בדיקות אוטומטיות באמצעות מיקרו-פלטות מרובות היטב הן גישות מועילות לזיהוי רגולטורים של מסלולים בכך שהן מאפשרות הערכה של מספר רב של תנאים בניסוי אחד. כאן, התאמנו את פרוטוקול ההדמיה והכימות של המקרופינום המבוסס היטב לפורמט מיקרו-לוחית של 96 בארות ומספקים מתאר מקיף לאוטומציה באמצעות קורא לוחות רב-מצבי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה וניתוח אוטומטיים לכימות של מקרופינומיסומים המסומנים בפלואורסצנטות
במאמר זה
סיכום
תקציר
Macropinocytosis הוא מסלול ספיגה לא ספציפי של שלב הנוזלים המאפשר לתאים להפנים מטען חוץ-תאי גדול, כגון חלבונים, פתוגנים ופסולת תאים, באמצעות אנדוציטוזיס בתפזורת. מסלול זה ממלא תפקיד חיוני במגוון תהליכים תאיים, כולל ויסות תגובות חיסוניות וחילוף חומרים של תאים סרטניים. בהתחשב בחשיבות זו בתפקוד הביולוגי, בחינת תנאי תרבית התאים יכולה לספק מידע רב ערך על ידי זיהוי רגולטורים של מסלול זה ואופטימיזציה של תנאים להיות מועסקים בגילוי גישות טיפוליות חדשניות. המחקר מתאר טכניקת הדמיה וניתוח אוטומטית באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וקורא לוחות רב-מצבי הדמיית תאים לכימות המהיר של האינדקס המקרופאינוציטי בתאים דבקים. השיטה האוטומטית מבוססת על ספיגת dextran פלואורסצנטי במשקל מולקולרי גבוה וניתן ליישם אותה על מיקרופלסטיק 96-well כדי להקל על הערכות של תנאים מרובים בניסוי אחד או דגימות קבועות המותקנות על כיסויי זכוכית. גישה זו נועדה למקסם את הרבייה ולהפחית את השונות הניסיונית תוך חיסכון בזמן וחסכוני.
מבוא
המסלול האנדוציטי הלא ספציפי של מקרופינוציטוזיס מאפשר לתאים להפנים מגוון רכיבים חוץ-תאיים, כולל חומרים מזינים, חלבונים, אנטיגנים ופתוגנים, באמצעות ספיגה בתפזורת של נוזל חוץ-תאי ומרכיביו1. למרות חשוב עבור הביולוגיה של סוגי תאים רבים, יותר ויותר, מסלול macropinocytosis מתואר לשחק תפקיד חיוני בביולוגיה של הגידול, שבו, באמצעות ספיגה macropinocytic, תאים סרטניים מסוגלים לשרוד ולהתרבות בנוכחות microenvironment מזין מדולדל2,3. ספיגת מקרומולקולות חוץ-תאיות, כולל אלבומין ומטריצה חוץ-תאית, ופסולת תאים נמקיים, מספקת מקור מזין חלופי לייצור ביומסה על ידי יצירת חומצות אמינו, סוכרים, שומנים ונוקלאוטידי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת חומרים
- להמיס 70 kDa dextran מסומן עם FITC או tetramethylrhodamine (TMR) ב- PBS כדי לקבל פתרון 20 מ"ג / מ"ל. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F).
- יש להמיס את DAPI ב-ddH2O כדי לקבל פתרון של 1 מ"ג/מ"ל. לאחסן את aliquots ב -20 °C (50 °F).
זהירות: DAPI הוא מסרטן פוטנציאלי ויש לטפל בו בזהירות. - ביום הקיבעון, להכין טרי 3.7% פורמלדהיד כיתה ACS ב- PBS.
אזהרה: פורמלדהיד הוא חומר מסרטן קבוע וידוע והוא רעיל אם נשאף. הפוך את הפתרון במכסה המנוע אדים כימיים כדי למנוע שאיפה ולטפל בזהירות. - הכינו כיסויים שטופים בחומצה.
- השתמש בכוס 500 מ"ל ואמבט מים כדי לחמם 28 גרם של כיסויי זכוכית בורוסיליקט בקוטר 12 מ"מ ועובי #1.5 ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כאשר השלבים וההתאמה של הפרוטוקול המתואר לעיל מתבצעים בהתאם, התוצאות הניסיוניות הסופיות צריכות לספק מידע על אם תנאי תרבית התא הנחקרים או מעכבים לגרום או להפחית macropinocytosis בקו התא של עניין. כדי לחזק את תוקפם של ממצאים אלה, הכללת תנאי הבקרה תאפשר לבחון את התוצאות כדי לקבוע אם הניסוי הושלם בהצלחה. פקדי אינדוקציה של Macropinocytosis יספקו מידע על הרמה היחסית של מקרופינוציטוזה. לשם כך, EGF ליגנד נמצא בשימוש הנפוץ ביותר13. בתאי AsPC-1 PDAC, הוספת EGF ב- 100 ng/mL למשך 5 דקות לפני הוספת הדקסטרן מפעי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
איכות הניסויים ורכישת הנתונים תלויה מאוד באיכות הריאגנטים, באופטימיזציה של ההגדרות ובניקיון כיסויי הכיסוי והמיקרו-לוחית. התוצאות הסופיות צריכות לתת שונות מינימלית בין שכפולים; עם זאת, שינויים ביולוגיים מתרחשים באופן טבעי או עלולים להיגרם בדרך אחרת על ידי מספר גורמים. צפיפות תאים עלולה לגרום לתאים להגיב פחות או יותר למעודדי מקרופינוציטוזה או מעכבים. לכן, חיוני לדבוק במפגש של 80% כפי שמוצע כאן בפרוטוקול. לחלופין, הוא מתועד היטב על ידי יצרני מיקרופלט כי אידוי מדיה מתרחשת על מיקרופלט 96-well. כאן, הבארות החיצוניות כפופות לאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
C.C. הוא ממציא על פטנט שהונפק שכותרתו ''אבחון סרטן, טיפוליות, וגילוי תרופות הקשורים macropinocytosis,' פטנט מס ': 9,983,194.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH / NCI (R01CA207189, R21CA243701) ל- C.C. KMO.G. הוא מקבל פרס מלגת פוסט-דוקטורט TRDRP (T30FT0952). BioTek Cytation 5 הוא חלק מליבת הדמיית התאים של סנפורד ברנהם פרביס, המקבלת תמיכה כספית ממענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI (P30 CA030199). איורים 1-3 נוצרו באמצעות BioRender.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.25% טריפסין | קורנינג | 25053CI | 0.1% EDTA ב-HBSS ללא סידן, מגנזיום ונתרן ביקרבונט |
| 1.5 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה | פישרברנד | 05-408-129 | |
| צלחת תרבית רקמות 10 ס"מ | גריינר ביו-וואן | 664160 | CELLSTAR |
| 15 מ"ל צינור צנטריפוגה | פישרברנד | 07-200-886 | |
| 2 ליטר | פישרברנד | 02-591-33 | |
| צלחת תרבית רקמות 24 בארות | גריינר ביו-וואן | 662160 | CELLSTAR |
| 25 מ"ל מאגר ריאגנטים | Genesee Scientific Corporation | 28-121 | |
| 500 מ"ל | פישרברנד | 02-591-30 | |
| צלחת תרבית רקמות 6 ס"מ | גריינר ביו-וואן | 628160 | |
| CELLSTAR מתאם שאיפה 8 ערוצים | אינטגרה Biosciences | 155503 | |
| מתאם שאיפה 8 ערוצים לטיפים סטנדרטיים | Integra Biosciences | 159024 | |
| 95% אתנול | Decon Laboratories Inc | 4355226 | |
| מנקה זכוכית נטול אמוניה | Sparkle | FUN20500CT | |
| שחור 96 בארות הקרנה microplate | PerkinElmer | 6055300 | CellCarrier-96 Ultra |
| אפליקטור עם קצה כותנה | Fisherbrand | 23-400-101 | |
| Coverslips | Fisherbrand | 12-545-80 | קוטר 12 מ"מ |
| Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader | Biotek | CYT5FW | |
| DAPI | Millipore Sigma | 5.08741 | |
| Dextran 70 kDa - FITC | Life Technologies | D1822 | ליזין ניתן לתיקון |
| Dextran 70 kDa - TMR | Life Technologies | D1819 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D1435 | |
| DPBS | Corning | 21031CV | ללא מלקחיים של סידן ומגנזיום |
| Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 | |
| פורמלדהיד, 37% | Ricca Chemical | RSOF0010-250A | ACS מגיב |
| גליצרול | פישר BioReagents | BP229-1 | |
| אמצעי הרכבה פלואורסצנטיים מתקשים | Agilent Tech | S302380-2 | DAKO |
| Hoechst 33342 | Millipore Sigma | B2261 | |
| חומצה הידרוכלורית (HCl) | Fisher Chemical | A144-212 | מוסמך ACS Plus, 36.5%– 38.0% |
| מגבונים ללא מוך | Kimberly-Clark | 34155 | Kimwipes |
| Miscroscope slides | Fisherbrand | 12-544-1 | מזכוכית רגילה פרימיום |
| גילסון | FA10013 | 8 ערוצים, 0.5– 10 ומיקרו; L | |
| פיפטה רב ערוצית | גילסון | FA10012 | 12 ערוצים, 20– 200 ומיקרו; L |
| פיפטה רב ערוצית | גילסון | FA10011 | 8 ערוצים, 20– 200 ומיקרו; L |
| Parafilm M | Pechiney | PM996 | |
| עטיפת פלסטיק | Kirkland Signature | 208733 | Stretch-Tite |
| Grace Bio Labs Inc | 664107 | קוטר 13 מ"מ X 0.8 מ"מ מזהה עומק, 25 מ"מ X 25 מ"מ | |
| מתאם שקופיות | בקבוק כביסה Biotek | 1220548 | |
| Fisherbrand | FB0340922C |
מקורות
- Lin, X. P., Mintern, J. D., Gleeson, P. A. Macropinocytosis in different cell types: similarities and differences. Membranes. 10 (8), 21(2020).
- Recouvreux, M. V., Commisso, C. Macropinocytosis: a metabolic adaptation to nutrient stress in cancer. Frontier....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
