Method Article

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

DOI:

10.3791/62832

⸱

July 29th, 2021

 ,  ,  , 
1Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, 2Gatan Inc.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנים האחרונות, ההתקדמות הטכנולוגית והמתודולוגית במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד (cryo-EM) סללה דרך חדשה לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים. למרות ההתקדמות המדהימה בהקפאה-EM, עדיין יש היקף לשיפור בהיבטים שונים של זרימת העבודה של ניתוח חלקיקים בודדים. ניתוח חלקיקים בודדים דורש חבילת תוכנה מתאימה לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. בשמונה השנים האחרונות פותחו מספר חבילות תוכנה אוטומטיות לרכישת נתונים להדמיה אוטומטית עבור קריו-EM של חלקיק יחיד. מאמר זה מציג יישום של צינור רכישת תמונה אוטומטי לחלוטין עבור biomolecules מנוצל בתנאים במינון נמוך.

הוא מדגים חבילת תוכנה, שיכולה לאסוף נתוני cryo-EM באופן מלא, אוטומטי ומדויק. בנוסף, פרמטרים מיקרוסקופיים שונים נשלטים בקלות על ידי חבילת תוכנה זו. פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של חבילת תוכנה זו בהדמיה אוטומטית של תסמונת הנשימה החריפה החמורה-נגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) חלבון ספייק עם מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים 200 keV המצויד בגלאי אלקטרונים ישיר (DED). כ-3,000 תמונות של סרטי קריו-EM נרכשו במפגש אחד (48 שעות) של איסוף נתונים, שהניבו מבנה ברזולוציה אטומית של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. יתר על כן, מחקר מבני זה מצביע על כך שחלבון הספייק מאמץ שני קונפורמציות עיקריות, 1-RBD (תחום מחייב קולטן) פתוח וכל RBD למטה קונפורמציות סגורות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קריו-EM חלקיק יחיד הפך טכניקה ביולוגית מבנית המיינסטרים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של macromolecules ביולוגי1. שחזור חלקיק יחיד תלוי ברכישת מספר עצום של מיקרוגרפים של דגימות מוויטוריות כדי לחלץ תמונות חלקיקים דו-ממדיות (2D), המשמשות לאחר מכן לשחזור מבנה תלת מימדי (תלת-ממדי) של מקרו-קולקול ביולוגי2,3. לפני הפיתוח של DEDs, ההחלטה שהושגה משחזור חלקיק יחיד נע בין 4 ל 30 Å4,5. לאחרונה, הרזולוציה ברת השגה של קריו-EM חלקיק יחיד הגיעה מעבר 1.8 Å6. DED ותוכנה אוטומטית לרכישת נתונים היו התורמים העיקריים למהפכת החלטה זו7, שבה ההתערבות האנושית באיסוף נתונים היא מינימלית. בדרך כלל, הדמיית cryo-EM מבוצעת בשיעורי מינון אלקטרונים נמוכים (20-100 e/Å2) כדי למזער נזקי קרינה הנגרמים על ידי קרן אלקטרונים של דגימות ביולוגיות, מה שתורם ליחס האות לרעש הנמוך (SNR) בתמונה. SNR נמוך זה מונע את האפיון של המבנים ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולים ביולוגיים באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים.

גלאי האלקטרונים מהדור החדש הם גלאים מבוססי CMOS (מוליכים למחצה משלימים של תחמוצת מתכת), שיכולים להתגבר על מכשולים נמוכים אלה הקשורים ל- SNR. מצלמות CMOS לזיהוי ישיר אלה מאפשרות קריאה מהירה של האות, שבגללו המצלמה תורמת פונקציית התפשטות נקודה טובה יותר, SNR מתאים ויעילות קוונטית בלשית מעולה (DQE) עבור מקרומולקולים ביולוגיים. מצלמות זיהוי ישיר מציעות SNR8 גבוה ורעש נמוך בתמונות המוקלטות, וכתוצאה מכך עלייה כמותית ביעילות הקוונטית הבלשית (DQE) - מדד של כמות הרעש שהגלאי מוסיף לתמונה. מצלמות אלה גם מקליטות סרטים במהירות של מאות פריימים לשנייה, מה שמאפשר רכישת נתונים מהירה9,10. כל המאפיינים האלה הופכים מצלמות זיהוי ישיר מהירות המתאימות ליישומים במינון נמוך.

תמונות מחסנית מתוקנות בתנועה משמשות לעיבוד נתונים כדי לחשב סיווג 2D ולשחזר מפת צפיפות תלת-ממדית של פקודות מאקרו באמצעות חבילות תוכנה שונות כגון RELION11, FREALIGN12, cryoSPARC13, cisTEM14 ו- EMAN215. עם זאת, עבור ניתוח חלקיקים בודדים, ערכת נתונים עצומה נדרשת כדי להשיג מבנה ברזולוציה גבוהה. לכן, אגרת רכישת נתונים אוטומטית חיונית מאוד לאיסוף נתונים. כדי להקליט ערכות נתונים גדולות של Cryo-EM, נעשה שימוש במספר חבילות תוכנה בעשור האחרון. חבילות תוכנה ייעודיות, כגון AutoEM16, AutoEMation17, Leginon18, SerialEM19, UCSF-Image420, TOM221, SAM22, JAMES23, JADAS24, EM-TOOLS ו- EPU, פותחו לרכישת נתונים אוטומטית.

חבילות תוכנה אלה משתמשות במשימות שגרתיות כדי למצוא מיקומי חור באופן אוטומטי על-ידי מתאם התמונות בהגדלה נמוכה לתמונות בהגדלה גבוהה, המסייעת בזיהוי חורים עם קרח מרץ של עובי קרח ניכוס לרכישת תמונה בתנאים במינון נמוך. חבילות תוכנה אלה הפחיתו את מספר המשימות החוזרות ונשנות והגדילו את התפוקה של איסוף נתוני cryo-EM על ידי רכישת כמות עצומה של נתונים באיכות טובה במשך מספר ימים ברציפות, ללא כל הפרעה ונוכחות פיזית של המפעיל. Latitude-S היא חבילת תוכנה דומה, המשמשת לרכישת נתונים אוטומטית לניתוח חלקיקים בודדים. עם זאת, חבילת תוכנה זו מתאימה רק למטעני K2/K3 ומסופק לגלאים אלה.

פרוטוקול זה מדגים את הפוטנציאל של Latitude-S ברכישת תמונה אוטומטית של חלבון ספייק SARS-CoV-2 עם גלאי אלקטרונים ישיר המצויד בהקפאה-EM של 200 keV (ראה טבלת החומרים). באמצעות כלי איסוף נתונים זה, 3,000 קבצי סרט של חלבון ספייק SARS-CoV-2 נרכשים באופן אוטומטי, ועיבוד נתונים נוסף מתבצע כדי להשיג מבנה חלבון ספייק ברזולוציה של 3.9-4.4 Å.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: שלושה שלבים חשובים נדרשים לאיסוף נתונים cryo-EM: 1. הכנת רשת cryo-EM, 2. כיול ויישור של המיקרוסקופ, 3. איסוף נתונים אוטומטי (איור 1). יתר על כן, איסוף נתונים אוטומטי מחולק ל- a. בחירת שטח מתאימה, ב. אופטימיזציה של Latitude-S, c. התחל בחירת חורים אוטומטית ו- d. התחל רכישת נתונים אוטומטית (איור 1).

1. הכנת רשת Cryo-EM וטעינה לדוגמה לרכישת נתונים אוטומטית

  1. נקו את הרשתות באמצעות פריקה זוהרת ושנו את הפרמטרים של הפרשות זוהרות בהתבסס על דרישות ניסיוניות (כאן, 60 s ב-20 mA).
  2. הוסיפו דגימת חלבון טרייה (3 מיקרו-אל) לרשת המשוחררת בזוהר ודגרו במשך 10 מטרים.
  3. כתם הרשתות עבור 3-5 s ב 100% לחות במהירות לצלול אותם לתוך אתאן נוזלי באמצעות בוכנה הקפאה.
  4. מהדק את הרשתות באופן ידני לתוך טבעת קליפ כדי ליצור את המחסנית באמצעות טבעת C-קליפ גמישה.
  5. טען את הרשתות הקפואות המותקנות על מחסנית לתוך קלטת הטעינה האוטומטית והעבר את הקלטת על ידי מכסה הננו לטוען האוטומטי המכוסה מראש של המיקרוסקופ לאיסוף נתונים.

2. כוונון מיקרוסקופ ויישור בסיסי לפני רכישת נתונים אוטומטית

  1. הזזת קרן
    1. לחץ על הזזת Beam מהכרטיסיה יישור ישיר .
    2. הפחת את ההגדלה ומרכז את הקרן לציר האופטי באמצעות ידית X ו- Y הרב-תכליתית .
  2. יישור נקודת ציר
    1. לחץ על האפשרות הטיית קרן ביישור ישיר pp X מהכרטיסיה יישור ישיר .
    2. מעבים את הקרן לנקודה וממזערים את התנועה באמצעות ידית Multifunction X ו- Y .
  3. מרכוז צמצם C2
    1. בחר את צמצם המרוכז מהכרטיסיה יישור .
    2. מעבים את הקרן לנקודה, מרכזים את הקרן לציר האופטי, ואז מרחיבים את הקרן כדי לכסות את המעגל באופן שווה.
    3. חזור על שלבים אלה עד לצמצם Condenser 2 מותאם.
  4. יישור ללא תרדמת
    1. לחץ על יישור X ללא תרדמת מהכרטיסיה יישור ישיר כדי ליישר את הקרן לציר האופטי.
    2. השתמש במידית הרב-תכליתית כדי למזער את הצורה והתנועה של ה- FFT (ודא שהיא יציבה).
    3. חזור על אותו הליך עבור תרדמת - יישור חינם Y.
  5. הגדר תאורה מקבילה לפני איסוף נתונים בהקפאה-EM בגלל עדשת התאום C.
    1. הכנס את הצמצם האובייקטיבי (70 מיקרומטר) במצב עקיפה.
    2. למקד את הצמצם האובייקטיבי על המישור המוקד הקדמי של עדשת העקיפה על ידי שליטה על ידית עוצמת defocus (עדשה אובייקטיבית וזרם עדשת C2).
    3. ודא כי הקצה החד של הצמצם האובייקטיבי נראה לאחר נטרול נכון.
    4. מכניסים את פקק הקרן ומפזרים את העוצמה עד למזעור טבעות עקיפה של אבקת הזהב.
      הערה: אם הקרן מתפשטת כראוי, טבעת עקיפה ברורה של אבקת הזהב נראית על המסך, מה שמצביע על כך שהקרן מקבילה.
    5. יש לבטל את פקק הקרן לאחר הגדרת התאורה המקבילה ולשנות את מצב המיקרוסקופ לגשושית Nano.
      הערה: בדוק את כוונון המיקרוסקופ לפני תחילת איסוף הנתונים כדי להבטיח את הביצועים האופטימליים של המיקרוסקופ. כל ההגדרות הללו יבוצעו בכרטיסיית GUI יישור ישיר של מיקרוסקופ. כל כוונון המיקרוסקופ מתבצע באמצעות רשת בדיקה לפני איסוף נתונים.

3. רכישת נתונים עם Latitude-S

  1. הפעל את תוכנת רכישת הנתונים האוטומטית של Latitude-S.
    הערה: התקנת Latitude-S דורשת גם כיול מיקרוסקופ, שיבוצע לפני איסוף הנתונים, וההגדרות יאוחסנו לצמיתות. חמישה מצבים שונים לאיסוף נתונים מכוילים בארבע הגדלות שונות (איור 1 ואיור 2). מצב אטלס ומצב הרשת נמצאים בשתי הגדלות שונות במצב LM (טווחי הגדלה נמוכה). מצב החור נמצא במצב שיוך (טווחי הגדלה גבוהה) אך עם הגדלה מתונה. מיקוד ומצב נתונים משתמשים במצב שיוך הפעלה בהגדלה גבוהה.
    1. לחץ על DigitalMicrograph מתפריט התחלה , או לחץ פעמיים על סמל DigitalMicrograph בשולחן העבודה.
    2. בחר את סמל מנהל הטכניקות מתוך DigitalMicrograph.
      הערה: מערכת זו תציג סמלי TEM ו - Latitude-S (איור 2 ואיור משלים S1).
    3. בחר את סמל Latitude-S לאיסוף נתונים אוטומטי של חלקיק יחיד.
      הערה: מצלמת K2 פועלת בשלושה מצבים: ליניארי/משולב, נספר ורזולוציית-על. המשתמש יכול לבחור כל מצב בממשק של DigitalMicrograph. ניתן לשמור תמונות נתונים כערימות תמונה מחולקות במינון או כתמונות שסוכמו בקבצי MRC, TIF או .dm4 עם עומק סיביות שונה. יתר על כן, ניתן לשמור נתונים כתמונות מתוקנות בתנועה עבור מצלמת K3. במצלמת K2, ניתן לשמור מחסנית תמונות לא מעובדת כקבצי MRC, TIF של 8 סיביות או 8 סיביות.
  2. צור הפעלה חדשה בהתבסס על ההגדרות מהפעלה קודמת.
    1. סמן את תיבת הסימון מבוסס על הפעלה קודמת בלוח הצבעים.
    2. בחר בלחצן חדש .
    3. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה שעליה מבוססות הגדרות ההפעלה החדשה. עבור אל ספריית ההפעלה הקודמת כדי ליצור את ההפעלה החדשה. בחר את התיקיה לשמירת ההפעלה החדשה והנתונים המשויכים.
    4. בחר ובחר את התיקיה שבה יישמרו ההפעלה החדשה והנתונים המשויכים.
      הערה: כל מצב וההגדרות הבסיסיות שלו (הגדלה, תנאי תאורה, תמונה או מקרן) ופרמטרים של הזזת קרן ומצלמה (חשיפה כוללת, חשיפה למסגרת אחת ו- binning) ייוצאו מההפעלה הקיימת להפעלה החדשה. נתיב התיקיה מוצג כמחרוזת טקסט בתחתית לוח הצבעים. לכל אחד מהמדדים ולוחות התצורה יש כוכבית (*) המצורפת לכותרת כדי להראות שהיא כבר הוגדרה והיא מוכנה לשימוש.
  3. המשך הפעלה קיימת.
    1. לחץ על לחצן המשך בלוח הצבעים כדי להמשיך הפעלה קיימת.
      הערה: אין אפשרות לשנות את מונטאז' האטלס.
    2. בחר ונווט אל התיקיה המכילה את ההפעלה שיש להמשיך.
  4. התחל הפעלה חדשה לגמרי.
    1. לחץ על הכרטיסיה חדש בלוח הצבעים. בחר את התיקיה המכילה את ההפעלה להמשך. בחר תיקיה לשמירת הנתונים.
      הערה: שם התיקיה המוגדר כברירת מחדל נבנה באמצעות התאריך והשעה.
    2. לחץ על סמל ההגדרה . בתיבה נהל סייר במצב שמופיע, הוסף מצב, הגדר את תנאי TEM, את תנאי המצלמה ואת התמונה/מחסנית ולאחר מכן תן שם למצב.
      הערה: זרימת העבודה האוטומטית של רכישת נתונים משתמשת ב- 5 מצבים שונים לאיסוף נתונים אוטומטי. מצבים אלה מוגדרים ומאוחסנים בלוחות המצב המתאימים שלהם. סיכום המצב ניתן בטבלה 1.
  5. קבע את תצורת מצב האטלס.
    1. לחץ על לוח המצב של אטלס.
    2. קבע את תצורת מצב האטלס עם הפרמטרים הבאים: הגדלה 115x LM מצב בגשושית ננו, תנאי תאורה-ספוט גודל 8 ובהירות 934400, binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 s להדמיה בהגדלה נמוכה. עיין בסיכום המצב שניתן בטבלה 1.
    3. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב אטלס הוא מצב ההגדלה הנמוך ביותר, המספק את הסקר של הרשת כולה (איור משלים S2). בדרך כלל, מצב זה עוזר לנו לדמיין את הרשתות כולן בהגדלה נמוכה ולשפוט את עובי הקרח, השטוחות והכיכר השבורה של הרשתות. מומלץ ליצור את האטלס באזורים שונים של הרשת כדי לבחון את עובי הקרח האופטימלי ואת עובי הקרח התת-אופטימלי של הרשתות (איור משלים S3). הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  6. קבע את תצורת מצב הרשת.
    1. לחץ על לוח המצבים של הרשת.
    2. קבע את תצורת מצב הרשת עם אופטיקת הדמיית המיקרוסקופ הבאה (מצב הגדלה 380x LM בגשושית Nano), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 626,200), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. עיין בסיכום המצב Latitude-S המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב הרשת מוגדר בהגדלה גבוהה יותר ממצב האטלס כך ששדה הראייה הוא ריבוע רשת אחד (איור 2). בהגדלה מסוימת זו, נצפתה ריבוע רשת אחד. לכן, חורים נצפים כראוי בהגדלה זו, אשר מסייע לבדוק את עובי הקרח של החורים (איור משלים S4). מסנן bandpass פשוט משמש במצב הרשת כדי לאתר את החורים ברשת הפטנטים. הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  7. קבע את תצורת מצב החור.
    1. לחץ על לוח החורים.
    2. קבע את תצורת מצב החור עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (מצב הגדלה 4500x SM בגשושית Nano), תנאי תאורה (גודל ספוט: 7 וקוטר קרן 8.81 מיקרומטר), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 s.
    3. שנה את הפרמטרים במידת הצורך בהתבסס על סוג הרשת. עיין בסיכום המצב המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב שיוך (SA) מציין טווח הגדלה גבוה במיקרוסקופ האלקטרונים. מצב החור נמצא בטווח ההגדלה של SA עם שדה ראייה של כמה מיקרומטרים (10-20 מיקרומטר) (איור 2 ו-S4 איור משלים). טווח הגדלה זה גבוה ממצב אטלס או רשת אך קטן בהרבה ממצב מיקוד/נתונים. בהגדלה זו, חורים בודדים יהיו גלויים. גודל החור מתאים להתבונן בדרגות גבוהות של זיהומים, חורים ריקים, ואת עובי הקרח הנכון של החורים. החורים להדמיה נבחרים על סמך הנחות אלה. שני מסננים משמשים במצב החור: אחד למתאם צולב של תמונת הפניה לחור עם תמונת חור חדשה והשני להתאמת גובה הבמה לגובה האוצנטרי.
  8. קבע את תצורת מצב המוקד.
    1. לחץ על לוח פוקוס.
    2. קבע את תצורת מצב המיקוד עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (הגדלה של 45,000x SA במצב ננו-גשוש), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 934400), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. תתמקד באזור הפחמן האמורפי ליד החור. עיין בסיכום המצב Latitude-S המופיע בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב שיוך (SA) מציין טווח הגדלה גבוה במיקרוסקופ האלקטרונים. מצב המוקד הוא הגדלת טווח שיוך ה- SA הגבוהה יותר. במצב מיקוד, הקרן מועברת לאזור פחמן סמוך של חור היעד ומבצעת מיקוד באופן אוטומטי כדי לאסוף את הנתונים במצב הנתונים. מסנן bandpass בשילוב עם מסנן הנינג או מסנן מלבני רך משמש במצב המיקוד כדי למדוד את ההיסט בין שתי תמונות של מצב מיקוד באותו אזור (איור 2). הפרמטרים שהוזכרו יכולים להיות מגוונים בהתאם לצרכי המשתמש.
  9. קבע את תצורת מצב הנתונים.
    1. לחץ על לוח נתונים.
    2. קבע את תצורת מצב הנתונים עם הגדרות המיקרוסקופ הבאות: אופטיקה הדמיה (למשל, הגדלה 28,000x, 45,000x, 54,000x במצב SA בגשושית ננו), תנאי תאורה (גודל ספוט: 8 ובהירות 934400), binning: 1 וזמן חשיפה למצלמה: 1.0 שניות.
    3. עיין בסיכום המצב Latitude-S שניתן בטבלה 1.
    4. לחץ על הבא כדי לעבור למצב הבא.
      הערה: מצב הנתונים הוא ההגדלה הגבוהה ביותר שנבחרה בהתבסס על דרישות גודל הפיקסלים ורזולוציית היעד (איור 2). בדרך כלל, לאחר התמקדות, הקרן מועברת באופן אוטומטי לאזור היעד כדי לאסוף את הנתונים. ניתן לשנות את הפרמטרים הנ"ל בהתבסס על דרישות המשתמש.

4. תצורת מיקוד

  1. לחץ על לוח התצורה של המוקד. ציין את טווח ערכי ההשבתה ואת גודל השלב בכרטיסיה הנתונה.
  2. לחץ על לחצן הבא כדי לעבור לשלב הבא.
    הערה: ניתן להשתמש בערכי נטרול נמוכים יותר לרכישת נתונים ברזולוציה גבוהה. בדרך כלל, ערכי נטרול של -0.5 עד -3.0 מיקרומטר עם גדלי שלב נטרול 0.25 או 0.5 משמשים לרכישת תמונה. משתמשים יכולים לדלג על שלב הגדרת המוקד אם ברצונם רק לסנן את הדוגמה. כל שעליך לעשות הוא ללחוץ על לחצן הבא בלוח הצבעים כדי לדלג על שלב קביעת התצורה של המוקד.

5. יישור עדין

  1. התמקד כמה תכונות על הרשת (למשל, קרח משושה זיהום קרח); ראו איור 3.
    הערה: התכונות לא צריכות להיות גדולות מדי או קטנות מדי. הם צריכים להיות גלויים הן בהגדלת מצב אטלס 115x (מצב LA) והן בהגדלת נתונים.
  2. לחץ על לחצן לכידה . מקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה בכל תמונה של מצבים שונים.
  3. התחל עם מצבי מיקוד, נתונים וחורים מכיוון שתחום הראייה שלהם גדול בהרבה ממצהי האטלס והרשת. הגדל אטלס ומדיני רשת כדי למקם את סימן הצלב האדום באותה תכונה במצבי האטלס והרשת.
  4. לחץ על לחצן חשב כדי לחשב את המיקום של חמישה מצבים שונים, אשר יחשב את ההוזזים בין כל אחד מהמצבים וישקף אותם לחלון הפלט.
    הערה: ערכי ההיסט משולבים במדינות לשימוש נוסף (איור 3). יישור עדין מתבצע כדי לספק דיוק גבוה של המיקום של כל מדינה (איור 3). יישור עדין זה מסייע לאתר במדויק את המיקום המדויק בכל חמש המדינות. יישור עדין הוא קריטי לרכישת נתונים של חלקיק יחיד. לכן, מומלץ מאוד לבצע יישור עדין לפני הדמיה.

6. הליך רכישת נתונים באמצעות Latitude-S

  1. לחץ על לוח הלכידה.
    הערה: בדרך כלל, נתוני אטלס נאספים בהגדלה נמוכה (115x) כדי לדמיין את רוב ריבועי הרשת.
  2. בחר את גודל האטלס כדי לכסות את הרשת כולה או חלק מהרשת בהתבסס על הדרישה (למשל, 6 x 6, 8 x 8, 12 x 12, 6 x 8, 8 x 6, 12 x 8 או 8 x 12).
    הערה: 16 על 16 גודל אטלס מכסה את הרשת כולה.
  3. לחץ על לחצן לכידה כדי ללכוד את האטלס.
    הערה: חלון הניווט הראשי של Latitude-S נפתח וממלא את השטח הזמין ב- DigitalMicrograph (איור משלים S5). שלוש חלוניות תמונה בחלון הניווט הראשי מציגות תמונות של מצבי המערכת בשלוש הגדלות שונות. האטלס הכולל מוצג כעת במצב הרכישה הנוכחי שלו בחלונית הימנית ביותר. אריחים באטלס יתמלאו כאשר כל לכידה מתרחשת.
  4. בחר את ריבוע הרשת בהתבסס על עובי הקרח על-ידי ניווט באטלס (איור משלים S5). לאחר בחירת ריבועי הרשת הרצויים, לחץ על לחצן לוח זמנים וצפה באריחים בריבוע הרשת מתמלאים כאשר כל ריבוע רשת נלכד.
  5. לחץ על לחצן תזמון לאחר בחירת ריבועי הרשת.
  6. בחר חור מייצג בריבוע הרשת על-ידי הוספת מיקומו. לאחר רכישת תמונת חור, הגדר את הנתונים ואת מיקומי המיקוד ושמור את הפריסה כתבנית (איור משלים S6).
  7. לחץ על חיפוש אוטומטי, תן את גודל החור (למשל, R1.2/1.3), ולחץ על כפתור חיפוש בתוכנית, אשר יגרום לתוכנית חיפוש למצוא באופן אוטומטי את החורים בהתבסס על קוטר החור. לאחר מכן, לחץ על לחצן סמן כדי להוסיף את התבנית (איור 4) והוסף סימוני עיגול אדומים בכל החורים ברשת אחת או בריבוע רשת חלקי.
  8. הגדר את העוצמה כדי להסיר את החורים מכיכר הרשת ומזיהום הקרח (איור 4).
    הערה: לבסוף, החורים שנבחרו יסומנו בצהוב לתזמון איסוף הנתונים.
  9. לחץ על לחצן תזמון במשימות Latitude לאחר הוספת החורים דרך חיפוש אוטומטי.
    הערה: לפני תזמון איסוף הנתונים האוטומטי, ודא שרמת מיכל החנקן הנוזלי מספיקה, משאבת הטורבו האוטומטית כבויה ושטח הכונן RAID פנוי. מנהל המשימות Latitude-S מציג את מספר מצבי האטלס, ריבוע הרשת, החור והנתונים המתוזמנים לאיסוף נתונים (איור 5). ב- Latitude-S GUI, ערכות צבעים שונות יהיו גלויות, ומשמעות ערכות הצבעים השונות תוצג: 1. צהוב מציין לא מתוכנן; 2. ירוק מציין מתוזמן; 3. כחול מציין שנרכש; 4. אדום מציין נכשל.

7. עיבוד נתונים Cryo-EM

הערה: עיבוד תמונה Cryo-EM של חלבון ספייק מתואר בפירוט בספרות האחרונה25.

  1. בצע עיבוד תמונה של חלבון ספייק של SARS-CoV2 באמצעות RELION 3.011.
  2. מסך תמונות הסרט שנאספו באמצעות Latitude-S באופן ידני, ובצע תיקון תנועה המושרה בקורה של הסרטים הבודדים באמצעות תוכנת MotionCor29. בצע את ההקרנה הראשונית של מיקרוגרפים מתוקנים בתנועה באופן ידני בעזרת חבילת תוכנה cisTEM14.
    הערה: כמעט 85% מהמיקרוגרפים שנרכשו באופן אוטומטי היו באיכות טובה, ולנתונים היה אות בתוך 3.7-5.2 Å, המחושב באמצעות תוכנת cisTEM14 (איור משלים S7A, B).
  3. עבד את הנתונים באמצעות חבילת התוכנה RELION 3.011.
    1. בחרו חלקיקי ספייק באופן ידני והכפפו אותם לסיווג מחלקה דו-יומי (איור משלים S7C). השתמש במחלקה הדו-ממדית הטובה ביותר כהפניה לבחירה אוטומטית של 3,99,842 חלקיקים חד-ספייק מהמיקרוגרפים באמצעות כלי הבחירה האוטומטית RELION11.
      הערה: שלושה סיבובים של סיווג 2D בוצעו לפני חשיפת החלקיקים לסיווג 3D (איור משלים S8). כ-2,55,982 חלקיקים בודדים נבחרו לסיווג תלת-ממדי, וערצת הנתונים סווגה לשש מחלקות. עידון אוטומטי תלת-ממדי סופי בוצע עם המעמד הטוב ביותר; 85,227 חלקיקי ספייק התקבלו מהסיווג 3D.
    2. לאחר עידון אוטומטי, בצע שיפור לכל נטרול חלקיקים עם פרמטרים מתאימים של הטיית קרן לשיפור הרזולוציה. לאחר מכן, הכפוף את החלקיקים לליטוש בייסיאן באמצעות חבילת התוכנה RELION 3.011. לבסוף, השתמש בערכת החלקיקים המלוטשים לסיבוב נוסף של עידון אוטומטי תלת-ממדי באמצעות RELION 3.011.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במצב המגיפה הנוכחי, cryo-EM ממלא תפקיד מרכזי באפיון המבנים של חלבונים שונים מ SARS-CoV-226,27,28,29, אשר עשויים לסייע בפיתוח חיסונים ותרופות נגד הנגיף. יש צורך דחוף במאמצי מחקר מהירים עם משאבי אנוש מוגבלים למאבק במחלת הקורונה של 2019. רכישת נתונים בהקפאה-EM של חלקיק יחיד היא צעד גוזל זמן אך מכריע בקביעת המבנה של מקרומולקולים. ההתפתחויות האחרונות ברכישת נתונים אוטומטית של Cryo-EM אפשרו התערבות א...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Latitude-S הוא ממשק משתמש אינטואיטיבי, המספק סביבה להפעלה ואיסוף אוטומטי של אלפי מיקרוגרפים ברזולוציה גבוהה או קבצי סרטים ביומיים. הוא מספק ניווט קל על פני הרשתות ושומר על המיקום של שלב המיקרוסקופ בזמן שהוא עובר מהגדלה נמוכה להגדלה גבוהה. כל שלב של רכישת נתונים עם Latitude-S הוא חסכוני בזמן, עם תכונות כגון ממשק משתמש פשוט, הזרמה מהירה של נתונים במהירות של עד 4.5 GB/s, ותצוגה סימולטת של נתונים במהלך הרכישה. בנוסף, פרמטרים של פירוק מינון, קצב מינון, מיקוד והגדלה כיול מראש נטענו מחדש בקלות כדי להתחיל הפעלה חדשה של רכישת נתו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים מתחרים או פיננסיים להצהיר עליהם.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים במחלקה לביוטכנולוגיה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST) ומדע, והמשרד לפיתוח משאבי אנוש (MHRD), הודו, למימון ומתקן ה- cryo-EM ב- IISc-Bangalore. אנו מכירים בתוכנית בונה DBT (BT/INF/22/SP22844/2017) ו-DST-FIST (SR/FST/LSII-039/2015) עבור מתקן הקריו-EM הלאומי ב- IISc, בנגלור. אנו מכירים בתמיכה כספית של המועצה לחקר המדע וההנדסה (SERB) (מענק מס'-SB/S2/RJN-145/2015, SERB-EMR/2016/000608 ו-SERB-IPA/2020/000094), DBT (מענק מס'. BT/PR25580/BRB/10/1619/2017). אנו מודים לגברת אישיקה פרמניק על הכנת רשתות קריו-EM, איסוף נתונים של cryo-EM והכנת טבלת החומרים. אנו מודים גם למר סומאן מישרה על עיבוד התמונה cryo-EM ועל שעזר לנו להכין את הדמויות. אנו מודים לפרופ' רגהאבן ורדרג'אן על שעזר לנו להשיג את דגימת חלבון הספייק המטוהרת עבור מחקר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
נייר ספוגטד פלה, INC.47000-100פריט הכנת דגימה EM
קפסולהתרמו פישר סיינטיפיק9432 909 97591יחידת הכנת דגימה EM
קלטתתרמו פישר סיינטיפיק1020863יחידת הכנת דגימה EM
C-ClipThermo Fisher Scientific1036171EM פריט הכנת דגימה
C-Clip Insertion ToolThermo Fisher Scientific9432 909 97571EM כלי להכנת דגימה
C-Clip טבעתתרמו פישר מדעי1036173EM פריט הכנת דגימה
רשת EM (Quantifoil)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתQ3100AR1.3R 1.2/1.3 300 רשת,
מכונת פריקת זוהרQuorumN/AQuorum GlowQube מכונת פריקת זוהר
K2 DEDGatan Inc.לא ישיםמכשיר לאיסוף נתונים Cryo-EM (מצלמה)
Latitude S SoftwareGatan Inc.תוכנת הדמיה
תחנת טעינהThermo Fisher Scientific1130698EM יחידת הכנת דגימות
Talos 200 kV ArcticaThermo Scientific™N/Aמיקרוסקופ אלקטרוני קריו-אלקטרוני
Vitrobot Mark IVThermo Fisher ScientificN/AEM יחידת הכנת דגימות
זהב

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, Y., Cash, J. N., Tesmer, J. J. G., Cianfrocco, M. A. High-throughput cryo-EM enabled by user-free preprocessing routines. Structure. 28 (7), 858-869 (2020).
  2. Carragher, B., et al. Leginon: An automated system for acquisition of images from vitreous ice specimens. Journal of Structural Biology. 132 (1), 33-45 (2000).
  3. Stagg, S. M., et al. Automated cryoEM data acquisition and analysis of 284 742 particles of GroEL. Journal of Structural Biology. 155 (3), 470-481 (2006).
  4. Frank, J. Single-particle reconstruction of biological macromolecules in electron microscopy-30 years. Quarterly Reviews of Biophysics. 42 (3), 139-158 (2009).
  5. Biyani, N., et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
  8. McMullan, G., Chen, S., Henderson, R., Faruqi, A. R. Detective quantum efficiency of electron area detectors in electron microscopy. Ultramicroscopy. 109 (9), 1126-1143 (2009).
  9. Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: Anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  10. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980(2015).
  11. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  12. Grigorieff, N. FREALIGN: High-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  13. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  14. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. CisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. eLife. 7, 35383(2018).
  15. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  16. Zhang, P., Beatty, A., Milne, J. L. S., Subramaniam, S. Automated data collection with a Tecnai 12 electron microscope: Applications for molecular imaging by cryomicroscopy. Journal of Structural Biology. 135 (3), 251-261 (2001).
  17. Lei, J., Frank, J. Automated acquisition of cryo-electron micrographs for single particle reconstruction on an FEI Tecnai electron microscope. Journal of Structural Biology. 150 (1), 69-80 (2005).
  18. Potter, C. S., et al. Leginon: A system for fully automated acquisition of 1000 electron micrographs a day. Ultramicroscopy. 77 (3-4), 153-161 (1999).
  19. Mastronarde, D. N. Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements. Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).
  20. Suloway, C., et al. Automated molecular microscopy: The new Leginon system. Journal of Structural Biology. 151 (1), 41-60 (2005).
  21. Korinek, A., Beck, F., Baumeister, W., Nickell, S., Plitzko, J. M. Computer controlled cryo-electron microscopy - TOM2 a software package for high-throughput applications. Journal of Structural Biology. 175 (3), 394-405 (2011).
  22. Shi, J., Williams, D. R., Stewart, P. L. A Script-Assisted Microscopy (SAM) package to improve data acquisition rates on FEI Tecnai electron microscopes equipped with Gatan CCD cameras. Journal of Structural Biology. 164 (1), 166-169 (2008).
  23. Marsh, M. P., et al. Modular software platform for low-dose electron microscopy and tomography. Journal of Microscopy. 228, Pt 3 384-389 (2007).
  24. Zhang, J., et al. JADAS: A customizable automated data acquisition system and its application to ice-embedded single particles. Journal of Structural Biology. 165 (1), 1-9 (2009).
  25. Pramanick, I., et al. Conformational flexibility and structural variability of SARS-CoV2 S protein. Structure. , (2021).
  26. Zhou, D., et al. Structural basis for the neutralization of SARS-CoV-2 by an antibody from a convalescent patient. Nature Structural and Molecular Biology. 27 (10), 950-958 (2020).
  27. Hillen, H. S., et al. Structure of replicating SARS-CoV-2 polymerase. Nature. 584 (7819), 154-156 (2020).
  28. Wrapp, D., et al. Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science. 367 (6483), 1260-1263 (2020).
  29. Thoms, M., et al. Structural basis for translational shutdown and immune evasion by the Nsp1 protein of SARS-CoV-2. Science. 369 (6508), 1249-1255 (2020).
  30. Kumar, A., Sengupta, N., Dutta, S. Simplified approach for preparing graphene oxide tem grids for stained and vitrified biomolecules. Nanomaterials. 11 (3), 1-22 (2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Particle Cryo EMAutomated Data AcquisitionCryo EM SoftwareHigh Throughput ImagingSpike Protein StructureElectron MicroscopyData Collection AutomationDirect Electron DetectorStructural Characterization3D Classification

Related Articles