACUC מוסדי. המחקר המוצע נועד לענות על רבות מהשאלות הבסיסיות המקשרות בין פעילות אימהית לבין השפעותיה החיוביות הפוטנציאליות על ההרכב התאי והביוכימי של רקמת הלב של הצאצא. גישה זו דורשת טכניקות בידוד מיטוכונדריה עדינות אך יעילות מרקמת לב קפואה בעבר שהתקבלו ממחקרי אורך ארוכים ויקרים שהתייחסו לבעיות השינויים הביו-אנרגטיים בתוך מיוציטים לב עובריים במהלך ההריון. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת ניצול סכומים גדולים של רקמה ארכיונית שהוקפאה בעבר להכנת מיטוכונדריה מועשרת הן במחקרים אנליטיים והן במחקרים פונקציונליים. המחקר גם יסייע למלא את פער הידע בתחום זה על ידי מתן נתונים ראשוניים, אשר יכול להוביל מחקרים עתידיים הקובעים את ההשפעות של פעילות גופנית אימהית על בריאות הלב ברחם ומעבר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות לב קפואות התקבלו מד"ר שון ניו-עולה יחד עם מכתב האישור המוסדי של IACUC. רקמות הלב התקבלו ממחקר אורך לטווח ארוך, פלאש קפוא בחנקן נוזלי, ואוחסנו ב -80 °C (80 °F) לשימוש עתידי. כל הפרוטוקולים הנוגעים לעיבוד רקמת לב של צאצאים פעלו בהתאם להנחיות של אוניברסיטת קנזס סיטי IBC וועדות IACUC.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים

הערה: הכן את כל הדגימות בהתאם להנחיות היצרן. השתמש במים מטוהרים במיוחד או שווה ערך בכל המתכונים ושלבי הפרוטוקול. ללבוש ציוד הגנה אישי (מעבדה לאיד, מסכת פנים, כפפות, ומשקפי מגן / מגן פנים) במהלך הליך זה. נפחי חוצץ מתאימים לעיבוד שש דגימות רקמה.

  1. הכן חוצץ שטיפת רקמות ב-1.5 ליטר על-ידי שילוב של 154.035 גרם סוכרוז (0.3 מ' סופי), 3.904 גרם של HEPES (10 מ"מ סופי), 0.111 גרם של EDTA (0.2 מ"ר סופי). הוסיפו את המרכיבים ל-1.0 ליטר מים בזמן שאתם על צלחת ההנעה, התאימו את רמת ה-pH ל-7.2 עם HCl מדלל, ואיפור לנפח הסופי ל-1.5 ליטר.
    הערה: כ 200 מ"ל של חוצץ כביסה נדרש לכל מדגם (50-300 מ"ג). ניתן לעבד שש דגימות רקמה ביום. השתמש במאגר הכביסה הנותר כדי ליצור מאגר בידוד.
  2. הכן את מאגר הבידוד ממאגר הכביסה שתואר בעבר בשלב 1.1 על-ידי הוספת 210 מ"ג של BSA ב-210 מ"ל של מאגר כביסה. התאימו את ה-pH ל-7.4 בעזרת תמיסה מדללת של NaOH.
    הערה: כ 35 מ"ל של חיץ בידוד נדרש לכל דגימת רקמה; לכן, 210 מ"ל של חוצץ בידוד נדרש עבור שש דגימות. הכן מאגר זה על ידי הוספת פתרון BSA טרי (1mg/mL סופי) ביום ההכנה. BSA משמש כדי לבודד את המיטוכונדריה כפי שהוא משפר את המאפיינים המיטוכונדריאליים על ידי הסרת uncouplers טבעי כגון חומצות שומן חינם. BSA נמצאה כפעילות נוגדת חמצון על ידי הגדלת שיעור החמצון של מצעים, במיוחד תמציתי, במיטוכונדריה במוח7. לחלופין, אלבומין בסרום בקר יכול להיות מוחלף על ידי אנלוגים פחות יקרים ללא חומצה כגון אובלבומין.
  3. הכן 150 מ"ל של מאגר resuspension על ידי שילוב של 0.011 גרם של EDTA (ריכוז סופי של 0.2 מ"מ EDTA או להשתמש 150 μL של 200 mM מלאי פתרון EDTA עבור 150 מ"ל של חוצץ resuspension), 12.836 גרם של סוכרוז (0.25 M סוכרוז ריכוז סופי), ו 0.236 גרם של טריס (10 mM טריס-HCl סופי). כוונן את ה- pH ל- 7.8 עם 0.1 N NaOH. יש להוסיף 60 מיקרול של קוקטייל מעכב הפרוטאז רגע לפני השימוש.
  4. הכן את פתרון טריפסין על ידי המסת 7.5 מ ג של טריפסין ב 3.0 מ"ל של 1 mM HCl (2.5 מ"ג של טריפסין / mL סופי). סכום זה מספיק עבור מדגם אחד.
    הערה: הכן את פתרון טריפסין בהתבסס על מספר דגימות הרקמות המתוכננות לעיבוד.
  5. הכן את פתרון מעכב טריפסין מ פולי סויה על ידי שילוב של 13.0 מ ג של מעכב טריפסין ב 20 מ"ל של חוצץ בידוד המכיל BSA (0.65 מ"ג / מ"ל של מעכב טריפסין סופי).
    הערה: הכן פתרון מעכב טריפסין טרי.
  6. הכן את האמוניום אפולפט ריאגנט על ידי הוספת 0.1 גרם של אמוניום אסולפט ב 1 מ"ל של מים (10% אמוניום אסולפט סופי).
    הערה: האמוניום אסולפט ריאגנט צריך להיות מוכן טרי או נפח גדול ניתן aliquoted ושמר במקפיא -20 °C ..
  7. הכן את פתרון חומצת אמינוקפרואית (ACA) על ידי שילוב של 0.131 גרם של חומצה קפרואית 6 אמינו ב 1.0 מ"ל של מים מטוהרים במיוחד ולאחסן אותו ב 4 °C (1 M 6-חומצה אמינוקפרואית סופית).
  8. הכן את פתרון הצבע הכחול המבריק של קומאסי על ידי המסת 1 גרם של קומאסי G-250 ב-0.5 מ"ל של מים, ו-0.5 מ"ל של חומצה אמינוקפרואית 1 M (10% תמיסת צבע בריכוז הסופי).
  9. הכן 5% דיגיטונין עבור דף מקורי כחול (BN-PAGE). בערך לחשב כמה digitonin נדרש בהכנת המדגם בתוספת קצת נפח נוסף כדי לקזז את שגיאות pipetting (הערכת יתר על ידי 10 מ"ג). עבור 15 מ"ג: ראשית, לדלל 15 מ"ג של דיגיטונין ב 30 μL של 100% DMSO. מערבולת כדי לעזור לדיגיטונין להיכנס לפתרון. לאחר מכן, הוסף את 90% הנותרים של ddH2O (270 μL). מחממים בעדינות כדי לערבב את התמיסה (מערבולת), ולאחר מכן לקרר אותו על קרח.
  10. הכן את מאגר האנודה המקורי של הדף. הוסף 50 מ"ל של מאגר ריצה מקורי של PAGE 20x למים של 950 מ"ל כדי ליצור נפח סופי של 1 ליטר. הכן מאגר אנודה טרי לשימוש מיידי. השתמש באפשרות זו כמאגר פועל של 1x.
  11. הכן מאגר קתודה כחול כהה. להמיס 0.0160 גרם של Coomassie כחול מבריק G-250 ב 80 מ"ל של מאגר אנודה דף מקורי; מערבבים היטב.
    הערה: הכן מאגר קתודה טרי לשימוש מיידי. רק 60 מ"ל עשוי להיות נחוץ אבל לעשות 20 מ"ל נוספים במקרה של דליפות.
  12. הכן את מאגר הקתודה הכחול הבהיר. הוסף 20 מ"ל של מאגר קתודה כחול כהה לתוך 180 מ"ל של מאגר אנודה PAGE מקורי ומערבב היטב.
    הערה: ניתן להשתמש במאגר זה פעם אחת בלבד.
  13. הכן 5% קומאסי G-250 כתוסף מדגם. לדלל 200 μL של 10% מניות Coomassie כבר עשה (שלב 1.8) עם 200 μL של 1 M ACA ולאחסן ב 4 °C (50 °F).
  14. הכן מאגר מדגם PAGE מקורי 4x על-ידי שילוב של 40% גליסול, 0.04% פונסאו S, 25 מ"מ טריס-HCl (pH 6.8), גליצין של 192 מ"מ בנפח סופי של 10 מ"ל. Aliquot אותם ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במקפיא.

2. בידוד מיטוכונדריה מרקמת לב קפואה

הערה: בצע את הליך בידוד המיטוכונדריה בחדר קר של 4 מעלות צלזיוס. עם זאת, במקרה של אי זמינות של החדר הקר, להשתמש באמבט קרח בגודל גדול כדי לבצע את ההליך.

  1. מוציאים דגימות של רקמת לב קפואה בעבר מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס.
    הערה: לכל היותר ארבע דגימות רקמה עשויות להיות מעובדות בנוחות לבידוד מיטוכונדריה ביום נתון.
  2. שקול את הצינור המכיל את דגימת רקמת הלב ולרשום את המשקל. הכן שלושה כוסות (כל 50 מ"ל) המכילות 40 מ"ל של חוצץ כביסה. מצננים כל באמבט מלח הקרח עם כמויות שוות של קרח ומלח מעורבבים במשך 3-5 דקות לפני שתמשיכו לשלב הבא. שים מוטות ערבוב מגנטיים בכל כף ומניחים את stirrer למהירות בינונית.
    הערה: אין להקפיא יתר על המידה את הכוסות ולהשתמש בהם מיד לאחר שעננים של גבישי קרח מתחילים להופיע.
  3. שים את רקמת הלב הקפואה ישירות לתוך תמיסת קר כקרח בכף הראשונה. המתן כ 5 דקות תוך ערבוב והחלת לחץ קל על הרקמה באמצעות פינצטה כדי לצאת דם רב ככל האפשר.
  4. שקול את הצינור הריק ולהחסיר מהמשקל המקורי (שלב 2.2) כדי לקבל משקל נטו של רקמת הלב.
  5. מוציאים את הרקמה עם מלקחיים וסוחטים את הלב עם מגבת נייר נקייה של נייר סינון כדי להסיר דם. לאחר מכן, מניחים את הרקמה לתוך הכיס השני. המתן כ-5 דקות תוך כדי ערבוב להסרת עודפי דם.
  6. ייבשו בעדינות את הרקמה על מגבת נייר. הסר את כל השומן, הדם הקרוש, auricles, ו fasciae (רקמה לבנה). לאחר מכן, לבריכה את רקמת החדר.
  7. גרוס את דגימות הרקמה באמצעות המגרסה על ידי ביצוע שלבים 2.7.1-2.7.9.
    1. מניחים את רקמת הלב (~ 50-300 מ"ג) לתוך תא מגרסת הרקמות מצד האיל.

figure-protocol-1
איור 1: תא מגרסת רקמות (Tube) לשימוש עם המגרסה. הומוגניזציה של רקמות בצינור המגרסה דורשת בערך 10-12 s לכל דגימת רקמה. הומוגניזציה של רקמות הושלמה ברגע שהרקמה ההומוגנית עוברת דרך הדיסק המחורר לתא העליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הוסף ~ 0.2-0.8 מ"ל של חוצץ כביסה לצד הכובע של הצינור.
    הערה: ודא כי הנפח הכולל של המדגם ואת מאגר הכביסה בשילוב במהלך הגריסה אינו עולה על 0.7-0.8 מ"ל.
  2. השתמש בכלי הצינור כדי לכסות את תא המגרסה עם מכסה המגרסה בצורה נוחה.
    הערה: אין להדק יתר על המידה את מכסה המגרסה.
  3. מניחים את תא המגרסה לתוך יחידת מחזיק המגרסה עם צד האיל כלפי מטה. האיל יפעיל התאמה במחזיק המגרסה.
  4. הכנס את סיבית מנהל ההתקן של המגרסה; תן לקצת לעסוק עם מכסה המגרסה. ודא כי הסיבית נעולה בצורה נוחה למקומו.
    הערה: השתמש תמיד במנהל ההתקן של המגרסה הטעון במלואו.
  5. יש למרוח לחץ כלפי מטה באופן ידני על נהג המגרסה ותא המגרסה עד שמחוון הלחץ על מחזיק המגרסה מגיע להגדרה של כ-2 על מחזיק המגרסה.
    הערה: ההגדרה יכולה להיות ברמה גבוהה יותר אם רקמת גריסה היא סיבית יותר.
  6. הפעל את מנהל ההתקן של המגרסה במשך כ 10-12 s על ידי לחיצה על ההדק של הנהג מגרסה, תוך שמירה על ההגדרה ב 2.
  7. תסתכל על הצינור כדי לבדוק אם כל או רוב המסה המוצקה של הרקמה מגוררת דרך דיסק תמה ומועברת לתא העליון של תא המגרסה על ידי התבוננות בצינור.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך לגרוס את דגימת הרקמה לתקופה ארוכה יותר. כל שעליך לעשות הוא להחזיר את הצינור למחזיק המגרסה ולהמשיך את התהליך. רוב סוגי דגימות הרקמות דורשים רק 10-12 s של גריסה. בעוד כל גריסה תפיק קצת חום עקב חיכוך, זמן עיבוד קצר זה לא לחמם באופן משמעותי את המדגם.
  8. לאחר גריסת הדגימה, הרימו את תא המגרסה מיחידת המחזיק. השתמש בכלי הצינור כדי להסיר את מכסה המגרסה ולהניח אותו על משטח נקי לשימוש מאוחר יותר.
    הערה: מכסה המגרסה צריך להיחשב מזוהם עם תמצית מדגם, ובהתאם לסוג המדגם, עשוי להיות מזוהם עם חומרים זיהומיים. אין להשתמש באותו מכסה מגרסה עבור כל דגימות רקמה אחרות כדי למנוע זיהום צולב.
  1. מעבירים את רקמת הלב הגרוסה לכוס השלישית עם 40 מ"ל של חיץ כביסה ומערבבים את הרקמה במשך 5 דקות במהירות בינונית בזמן על צלחת הערבוב.
  2. סנן את המתלה באמצעות מונפילמנט רשת ניילון (גודל נקבובית 74 מיקרומטר) והשלך את הסינון. לשטוף את הרקמה מגוררת על המסנן 3x עם 10 מ"ל של חוצץ כביסה.
    הערה: ודא כי מונופילמנט רשת ניילון הוא רטוב מראש עם מים.
  3. מעבירים את הרקמה השטופה והגרוסה לתוך 50 מל עם 20 מל של חוצץ כביסה ומניחים את הכיס באמבט הקרח על מערבל מגנטי. מוסיפים 0.5 מ"ל של תמיסה טריפסין תוך ערבוב מתמיד במשך 15 דקות. בערך באמצע הדגירה (בערך 7.5 דקות), להעביר את ההשעיה רקמה לתוך homogenizer זכוכית על זכוכית מצויד באופן רופף שיכיל 0-15 מ"ל של נפח.

figure-protocol-2
איור 1: תא מגרסת רקמות (Tube) לשימוש עם המגרסה. הומוגניזציה של רקמות בצינור המגרסה דורשת בערך 10-12 s לכל דגימת רקמה. הומוגניזציה של רקמות הושלמה ברגע שהרקמה ההומוגנית עוברת דרך הדיסק המחורר לתא העליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

  1. הומוגני בעדינות עם 4-5 משיכות כדי לפזר את ההשעיה מבלי לייצר קצף. מניחים את homogenate לתוך כף 50 מ"ל ומערבבים בעדינות על צלחת ערבוב במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  2. לאחר 15 דקות של דגירה, להוסיף 10 מל של חוצץ בידוד המכיל את מעכב טריפסין לתוך המכיל הומוגניט ודגרה במשך 1 דקות ב 4 °C (4 °F) תוך ערבוב בעדינות.
  3. לסנן את המתלה שוב דרך מסנן ניילון ולשמור את הסינון בצינור חרוט 50 מ"ל.
  4. אסוף את שבר החלקיקים שנותר על מסנן הניילון והצב אותו בהומוגניזר זכוכית על זכוכית. הוסיפו 15-20 מ"ל של חיץ הכביסה והומוגניזציה עדינה ביד במשך 25-30 s.
    הערה: הסינון זורם לאט מאוד בשלב זה. כדי להגדיל את זרימת הסינון, מניחים את קצה המשפך נוגע בחלק הפנימי של הצינור החרוט.
  5. שלב הומוגניאט עם הסינון, לאזן את הצינורות, וצנטריפוגה ב 600 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  6. לסנן את supernatant וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוט חדש באמצעות מסנן ניילון כדי למנוע זיהום על ידי הכדור. הפעל את הצנטריפוגה שוב ב 8,500 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: השתמש בפיפטה העברת פלסטיק כדי להסיר את supernatant להקריב 0.2 מ"ל של supernatant מהחלק העליון של גלולה רכה.
  7. להשליך את supernatant ולשטוף את הכדור 2-3 פעמים עם 1 מ"ל של חוצץ הבידוד. הקפידו להשליך את שכבת השוליים החיצונית הלבנה הרכה בכל פעם.
    הערה: לשטוף את הכדור על ידי הוספת מאגר הבידוד באמצעות pipette עם קצה 1 מ"ל, או pipette העברה חדש. הוסף את המאגר לצד הצינור, לא ישירות מעל הכדור, כדי למנוע שבירת הכדור ולמנוע את הזיהום של supernatant. לאחר מכן, שאפו את המאגר עם pipette העברה ולחזור על התהליך פעמיים נוספות.
  8. הוסף 5 מ"ל של מאגר הבידוד לכל צינור ולשבור את הכדור באמצעות pipette עם קצה 1 מ"ל, או pipette העברה חדש.
  9. לדלל את המתלה עם 20 מ"ל של חוצץ בידוד נוסף ולהפעיל את הצנטריפוגה שוב ב 8,500 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F).
  10. השלך את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של המאגר resuspending. לאחר מכן, להוסיף 15 מ"ל יותר של המאגר עבור סך של 20 מ"ל, וצנטריפוגה ב 8,500 x g במשך 15 דקות. ב 4 °C (70 °F). זרוק את סופר-טבעי. הכדור החום המתקבל מכיל מיטוכונדריה שלמה שנשטפה.
  11. Resuspend הכדור מועשר במיטוכונדריה ב 250 μL של חוצץ resuspending, כולל מעכבי פרוטאז. Aliquot ב 25 μL, הקפאה מהירה בחנקן נוזלי, ולאחסן במקפיא עמוק -80 °C במשך כמה שנים.
    הערה: 5 μL רזרבי של הכנה מועשרת במיטוכונדריה לבדיקת ניתוח חלבונים. עבור מחקר BN-PAGE (כחול יליד דף), aliquot הכדור resuspended ב 50 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי לכל צינור. צנטריפוגה ב 8,500 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F). שאפו בזהירות את supernatant ולאחסן את הכדור המיטוכונדריאלי (50 מיקרוגרם חלבון / aliquot) במקפיא עמוק -80 מעלות צלזיוס במשך כמה שנים.

3. הערכת קומפלקס העברת אלקטרונים מיטוכונדריאלי (ETC)

הערה: חלבונים בודדים של מיטוכונדריאלי ETC (כלומר, Complex-I, II, III, IV, V) ניתנים להערכה על ידי בדיקת חיסונים סטנדרטית. בשל מגוון הדגימות (ארבע נקודות זמן: 48 שעות, 3 חודשים, 9 חודשים), שני תנאים ניסיוניים (מתורגלים בישיבה), ומספר נוגדנים אימונו-פרוביציוניים (חמישה נוגדנים), מומלץ לבלום חיסוני מרובה. בצע אימונובלובלוב מרובה כפי שהוא.

  1. פתור 50 מיקרוגרם של דגימת חלבון מועשר במיטוכונדריה / באר ב 4%-20% אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד הדרגתי (100 V, 90 דקות).
  2. מעבירים את החלבונים לקרום PVDF (75 V; 60 דקות)
  3. לחסום את הממברנה בתמיסת חוצץ חסימה למשך מינימום של 1 שעות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: ניתן להאריך את זמן החסימה עד הלילה ב-4 °C (70 °F). מאגר החסימה (טבלה של חומרים) מכיל מרכיבים שאינם יונקים (כלומר, חלבוני דגים) שפחות סביר שיהיו להם אינטראקציות מחייבות ספציפיות עם נוגדנים כמו גם חלבוני יונקים אחרים הקיימים בשיטות אופייניות.
  4. לחקור את הממברנה עם קוקטייל הנוגדנים כולל אנטי-קומפלקס-I, II, III, IV, V נוגדנים ודגרה לילה על שייקר מסלולית ב 4 °C (5 °F).
  5. למחרת, לשטוף את הממברנה ולבדוק עם נוגדן משני מתויג IR במשך 2 שעות על שייקר מסלולית ב RT (טמפרטורת החדר).
  6. יש לשטוף חמש פעמים עם 1x TBS-T (TBS המכיל טווין 20), ופעם אחת עם 1x TBS (תמיס מלוחה של טריס).
    הערה: עבור הכביסה האחרונה, אל תכלול חומר ניקוי במאגר TBS.
  7. תמונה של הכתם במנתח תמונות.

4. הערכת מחשב-על המיטוכונדריה על ידי כחול יליד פולי אקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה (BN-PAGE)

הערה: פרופיל מחשב-על של ETC ניתן גם להעריך על ידי שימוש בטכניקת BN-PAGE.

  1. הכן את קוקטייל החיץ לדוגמה עבור 20 μL לכל 50 מיקרוגרם חלבון גלולה מועשר מיטוכונדריה (7 μL של מים + 5 μL של 4x ילידי polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזיס מדגם חוצץ + 8 μL של 5% Digitonin + 2 μL של Coomassie G-250).
    הערה: הפוך קוקטייל חיץ מדגם מלאי בהתאם למספר הדגימות הזמינות (50 מיקרוגרם חלבון / מדגם). בחר כמויות דיגיטונין מתאימות בהתבסס על ריכוז החלבון של הכדור המועשר במיטוכונדריה (טבלה 1)8.
  2. מחממים את מלאי הדיגיטונין ב-95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, מערבבים ומצננים על הקרח לפני שמערבבים את התערובת הראשית.
  3. הוסף את תוסף מדגם Coomassie G-250 ממש לפני טעינת הדגימות לתוך הג'ל.
  4. הוסף 20 μL של קוקטייל חיץ מדגם בצינור המכיל 50 מיקרוגרם של כדורי חלבון מיטוכונדריאלי. Solubilize/resuspend הכדור על ידי ערבוב עדין של הכדור עם פיפטה מבלי ליצור קצף.
  5. לדגור את התערובת על קרח במשך 20 דקות כדי להשיג solubilization מקסימלי של הכדור מועשר המיטוכונדריה. מעת לעת, בעדינות להעיף את הצינורות כדי לשפר את solubilization.
  6. בעת ההמתנה לדגירה, הכין את מאגר האנודה המקורי של PAGE/1x ואת מאגר הקתודה בצבע כחול כהה.
  7. צנטריפוגה הכדור המועשר במיטוכונדריה ב-20,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  8. לאחר צנטריפוגה, לאסוף 15 μL של supernatant לתוך צינורות חדשים להציב על קרח.
  9. הוסף את הכמות המתאימה של 5% קומאסי G-250 ריאגנט לסופרנט המתקבל בשלב 4.8 (עיין בטבלה 1).
    הערה: 5% Coomassie G-250 נפח צריך להיות כזה כי הריכוז הסופי של הצבע הוא 1/4 ריכוז דטרגנט. בצע שלב זה ממש לפני טעינת הדגימות לתוך הג'ל.
חלבוןדיגיטונין/חלבוןמאגר דוגמאות 4x5% דיגיטוניןמיםאמצעי אחסון סופי5% קומאסי G-250
יחס (g/g)תוסף לדוגמה
50 מיקרוגרם8587202
50 מיקרוגרם45411201

טבלה 1: הכנת קוקטייל חיץ מדגם עם שני יחסי דטרגנט /חלבון שונים. כדי להשיג סולוביליזציה מקסימלית של חלבוני ממברנה מן ההשעיה המיטוכונדריאלית, ריכוז חלבון השעיה דיגיטונין/מיטוכונדריאלי צריך להיות מותאם בין 4-8 גרם דיגיטונין/גרם של חלבון. ברקמת הלב, 400 מיקרוגרם דיגיטונין עבור 50 מיקרוגרם של חלבוני השעיה מיטוכונדריאליים (כלומר, 8 גרם דיגטונין/גרם של חלבון מיטוכונדריה) שימשו כדי למקסם את המסיסות של supercomplexes מן השעיית המיטוכונדריה.

  1. יוצקים ג'ל הדרגתי של 3%-8%, מסירים את המסרק ושטפים את בארות הג'ל עם חיץ ריצה פי 1 שלוש פעמים.
    הערה: הג'ל הטוב ביותר פולימרי אם שפכו יום קודם לכן.
  2. הקימו את מערכת האלקטרופורזה והכניסו את הג'ל למנגנון.
  3. מלאו את בארות הדגימה במאגר הקתודה בצבע כחול כהה.
  4. טען 10 μL של תקן חלבון לא נגוע כסמן משקל מולקולרי מקורי על הבאר הראשונה והאחרונה של הג'ל.
  5. טען את כל הכמות של תוספת דגימת-על + קומאסי המוכנה בשלב 4.9 לעיל לבארות באמצעות קצה טעינת ג'ל שטוח.
  6. מלא בזהירות את סכר חיץ התאים הקטן עם כ 60 מ"ל של מאגר קתודה בצבע כחול כהה מבלי להפריע הדגימות בבארות, ולאחר מכן למלא את מיכל החיץ עם מאגר ריצה PAGE 1x המקורי.
  7. הפעל את ספק הכוח ואלקטרופורזי את הדגימות ב 150 V במשך כ 30 דקות.
  8. הסר את חיץ הקתודה בצבע כחול כהה מסכר החיץ (התא הפנימי) עם pipette העברה או לשאוף את בארות המדגם. מלא את התא הפנימי עם 150-200 מ"ל של חוצץ קתודה בצבע כחול בהיר ולהפעיל את האלקטרופורזה ב 250 V במשך 60 דקות.
    הערה: זמן האלקטרופורזה עשוי להיקבע על ידי בדיקה מתי חזית הצבע נודדת רק 0.5 ס"מ מעל החלק התחתון של קלטת הג'ל.
  9. מוציאים את הג'ל מהקלטת ומניחים אותו במיכל פלסטיק נקי. לשטוף את הג'ל עם מים מזוקקים באיכות טובה במשך 15 דקות על נדנדה / שייקר מסלולית.
    הערה: כדי להסיר את הג'ל ההדרגתי מהקלטת, יש לטפל בקלטת מלמטה, שהיא חזקה יותר, כדי למזער את סיכויי השבירה.
  10. יוצקים מים, טובלים את הג'ל בכמות מספקת של ריאגנט כתמים כחולים של Coomassie GelCode, ודגרה במשך שעה על מסלול/רוקר בטמפרטורת החדר.
    הערה: מערבבים את תמיסת ריאגנט הכתם הכחול (שולחן החומרים) לפני השימוש על ידי מערבולת עדינה של הבקבוק מספר פעמים.
  11. דקנט את פתרון הצבע, להוסיף מים מזוקקים, לשטוף כמה פעמים עם מים, ולאחר מכן לשים על המסלול / רוקר עבור destaining.
    הערה: הכנס חתיכת ספוג (~ 3 ס"מ x 0.5 ס"מ) לתוך מיכל destaining ג'ל ולהשאיר את הג'ל עבור לילה destaining. הספוג סוחט את חלקיקי הצבע מבלי לדרוש שינויים מרובים במים.
  12. נתח את הג'ל במנתח תמונות.

5. הערכת מחשב-על של מיטוכונדריה על ידי ניתוח כתמי אימונובלט

  1. בצע קבוצה חדשה של BN-PAGE מבלי להכתים את הג'ל בסוף האלקטרופורזה.
  2. בצע את אותו הליך כמו בסעיף 3 (הערכת קומפלקס העברת אלקטרונים מיטוכונדריאלי (ETC) כדי להשלים את החיסונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות הפרוטוקול, תשואה טובה של תערובת חלבון מועשר מיטוכונדריה מרקמת הלב הוכן. כ-15 מ"ג/מ"ל של תערובת חלבונים מועשרים במיטוכונדריה התקבלו מ-1.2 גרם רקמת לב קפואה בממוצע שנקצרה מצאצאי השזרה. תצפיות הצביעו על כך שפחות מ-0.5 גרם של רקמת לב קפואה לא הניבו כמות מספקת של תערובת חלבונים מועשרת במיטוכונדריה כדי לבצע בדיקת BN-PAGE. כמות ההכנה המיטוכונדריאלית הספיקה כדי לבצע (i) ניתוח חיסוני סטנדרטי להערכת מתחמי העברת האלקטרונים הבודדים (ETC) (כלומר, Complex-I, II, III, IV ו- Complex-V), (ii) הערכת מחשב-על מיטוכונדריאלי על-ידי נית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים עבור פרוטוקול זה מצוינים כאן. ראשית, הומוגניזציה רקמות צריך להיות מטופל בקפידה, כך השפעות מוחלטות לא ייושמו במהלך תהליך הומוגניזציה רקמות. יש להשתמש במגרסת רקמות, המהווה חלק מטכנולוגיית רכיבה על אופניים בלחץ (PCT) להומוגניזציה ראשונית של רקמות9. צעד זה יפחית את מחזור השבץ המוגזם של הומוגניזר זכוכית על זכוכית (איור 1B) שעלול להרוס עוד יותר את המיטוכונדריה השברירית ממילא בשל תנאי רקמות קפואות. שנית, משקל הרקמה הקפואה יהיה חשוב כדי להשיג כמויות מספיקות של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המענק הפנים-ארצי של אוניברסיטת קנזס סיטי עבור עבדולבקי אגבאס ומלגת מחקר קיץ עבור דניאל בררה. המחברים אסירי תודה על עבודת העריכה של ד"ר יאן טאלי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אמינו קפרואיתSigma/AldrichA2504-100G
Anti-Hu Total OxPhos קומפלקס ערכתInvitrogen458199
נוגדן נגד VDACabcamab15895השתמש 1 ומיקרו; g/mL
Coomassie G-250ThermoSientific20279
Coomassie GelCode BlueThermoScientific24592
DigitoninCabiochem300410
זכוכית-זכוכית עלי הומוגנייזרVWRKT885451-0020
Image StudioLICOR
IR-Dye מצומד אנטי-ארנב AbLICORLC0725
Multiwell קורא צלחותBioTekSynergy HT
סמן משקל מולקולרי מקוריThermoFisherBN2001
ניילון רשת מונופילמנטקטן חלק בע"מCMN-74
שייקר אורביטליThermoScientfic
PCT מגרסהלחץ Bioscience Inc
SEA BLOCK חסימת מאגרThermoScienctific37527
מגרסה PULSE צינורלחץ Bioscience IncFT500-PS
צנטריפוגה שולחניתEppendorf5418
טריפסיןאמרסקוM150-1G
מעכב טריפסיןאמרסקוM191-1Gדורש הכנה טרייה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gross, V. S., et al. Isolation of functional mitochondria from rat kidney and skeletal muscle without manual homogenization. Analytical Biochemistry. 418 (2), 213-223 (2011).
  2. Osto, C., et al. Measuring mitochondrial respiration in previously frozen biological samples. Current Protocols in Cell Biology. 89 (1), 116(2020).
  3. Agbas, A., et al. Mitochondrial electron transfer cascade enzyme activity assessment in cultured neurons and select brain regions. Current Protocols in Toxicology. 80, 73(2019).
  4. Hathaway, Q. A., et al. Maternal-engineered nanomaterial exposure disrupts progeny cardiac function and bioenergetics. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (3), 446-458 (2017).
  5. May, L. E., et al. Influence of maternal aerobic exercise during pregnancy on fetal cardiac function and outflow. American Journal of Obstetrics & Gynecology MFM. 2 (2), 100095(2020).
  6. Ehler, W. J., et al. Avoidance of malignant hyperthermia in a porcine model for experimental open heart surgery. Laboratory Animal Science. 35 (2), 172-175 (1985).
  7. Panov, A. V., et al. Effect of bovine serum albumin on mitochondrial respiration in the brain and liver of mice and rats. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 149 (2), 187-190 (2010).
  8. Jha, P., Wang, X., Auwerx, J. Analysis of mitochondrial respiratory chain supercomplexes using blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 1-14 (2016).
  9. Pressure Biosciences Inc. Isolation of Functional Mitochondria from Whole Rat Heart Using a PBI Shredder and Pressure Cycling Technology (PCT). , South Easton, MA. (2010).
  10. McLaughlin, K. L., et al. Novel approach to quantify mitochondrial content and intrinsic bioenergetic efficiency across organs. Scientific Reports. 10 (1), 17599(2020).
  11. Hom, J., Sheu, S. S. Morphological dynamics of mitochondria--a special emphasis on cardiac muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46 (6), 811-820 (2009).
  12. Greggio, C., et al. Enhanced respiratory chain supercomplex formation in response to exercise in human skeletal muscle. Cell Metabolism. 25 (2), 301-311 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiac Tissue MitochondriaFrozen Tissue MitochondriaMaternal Exercise ModelBlue Native ElectrophoresisMultiplexed ImmunoblottingSupercomplex AssessmentComplex I II ActivityMitochondria Isolation

מאמרים קשורים