Method Article

מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה

DOI:

10.3791/62842

⸱

August 2nd, 2021

 , 
1Translational Inflammation Research, Center of Dynamic Systems, Otto von Guericke University Magdeburg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפופטוזיס Extrinsic הוא בתיווך על ידי ההפעלה של קולטני מוות (DRs) כגון CD95 /Fas/APO-1 או גידול נמק הקשורים אפופטוזיס-גרימת ליגנד (TRAIL)-קולטן 1/קולטן 2 (TRAIL-R1/R2). גירוי של קולטנים אלה עם ליגנדים מודעים שלהם מוביל להרכבה של תסביך איתות גרימת מוות (DISC). ה-DISC כולל את DR, חלבון המתאם Fas הקשור לתחום המוות (FADD), פרוקספסות-8/-10, ואינטרלוקין דמוי FADD תאי (IL)-1β הממיר חלבונים מעכבי אנזימים (c-FLIPs). הדיסק משמש כפלטפורמה לעיבוד והפעלה של פרוקספאז-8. זה האחרון מתרחש באמצעות דימרציה שלה / אוליגומריזציה בתחום אפקט המוות (DED) חוטים שהורכבו בדיסק.

הפעלה של procaspase-8 מלווה בעיבוד שלה, אשר מתרחשת במספר שלבים. בעבודה זו, מתוארת זרימת עבודה ניסיונית מבוססת המאפשרת מדידה של היווצרות דיסק ועיבוד של פרוקספאז-8 במתחם זה. זרימת העבודה מבוססת על טכניקות אימונופרציפיטציה הנתמכות על-ידי ניתוח כתם מערבי. זרימת עבודה זו מאפשרת ניטור זהיר של שלבים שונים של גיוס procaspase-8 ל- DISC ועיבודו והיא רלוונטית מאוד לחקירת מנגנונים מולקולריים של אפופטוזיס קיצוני.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אחד קולטני המוות הנחקרים ביותר (DRs) הוא CD95 (פאס, APO-1). המסלול האפופטוטי הקיצוני מתחיל באינטראקציה של ה- DR עם ליגנד הקוגנייט שלו, כלומר, CD95L מקיים אינטראקציה עם CD95 או TRAIL נקשר ל- TRAIL-Rs. התוצאה היא היווצרות הדיסק ב- DR. DISC המתאים מורכב CD95, FADD, פרוקספאז-8/-10, וחלבוני C-FLIP1,2. יתר על כן, הדיסק מורכב על ידי אינטראקציות בין חלבונים המכילים תחום מוות (DD), כגון CD95 ו- FADD, וחלבונים המכילים DED כגון FADD, פרוקספסאז-8/-10 ו- c-FLIP (איור 1). Procaspase-8 עובר אוליגומריזציה באמצעות שיוך של DDs שלה, וכתוצאה מכך היווצרות של חוטי DED, ואחריו הפעלה ועיבוד פרוקספאז-8. הדבר מעורר מפל מפל, מה שמוביל למוות תאי (איור 1)3,4. לכן, procaspase-8 הוא יזם מרכזי caspase של מסלול אפופטוזיס extrinsic בתיווך CD95 או TRAIL-Rs, מופעל בפלטפורמה המקרומולקולרית המתאימה, דיסק.

שני איזופורמים של פרוקספאז-8, כלומר פרוקספאז-8a (p55) ו -8b (p53), ידועים שגויסו ל- DISC5. שני האיזופורמים מורכבים משני מקרים של נזיפה. DED1 ו- DED2 ממוקמים בחלק N-terminal של procaspase-8a/b ואחריו הדומיינים הקטליטיים p18 ו- p10. ניתוח מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית מפורטת (cryo-EM) של ממסמכים מזהים פרוקספצאז-8 גילה את ההרכבה של חלבוני פרוקספאז-8 למבנים חוטיים הנקראים חוטי DED4,6. למרבה הפלא, רשתות הפרוקספסאז-8 הליניאריות הוצעו בתחילה לעסוק בדימרציה ואחריה הפעלת פרוקספסאז-8 בדיסק. עכשיו, זה ידוע כי רשתות אלה הם רק תת מבנה של חוט DED procaspase-8, האחרון מורכב שלוש שרשראות התאספו סליל משולש3,4,6,7.

עם עמעום בסימת DED, שינויים קונפורמציה procaspase-8a/b להוביל להיווצרות של המרכז הפעיל של procaspase-8 והפעלתו3,8. לאחר מכן עיבוד procaspase-8, אשר מתווך באמצעות שני מסלולים: הראשון עובר דרך הדור של מוצר מחשוף p43/p41 והשני באמצעות הדור הראשוני של מוצר מחשוף p30. מסלול p43/p41 הוא ביוזמת מחשוף של פרוקספז-8a/b ב Asp374, וכתוצאה מכך p43/p41 ו p12 מחשוף מוצרים(איור 2). יתר על כן, שברים אלה הם אוטומטית קטליטית בקע ב Asp384 ו Asp210/216, מה שמוליד היווצרות של הטרוטרמר קפסטה פעיל-8, p102/p1829,10,11. בנוסף, הוכח כי במקביל למסלול העיבוד p43/p41, פרוקספז-8a/b מבקע גם ב-Asp216, מה שמוביל להיווצרותו של מוצר המחשוף C-terminal p30, ואחריו הפרוטאוליזה שלו ל-p10 ו-p1810 (איור 2).

הפעלה של פרוקספאז-8a/b בסיבי DED מוסדרת בקפדנות על ידי חלבונים הנקראים c-FLIPs12. חלבוני C-FLIP מופיעים בשלושה איזופורמים: C-FLIPלונג (c-FLIPL),C-FLIPShort (c-FLIPS)ו-C-FLIPRaji (c-FLIPR). כל שלושת האיזופורמים מכילים שני מקרים של פענוחים באזור N-terminal שלהם. c-FLIPL כולל גם תחום דמוי קפטאז12,13. שני האיזופורמים הקצרים של C-FLIP-C-FLIPS ו- c-FLIPR- פועלים באופן אנטי-אפופטוטי על ידי שיבוש היווצרות חוט DED בדיסק6,14,15. בנוסף, c-FLIPL יכול לווסת את הפעלת caspase-8 באופן תלוי ריכוז. זה יכול לגרום הן אפקטים פרו-אנטיאפופטוטיים 16,17,18. על ידי יצירת פרוקספאז פעיל קטליטית-8/c-FLIPL הטרודימר, c-FLIPL מוביל לייצוב של המרכז הפעיל של פרוקספז-8 והפעלתו. הפונקציה pro- או אנטי אפופטוטי של c-FLIPL תלויה ישירות בכמות שלה בסיבי DED ואת הכמות הבאה של procaspase-8/c-FLIPL הטרודימרים19. ריכוזים נמוכים או בינוניים של C-FLIPL בדיסק גורמים לכמויות מספיקות של הטרודימרים פרוקספאז-8/c-FLIPL בסיעת DED, התומכת בהפעלה של caspase-8. לעומת זאת, כמויות מוגברות של c-FLIPL מובילות ישירות להשפעות האנטי-אפופטוטיות שלה בדיסק20.

יחד, ההפעלה ועיבוד של procaspase-8a/b בדיסק הוא תהליך מוסדר מאוד הכולל מספר שלבים. מאמר זה דן במדידת עיבוד procaspase-8 ישירות בדיסק, כמו גם בניתוח הרכב של קומפלקס זה. פעולה זו תוצג באמצעות תקליטור CD95 כמתחם DR למופת.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים בתאי T בוצעו על פי ההסכם האתי 42502-2-1273 Uni MD.

1. הכנת תאים לניסוי

הערה: המספר הממוצע של תאים עבור אימונופרציפיטציה זו הוא 1 × 107. תאים דבקים צריכים להיות זרע יום אחד לפני הניסוי, כך שיש 1 × 107 תאים ביום הניסוי.

  1. הכנת תאים חסידיים לניסוי
    1. זרע 5-8 × 106 תאים דבקים ב 20 מ"ל של בינוני (ראה טבלת החומרים עבור הרכב) עבור כל תנאי ב 14.5 ס"מ מנות יום אחד לפני תחילת הניסוי.
    2. ביום הניסוי, ודא כי התאים הם 80-90% משוחחים ודבקים במנה. יש להשליך את המדיום ולהוסיף מדיום טרי לתאים החסידים.
  2. הכנת תאי השעיה לניסוי
    1. בזהירות למקם 1 × 107 תאי השעיה ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את שולחן החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
    2. אם אתה משתמש בתאים ראשיים, בודד תאי T ראשיים בהתאם להליך המתואר קודם לכן21. לטפל בתאי T ראשוניים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל פיטוהמגלוטינין עבור 24 שעות, ואחריו 25 U / mL IL2 טיפול במשך 6 ימים.
    3. יש למקם בזהירות 1 × 108 תאי T ראשוניים ב 10 מ"ל של מדיום תרבות (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לכל תנאי 14.5 ס"מ מנות מיד לפני תחילת הניסוי.
      הערה: מומלץ מספר גבוה יותר זה של תאי T ראשיים, מכיוון שתאים אלה קטנים יותר.

2. גירוי CD95L

  1. לעורר את התאים עם CD95L (מיוצר כמתואר בעבר20 או זמין מסחרית (ראה טבלת החומרים)).
    הערה: הריכוז של CD95L וזמן הגירוי הם תלויים בסוג התא13,15,22,23,24,25. הכן מצב גירוי אחד פעמיים כדי ליצור מדגם 'בקרת חרוזים' במקביל.
    1. לעורר תאים חסידים עם הריכוז הנבחר של CD95L. החזק את הצלחת בזווית והזרימו את הליגנד למדיום מבלי לגעת בתאים החסידים.
    2. לעורר תאי השעיה עם CD95L על ידי צנרת פתרון ליגנד לתוך ההשעיה של התא.

3. קציר תאים ותסיסה

  1. מניחים את הכלים הסלולריים על קרח.
    הערה: אל תמחק את המדיום. תאים גוססים צפים במדיום וחשובים לניתוח.
  2. הוסף 10 מ"ל של תמיסת מלח קר פוספט חוצץ (PBS) להשעיית התא ולגרד את התאים המצורפים מהצלחת. לאסוף את ההשעיה התא בצינור 50 מ"ל.
  3. לשטוף את צלחת התא עם 10 מ"ל של PBS קר פעמיים ומניחים את פתרון לשטוף לתוך אותו צינור 50 מ"ל. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F).
  4. להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר. העבר את ההשעיה התאית לתוך צינור 1.5 מ"ל.
  5. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של PBS קר.
  6. צנטריפוגות השעיית התא ב 500 × גרם במשך 5 דקות, 4 °C (5 °F). להשליך את supernatant ו resuspend את גלולה התא עם 1 מ"ל של חוצץ תמיסת (המכיל 4% קוקטייל מעכב פרוטאז). לדגור אותו במשך 30 דקות על קרח.
  7. צנטריפוגות ליסאט במהירות מקסימלית (~ 17,000 × גרם)במשך 15 דקות, 4 °C (4 °F).
  8. מעבירים את הסופר-נט (ליסאט) לצינור נקי. להשליך את הכדור. קח 50 μL של ליסאט בצינור אחר. לנתח את ריכוז החלבון על ידי ברדפורד assay ולקחת את כמות ליסאט המקביל 25 מיקרוגרם של חלבון בלוויון. הוסף מאגר טעינה (עיין בטבלת החומרים עבור הרכב) ל- Vial. לאחסן אותו ב -20 °C (70 °F) כמו בקרת ליסייט.

4. אימונופרציפיטציה (IP)

  1. הוסף 2 μL של נוגדנים נגד APO-1 ו 10 μL של חלבון חרוזי ספרוז (מוכן כפי שהומלץ על ידי היצרן) ליסאט. הוסף רק 10 μL של החרוזים לצינור נפרד המכיל ליסאט (מדגם מגורה) כדי ליצור 'בקרת חרוזים'.
    הערה: השתמש טיפים pipet עם פתחים רחבים או על ידי חיתוך הטיפים או קניית טיפים מיוחדים עבור IP תוך טיפול חלבון חרוזים ספרוז.
  2. לדגור על התערובת של ליסאט עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז עם ערבוב עדין לילה ב 4 °C (70 °F). צנטריפוגה ליסאטים עם נוגדנים / חלבון חרוזי ספרוז ב 500 × גרם במשך 4 דקות, 4 °C (4 °F). להשליך את supernatant, להוסיף 1 מ"ל של PBS קר חרוזים, ולחזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים.
  3. זרוק את סופר-טבעי. שאפו את החרוזים עדיף עם מזרק 50 μL המילטון.

5. כתם מערבי

  1. הוסף 20 μL של 4x חוצץ טעינה (ראה את טבלת החומרים עבור הרכב) לחרוזים וחום ב 95 °C (10 דקות). מחממים את פקדי הלסייט ב-95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  2. העמיסו את ה-lysates, IPs ותקן החלבון על ג'ל נתרן דודסיל סולפט (SDS) ב-12.5% (ראו טבלת החומרים להכנת הג'ל) והפעלו במתח קבוע של 80 וולט.
  3. מעבירים את החלבונים מג'ל SDS לקרום ניטרוצלולוז.
    הערה: כאן, הטכניקה היבשה למחצה, ממוטבת לחלבונים מעניינים, שימשה להעברה מעל 12 דקות (25 V; 2.5 A = קבוע). השרו את קרום הניטרוצלולוז ושתי ערימות העברה מיני-גודל במאגר אלקטרופורזה (ראו טבלת החומרים להרכב, היכונו בהתאם להוראות היצרן) במשך כמה דקות לפני הכתם המערבי.
  4. מניחים את הממברנה הכתומה בקופסה וחוסמים אותה למשך שעה אחת בתמיסת חסימה (0.1% Tween-20 ב- PBS (PBST) + 5% חלב). לדגור על הממברנה עם פתרון חסימה תחת תסיסה עדינה.
  5. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.

6. זיהוי כתם מערבי

  1. הוסף את הנוגדן העיקרי הראשון בדילול המצוין (ראה טבלת החומרים) לממברנה ודגר אותו למשך הלילה בשעה 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  2. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
  3. לדגור את הממברנה עם 20 מ"ל של נוגדן משני (מדולל 1:10,000 PBST + 5% חלב) עם רועד עדין במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
  4. לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם PBST במשך 5 דקות כל לשטוף.
  5. להשליך PBST ולהוסיף כ 1 מ"ל של מצע peroxidase חזרת לממברנה.
  6. זהה את האות chemoluminescent (ראה טבלת החומרים).
    הערה: זמן החשיפה ומספר התמונות שנתפסו תלויים בכמות החלבון בתא ודעת הספציפיות של הנוגדנים המשמשים. זה חייב להיות הוקם אמפירית עבור כל נוגדן המשמש לגילוי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי לנתח גיוס caspase-8 לדיסק ועיבודו בדיסק CD95, מאמר זה מתאר זרימת עבודה קלאסית, המשלבת IP של דיסק CD95 עם ניתוח כתם מערבי. הדבר מאפשר זיהוי של מספר תכונות מרכזיות של הפעלת caspase-8 בדיסק: ההרכבה של הפלטפורמה המקרומולקולרית המפעילה caspase-8, גיוס פרוקספז-8 ל- DISC ועיבוד של קספאז יוזם זה (איור 1 ואיור 2). זרימת עבודה זו כוללת טיפול בתאים רגישים עם CD95L באופן תלוי זמן, ואחריו תמוגה שלהם, immunoprecipitation באמצעות נוגדנים נגד CD95 (אנטי APO-1), וניתוח כתם מ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישה זו תוארה לראשונה על ידי Kischkel ואח'27 ופותחה בהצלחה מאז על ידי מספר קבוצות. מספר נושאים חשובים יש לשקול עבור יעיל דיסק-immunoprecipitation וניטור בעיבוד caspase-8 במתחם זה.

ראשית, זה חיוני כדי לעקוב אחר כל שלבי הכביסה במהלך immunoprecipitation. חשוב במיוחד הם צעדי הכביסה הסופיים של חרוזי ספרוז וייבוש של חרוזי ספרוז. זה חייב להיעשות כראוי כדי להגדיל את יחס האות / רעש של immunoprecipitation, המאפשר זיהוי של גיוס ועיבוד caspase-8 ב- DISC. חשוב, עבור טכניקות אנליטיות...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מכירים בקרן וילהלם סנדר (2017.008.02), המרכז למערכות דינמיות (CDS), הממומן על ידי תוכנית האיחוד האירופי ERDF (הקרן האירופית לפיתוח אזורי) ו- DFG (LA 2386) לתמיכה בעבודתנו. אנו מודים לקרינה גוטק על תמיכתה בניסויים שלנו. אנו מודים לפרופ' דירק ריינהולד (OvGU, מגדבורג) על כך שסיפק לנו תאי T ראשוניים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12.5% ג'ל SDSמיוצרלשני ג'לים מפרידים:
3.28 מ"ל מזוקק H2O
2.5 מ"ל Tris; pH 8.8; 1.5 M
4.06 מ"ל אקרילאמיד
100 ומיקרו; L 10% SDS
100 ומיקרו; L 10% APS
7.5 ומיקרו; L TEMED

לשני ג'ל איסוף:
3.1 מ"ל מזוקק H2O
1.25 מ"ל Tris; pH 6.8; 1.5 M
0.5 מ"ל אקרילאמיד
50 ומיקרו; L 10% SDS
25 ומיקרו; L 10% APS
7.5 ומיקרו; L TEMED
14.5 ס"מ כלי תאיםגריינר639160
אקרילאמידקארל רוטA124.1
קצות פיפט מסנן אירוסול עם מסנן התאוששות גבוהה ופתח רחבVWR46620-664 (צפון אמריקה) או 732-0559 (אירופה)משמש לפיפטינג חרוזים לליזאט
אנטי אקטין AbSigma AldrichA2103דילול: 1:4000 ב- PBST + 1:100 NaN3
אנטי-APO-1 Abשסופק בניסויים אלה על ידי פרופ' פ. קרמר או ניתן לרכישה על ידי EnzoALX-805-038-C100המשמש רק למשקעים חיסוניים
אנטי-קספאז-10 AbביוזולMBL-M059-3דילול: 1:1000 ב-PBST + 1:100 NaN3
>anti-caspase-3Ab איתות תאיAb 9662דילול S: 1:2000 ב-PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15המסופק בניסויים אלה על ידי פרופ' פ. קרמר או ניתן לרכישה על ידי ENZOALX-804-242-C100דילול: 1:20 ב-PBST + 1:100 NaN3
>anti-CD95 AbSanta Cruzsc-715דילול: 1:2000 ב-PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Abהמסופק בניסויים אלה על ידי פרופ' פ. קרמר או ניתן לרכישה על ידי ENZOALX-804-961-0100דילול: 1:10 ב-PBST + 1:100 NaN3
>anti-FADD 1C4 Abשסופק בניסויים אלה על ידי פרופ' פ. קרמר או ניתן לרכישה על ידי ENZOADI-AAM-212-Eדילול: 1:10 ב-PBST + 1:100 NaN3
>anti-PARPAb איתות9542דילול: 1:1000 ב-PBST + 1:100 NaN3
APSקארל רות'9592.3
β-mercaptoethanolCarl Roth4227.2
Bradford solution
תרכיז מגיב צבע לבדיקת חלבון 450 מ"ל		Bio Rad500-0006בשימוש על פי הוראות היצרן
CD95Lהמסופק בניסויים אלה על ידי פרופ' פ. קרמר או ניתן לרכוש על ידי גלאי כימולומינסנציה ENZOALX-522-020-C005

Chem Doc XRS+		Bio Rad
קוקטייל מעכב cOmplete Protese (PIC)Sigma Aldrich11 836 145 001מוכן על פי הוראות היצרן
DPBS (10x) ללא Ca, דילול MgPAN BiotechP04-535001:10 עם H2O, אחסון במקרר
מאגר אלטרופורזהמתוצרתעצמיתמאגר אלקטרופורזה 10x:
60.6 גרם Tris
288 גרם גליצין
20 גרם SDS
ad 2 ליטר H2O
דילול 1:10 לפני השימוש
גליציןCarl Roth3908.3
דילול עיזים נגד עכבר IgG1 HRPSouthernBiotech1070-05דילול 1:10.000 ב-PBST + 5% חלב
עיזים נגד עכבר IgG2b HRPSouthernBiotech1090-05דילול 1:10.000 אינץ' PBST + 5% חלב
עיזים נגד ארנב IgG-HRPSouthernBiotech4030-05דילול 1:10.000 ב-PBST + 5%
חלב אינטרלוקין-2 אנושי (hIL-2)Merckgroup/ Roche11011456001להפעלת תאי T
KClCarl Roth6781.2
KH2PO4Carl Roth3904.1
מאגר טעינה
4x Laemmli מאגר דגימה, 10 מ"ל		Bio Rad161-0747מוכן על פי הוראות היצרן
מצע Luminata Forte Western HRPMilliporeWBLUFO500
מאגר ליזהמתוצרת13.3 מ"ל Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M
27.5 מ"ל NaCl; 5 M
10 מ"ל EDTA; 2 מ
100 מ"ל Triton X-100
להוסיף 960 מ"ל H2O
לתאים נדבקים DMEM F12 (1:1) עם גלוטמין יציב,   2,438 גרם/ליטרPAN BiotechP04-41154מוסיף 10% FCS, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.0001% פורומיצין למדיום הבינוני
עבור תאי T ראשונייםג'יבקו על ידי Life Technologie21875034הוספת 10% FCS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין
לאבקת החלבCarl RothT145.4
Na2HPO4Carl RothP030.3
NaClCarl Roth3957.2
PBSTתוצרת20x PBST:
230 גרם NaCl
8 גרם KCl
56.8 גרם Na2HPO4
8 גרם KH2PO4
20 מ"ל Tween-20
ad 2 ליטר H2O
דילול 1:20 לפני השימוש
PBST + 5% חלבמתוצרת50 גרם אבקת חלב + 1 ליטר PBST
PHAThermo Fisher ScientificR30852801להפעלת תאי T
Power Pac HCBio Rad
Precision Plus Protein Standard All BlueBio Rad161-0373שימוש בין 3-5 למיקרו; L
חלבון A חרוזי Sepharose CL-4BNovodirect/ Th.GeyerGE 17-0780-01חרוזי שרף זיקה שהוכנו על פי הוראות היצרן
מגרדVWR734-2602
SDSCarl Roth4360.2
שייקרהיידולף
נתרן אזידקארל רוטK305.1
TEMEDCarl Roth2367.3
Trans Blot Turbo ערימות העברה מיני-גדולותBio Rad170-4270בשימוש על פי הוראות היצרן
TransBlot Turbo 5x Transfer BufferBio Rad10026938הוכן על פי הוראות היצרן
TransBlot Turbo ממברנת ניקוטרוצלולוזה בגודל מיניBio Rad170-4270בשימוש על פי הוראות היצרן
Trans-Blot-TurboBio Rad
TrisChem Solute8,08,51,000
Triton X-100Carl Roth3051.4
Tween-20Pan Reac Appli ChemA4974,1000
בעצמו עצמית הבינונית עצמית עצמית

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
  2. Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
  3. Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
  4. Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
  5. Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
  6. Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
  7. Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
  8. Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
  9. Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
  10. Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
  11. Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
  12. Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
  13. Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
  14. Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
  15. Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
  16. Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
  17. Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
  18. Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
  19. Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
  20. Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
  21. Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
  22. Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
  23. Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
  24. Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
  25. Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
  26. Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352(2010).
  27. Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
  28. Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
  29. Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Death Inducing Signaling ComplexProcaspase 8 ProcessingCD95 DISC FormationExtrinsic ApoptosisImmunoprecipitation TechniqueWestern BlotCaspase 8 ActivationFADD Recruitmentc FLIP ProteinsCaspase 8 Activity Assay

Related Articles