הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62853

⸱

19 ביולי 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo

במאמר זה

סיכום

למרות ההתקדמות האחרונה, חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים רבים עדיין נשארים עם הפונקציות שלהם לא ידוע לחלוטין. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה ואמינה כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial של חלבונים, אשר היה בסיסי עבור הפיהור של הפונקציות המולקולריות שלהם.

תקציר

למרות ההתקדמות האחרונה באפיון פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, לוקליזציה submitochondrial של מספר משמעותי של חלבונים נשאר חמקמק. כאן, אנו מתארים שיטה חזקה ויעילה לקביעת לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים, אשר נחשב צעד בסיסי במהלך הפרטרה פונקציית חלבון מיטוכונדריאלי. שיטה זו כרוכה בצעד ראשוני המורכב מהשגת מיטוכונדריה שלמה טהורה מאוד. תכשירים מיטוכונדריאליים אלה כפופים לאחר מכן לפרוטוקול תת-ניתוח המורכב מהלם היפוטוני (נפיחות) ודגירה עם פרוטאז K (פרוטאז). במהלך הנפיחות, הממברנה המיטוכונדריאלית החיצונית משובשת באופן סלקטיבי, ומאפשרת לחלבון-ase K לעכל חלבונים של תא החלל הבין-ימי. במקביל, כדי לקבל מידע על הטופולוגיה של חלבוני ממברנה, ההכנות המיטוכונדריאליות הם בתחילה sonicated, ולאחר מכן נתון מיצוי אלקליין עם נתרן קרבונט. לבסוף, לאחר צנטריפוגה, הכדור ושברים על טבעיים מטיפולים שונים אלה מנותחים על ידי SDS-PAGE וכתם מערבי. לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבון העניין מתקבל על ידי השוואת פרופיל כתם המערבי שלה עם סטנדרטים ידועים.

מבוא

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אאוקריוטים הממלאים תפקידים מכריעים בביו-אנרגטיקה, חילוף חומרים תאי ומסלולי איתות1. כדי לבצע כראוי משימות אלה, המיטוכונדריה מסתמכת על קבוצה ייחודית של חלבונים ושומנים האחראים על המבנה והתפקוד שלהם. שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae כבר בשימוש נרחב כמערכת מודל עבור חקירות על תהליכים מיטוכונדריאליים, כמו גם עבור אברונים אחרים2. קודי הגנום המיטוכונדריאליים לשמונה חלבונים בלבד בשמרים; הרוב המכריע של החלבונים המיטוכונדריאליים (כ-99%) מקודדים על ידי גנים גרעיניים, המתורגמים לריבוזומים ציטוזוליים, ולאחר מכן מיובאים לתאי השליחה הנכונים שלהם על ידי מכונות ייבוא חלבונים מתוחכמות3,4,5. לפיכך, ביוגנזה מיטוכונדריאלית תלויה בביטוי המתואם של הגנום הגרעיני והמיטוכונדריאלי6,7. מוטציות גנטיות הגורמות לפגמים בביוגנזה מיטוכונדריאלית קשורות למחלות אנושיות8,9,10.

בשני העשורים האחרונים, מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה המתמקדים במיטוכונדריה מטוהרת מאוד הביאו לאפיון מקיף של פרוטאום מיטוכונדריאלי שמרים, אשר הוערך כי הוא מורכב לפחות 900 חלבונים11,12,13,14. למרות שמחקרים אלה סיפקו מידע רב ערך, לוקליזציה תת-אורגנית של כל חלבון בארבעת תתי-הדירות המיטוכונדריאליות, כלומר, הממברנה החיצונית (OM), המרחב הבין-משרדי (IMS), הממברנה הפנימית (IM) והמטריקס, עדיין נדרשת. שאלה זו טופלה בחלקה במחקרים פרוטאומיים של שתי תתי-התת-קומפרטציות המיטוכונדריאליות הקטנות יותר (OM ו- IMS)15,16. לאחרונה, Vögtle ומשתפי פעולה עשו צעד גדול קדימה על ידי יצירת מפה גלובלית באיכות גבוהה של הפצת חלבון submitochondrial בשמרים. באמצעות גישה משולבת המשלבת ספקטרומטריית מסה כמותית מבוססת SILAC, פרוטוקולי שברים שונים של submitochondrial, ואת ערכת הנתונים מפרוטומים OM ו- IMS, המחברים הקצו 818 חלבונים לארבעת תתי-ההפרשות המיטוכונדריאליות13.

למרות ההתקדמות שהושגו על ידי מחקרים פרוטאומיים בעלי תפוקה גבוהה אלה, הידע שלנו על הרכב הפרוטאום ההגשה רחוק מלהיות שלם. ואכן, בין 986 חלבונים שדווחו על ידי Vögtle ומשתפי פעולה כמו להיות מקומי לתוך מיטוכונדריה שמרים, 168 לא יכול להיות מוקצה בכל אחד מארבעת התאים submitochondrial13. יתר על כן, המחברים לא סיפקו מידע על טופולוגיית הממברנה של חלבונים שהיו צפויים להיות מחוברים באופן היקפי לפריפריה של ממברנות מיטוכונדריאליות. לדוגמה, לא ניתן לדעת אם חלבון שהוקצה כמו מחובר היקפית לממברנה הפנימית פונה למטריצה או לחלל הבין-משרדי. מלבד נתונים חסרים אלה ממחקרים ברחבי פרוטאום, ישנם מידע סותר על לוקליזציה תת-אורגנית של מספר משמעותי של חלבונים מיטוכונדריאליים. דוגמה אחת היא פרוטאז Prd1, אשר הוקצה כחלבון חלל בין-משרדי במסדי הנתונים הנפוצים כגון מסד נתונים גנום Saccharomyces (SGD) ו Uniprot. באופן מפתיע, באמצעות פרוטוקול תת-תרגול דומה לזה המתואר כאן, Vögtle ומשתפי פעולה הראו בבירור כי Prd1 הוא חלבון מטריצה אמיתי13. כפי שהוזכר לעיל, לוקליזציה גש של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים צריך להיות מבורר או הערכה מחדש. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פשוט ואמין כדי לקבוע את לוקליזציה תת-אורגנית של חלבונים מיטוכונדריאליים שמרים. פרוטוקול זה פותח ואופטימיזציה על ידי קבוצות מחקר שונות, שימש באופן שגרתי כדי לקבוע את לוקליזציה submitochondrial, כמו גם את טופולוגיית הממברנה של חלבונים מיטוכונדריאליים רבים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צמיחה של תאי שמרים

  1. לבודד מושבות בודדות של זן העניין על ידי פסים חלק קטן של התאים מ -80 °C מלאי גליסול על YPD (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלוקוז) צלחת אגר. לדגור על הצלחת ב 30 °C (50 °F) במשך 2-3 ימים.
    הערה: זן S. cerevisiae המשמש בפרוטוקול זה נגזר על ידי BY4741 (MATα; שלו3Δ1; leu2Δ0; met15Δ0; ura3Δ0). למעט הגנים סמן auxotrophic, זן זה אינו מכיל שום גן נמחק ואינו נושא שום plasmid. לכן, זה יכול להיות מעובד בהצלחה במדיום עשיר, מגרה צמיחת תאים נמרצת. בעת עבודה עם זנים שהומרו עם plasmids, להשתמש במדיום המינימלי המתאים עבור בחירה plasmid.
  2. הכן תרבות התחלה על ידי חקיקה 2-3 מושבות בודדות מצלחת אגר YPD ב 10-20 מ"ל של בינוני YPGal (1% תמצית שמרים, 2% פפטון, 2% גלקטוז) בבקבוק ארלנמייר 100 מ"ל. דגירה ב 30 °C (50 °F) במשך 24 שעות עם רועד נמרץ.
    הערה: הבחירה של מדיום הצמיחה תלויה בזן השמרים המשמש בפרוטוקול. הן YPD והן YPGal מכילים מקורות פחמן מותססים, המאפשרים צמיחה של זנים שאינם מבצעים נשימה מיטוכונדריאלית. עם זאת, מאז גלוקוז מדחיק את הביטוי של גנים מיטוכונדריאליים רבים, לא מומלץ להשתמש במקור פחמן זה שכן הוא יפיק כמויות נמוכות יותר של מיטוכונדריה. כאשר עובדים עם זנים מוסמכים נשימתיים שיכולים להנשים, ניתן גם להשתמש במקורות פחמן כגון גליצריול ואתנול בניסיון להשיג תשואה גבוהה יותר של המיטוכונדריה.
  3. לדלל את תרבות המתנע לתוך 1 ליטר של מדיום YPGal טרי ל OD600 פחות מ 0.1. לטפח את התאים ב 30 °C (55 °F) עם רועד נמרץ עד OD600 מגיע 1-1.5.
    הערה: לקבוע את קצב הצמיחה (זמן הכפלה) עבור כל זן שמרים לפני ביצוע הניסוי. זה יספק הערכה מדויקת של זמן הדגירה הנדרש לתרבות כדי להגיע OD600 של 1-1.5.

2. בידוד של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ- 17, עם שינויים קלים.

  1. לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. לשטוף את התאים עם מים מזוקקים ולאסוף אותם על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. לקבוע את המשקל הרטוב של התאים.
    הערה: הדרך הקלה ביותר למדוד את המשקל של גלולה התא בשלב 2.2 היא לקבוע את המשקל של צינור הצנטריפוגה הריק ממש לפני איסוף התאים. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant ולמדוד את המשקל של אותו צינור עם התאים. משקל התאים הוא ההבדל בין שתי המדידות.
  4. תקצה מחדש את התאים במאגר DTT (2 מ"ל לכל 1 גרם תאים) באמצעות פיפטה פסטר או קצה P5000. ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר DDT.
  5. לדגור על התאים ב 30 °C (20 °F) במשך 20 דקות עם רועד עדין (~ 70 סל"ד).
  6. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
  7. לשטוף את התאים עם חיץ זימוליאז ללא האנזים (כ 7 מ"ל לכל 1 גרם של תאים).
    ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר זימוליאז.
  8. צנטריפוגה ב 3,000 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים.
  9. resuspend התאים במאגר ללא זימוליאז (7 מ"ל לכל 1 גרם של תאים).
  10. מעבירים את ההשעיה של התא לבקבוק ארלנמאייר 250 מ"ל ומוסיפים זימוליאז-20T (3 מ"ג למשקל רטוב).
  11. לדגור על התאים ב 30 °C (30 °F) במשך 30-40 דקות עם רועד עדין (~ 70 סל"ד). בדוק את היעילות של תהליך זה על ידי השוואת עכורות של השעיית התא לפני ואחרי טיפול Zymolyase.
    הערה: בשלב זה, התאים יומרו לספרופלסטים עקב עיכול דופן התא על ידי זימוליאז.
    1. בשביל זה, להוסיף 50 μL של כל מתלה תא צינורות זכוכית נפרדים המכילים 2 מ"ל של מים. לאחר ערבוב נמרץ, את עכוזות של השעיית התא שטופלו עם זימוליאז צריך להקטין במהירות עקב הפרעה osmotic של spheroplasts. מצד שני, העקשניות של השעיית התא הלא מטופל צריכה להישאר ללא שינוי.
      הערה: ההשפעות של עכוז יכול להיות מנוטר גם על ידי בדיקה חזותית פשוטה או על ידי מדידת OD600 של שתי הדגימות. במקרה השני, OD600 של המדגם שטופלו Zymolyase צריך להיות 10%-20% של המדגם שאינו מטופל. שיטה חלופית כוללת ספירת התאים בשתי הדגימות באמצעות מיקרוסקופיה קלה.
    2. אם התשואה של היווצרות spheroplasts נמוכה, להוסיף עוד זימוליאז ודגרה במשך מרווח נוסף של 15 דקות.
  12. קציר את הכדור על ידי צנטריפוגה ב 2500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
    הערה: כל הצעדים הנוספים צריכים להתבצע במהירות על קרח או ב 4 °C (55 °F) כדי למנוע השפלת חלבון על ידי אנזימים הידרוליטיים.
  13. לשטוף את spheroplasts פעמיים עם חוצץ הומוגניזציה קר כקרח (כ 6.5 מ"ל לכל 1 גרם של תאים) וכדור על ידי צנטריפוגה ב 2,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). ראה טבלה 1 לקבלת הרכב מאגר הומוגניזציה.
  14. resuspend את הכדורים במאגר הומוגניזציה קר כקרח (6.5 מ"ל לכל 1 גרם של תאים) ולהעביר אותו זכוכית מצוננת מראש הומוגניזר Dounce. השתמש הומוגניזר זכוכית גדול של כ 30 מ"ל.
  15. הומוגניזציה של הכדורים עם 15 משיכות באמצעות עלה.
    הערה: יש להתאים את מספר הקווים בהתאם להתאמת העקלים. עבור עלה הדוק, 15 משיכות מספיקות. מצד שני, אם משתמשים בעלילה רופפת, מומלץ לבצע עד 25 משיכות.
  16. מעבירים את ההומוגנית לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל ומוסיפים נפח אחד של חיץ הומוגניזציה קר כקרח.
  17. צנטריפוגות הומוגנט במהירות נמוכה, 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C כדי גרעיני גלולה, פסולת תאים, ותאים רצוף.
  18. העבר את supernatant לצינור צנטריפוגה חדש 50 מ"ל באמצעות פיפטה פסטר או קצה P5000 דואגים למנוע שיבוש הכדור.
  19. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  20. מעבירים את הסופר-נט לצינור צנטריפוגה במהירות גבוהה, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי ללגום את שבר המיטוכונדריה הגולמי.
  21. השליכו את גלם העל ושטפו בעדינות את גלולה המיטוכונדריה הגולמית במאגר הומוגניזציה קר כקרח של 20-30 מ"ל על ידי צנרת עדינה באמצעות קצה P5000.
  22. העבר את ההשעיה לצינור צנטריפוגה 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי גלולה את פסולת התא הנותרת.
  23. מעבירים את הסופר-נט לצינור צנטריפוגה במהירות גבוהה, וצנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי ללגום את שבר המיטוכונדריה הגולמי.
  24. השלך את supernatant בעדינות resuspened הכדור המיטוכונדריאלי הגס בנפח קטן (בדרך כלל 1000 μL) של חוצץ SEM קר כקרח על ידי pipetting עדין באמצעות קצה P1000. ראה טבלה 1 עבור הרכב מאגר SEM.
    הערה: למרות שבר מיטוכונדריאלי גולמי זה ניתן להשתמש ישירות ביישומים מסוימים כגון בחלבון organello ייבוא assays, הוא מכיל כמויות משמעותיות של רכיבים תאיים אחרים. זיהומים אלה עלולים להוביל לפרשנות שגויה של התוצאות בעת קביעת לוקליזציה של גישושנדריאלי של חלבון. לכן, צעדי טיהור נוספים נדרשים כדי לקבל הכנה מיטוכונדריאלית מטוהרת מאוד, כמתואר להלן.
  25. הכן פתרונות סוכרוז במאגר EM בריכוזים של 60%, 32%, 23% ו- 15% (w/v). פתרונות אלה יציבים עד חודש אחד ב 4 °C (5 °F). ראה טבלה 1 עבור קומפוזיציה של מאגר EM.
  26. הכן שיפוע סוכרוז 4 שלבים בצינור אולטרה צנטריפוגה כדלקמן: מניחים 1.5 מ"ל של 60% (w / v) סוכרוז על החלק התחתון של צינור הצנטריפוגה. לאחר מכן, pipette בזהירות צעד: 4 מ"ל של 32%, 1.5 מ"ל של 23%, ו 1.5 מ"ל של 15% סוכרוז (w / v). יש להצטפיד להימנע משיבוש השלבים.
  27. טען בזהירות את השבר המיטוכונדריאלי הגולמי על גבי מעבר הצבע סוכרוז.
  28. צנטריפוגה עבור 1 שעות ב 134,000 x g ב 4 °C (50 °F) ברוטור דלי מתנדנד.
  29. בזהירות לשמור על הסרת פתרון סוכרוז עד שבר המיטוכונדריה מטוהר מאוד הוא הגיע אשר מיוצג על ידי פס חום בממשק סוכרוז 60%/32%.
  30. לשחזר את המיטוכונדריה המטוהרת באמצעות קצה לחתוך P1000 ולהניח אותו לתוך צינור צנטריפוגה במהירות גבוהה צונן מראש.
  31. לדלל את המיטוכונדריה התאושש עם 5-10 כרכים של חוצץ SEM קר כקרח.
  32. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 12,000 x גרם ב 4 °C (70 °F).
  33. resuspend המיטוכונדריה הטהורה ב 500 μL של חוצץ SEM קר כקרח על ידי pipetting עדין באמצעות קצה לחתוך P1000.
  34. לקבוע את ריכוז החלבון של הכנת מיטוכונדריאלי מטוהר מאוד באמצעות הליך ברדפורד בעקבות הוראות היצרן. התאם את ריכוז החלבון ל-10 מ"ג חלבון/מ"ל עם חוצץ SEM קר כקרח.
    הערה: עבור פרוטוקול הפירוק של השליח המתואר להלן, מומלץ להשתמש במיטוכונדריה שהוכנה זה עתה. עם זאת, Vögtle ומשתפי פעולה ביצעו ניתוח בקרת איכות מפורט של שלמות המיטוכונדריה והראו כי אברונים קפואים יכולים לשמש גם בפרוטוקול זה13. בשביל זה, לעשות aliquots של 40 μL ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. יש לאחסן ב-80 °C (70 °F).

3. פרוטוקול פירוק של שלשה

הערה: פרוטוקול זה מותאם מ- reference18 ומורכב משני שלבים: (1) נפיחות היפוטונית בנוכחות או היעדר פרוטאינאז K, ו - (2) sonication ואחריו מיצוי קרבונט. בצע את כל השלבים של שני הפרוטוקולים על קרח או ב 4 °C (7 °F) כדי למנוע השפלת חלבון.

  1. נפיחות היפוטונית בנוכחות פרוטאינאז K
    1. העבר 40 μL של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ב 10 מ"ג / מ"ל (400 מיקרוגרם) לארבעה 1.5 מ"ל מראש מצוננים מראש שכותרתו צינורות microcentrifuge.
    2. הוסף 360 μL של מאגר SEM בצינורות 1 ו- 2.
    3. הוסף 360 μL של חיץ EM בצינורות 3 ו -4.
    4. יש להוסיף 4 מיקרו-אל של פרוטאינאז K (10 מ"ג/מ"ל) בצינורות 2 ו-4. השתמש בערכת ההצינורות המפורטת בטבלה 2 כדי למנוע טעויות.
      הערה: הכן פתרון של 10 מ"ג/מ"ל של פרוטאינאז K במים מיד לפני השימוש. הריכוז הסופי של פרוטאינאז K בניסוי צריך להיות סביב 50-100 מיקרוגרם /מ"ל. נא עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים.
    5. מערבבים את כל הצינורות בעדינות ודגרה על קרח במשך 30 דקות עם ערבוב מדי פעם.
    6. הוסף 4 μL של 200 mM PMSF לכל ארבעת הצינורות כדי לעצור את פעילות proteinase K.
      זהירות: PMSF הוא רעיל מאוד. ללבוש כפפות בעת עבודה עם פתרונות המכילים PMSF.
    7. צנטריפוגה ב 20,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
    8. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו חדש 1.5 מ"ל מראש מצונן שכותרתו צינור microcentrifuge. יש לה מקפיד להימנע משיבוש הכדור.
      הערה: ניתן תולה ישירות resuspended במאגר המדגם לניתוח SDS-PAGE נוסף כתם מערבי. עם זאת, עקבות של חלבון K יכול להישאר פעיל גם לאחר טיפול PMSF ובסופו של דבר יכול לעכל כמה חלבונים לאחר הכדור כבר מומס במאגר מדגם המכיל SDS. כדי למנוע בעיה זו, proteinase K יכול להיות מומת לחלוטין על ידי טיפול של דגימות עם חומצה trichloroacetic (TCA) כפי שתואר להלן.
      זהירות: TCA רעיל מאוד. ללבוש כפפות בעת עבודה עם פתרונות המכילים TCA.
    9. resuspend הכדור מ שלב 3.1.8 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח.
    10. לזרז את supernatant (מן שלב 3.1.8) ואת הכדור resuspended (מן שלב 3.1.9) עם TCA לריכוז סופי של 10% (w / v).
    11. לדגור את כל הצינורות על קרח במשך 10 דקות.
    12. צנטריפוגה דגימות שטופלו TCA במשך 10 דקות ב 12,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    13. הסר את supernatant ו resuspend הכדור ב 200 μL של חוצץ מדגם.
      הערה: ייתכן כי מחוון pH כחול ברומופנול הופך צהוב בגלל הטיפול בחומצה. במקרה כזה, הוסיפו עליקוטים קטנים (1-5 μL) של בסיס טריס אחד M עד שהוא הופך לכחול.
    14. הוסף 4 μL של 200 mM PMSF לכל הצינורות.
    15. אחסן את כל הדגימות ב--80 °C (80 °F) עד לניתוח נוסף על-ידי SDS-PAGE וכתם מערבי.
  2. סוניקציה ומיצוי פחמתי
    הערה: בפרוטוקול זה, אין צורך להשתמש במיטוכונדריה שהוכנה טרי ברגע sonication גורם לקרע של הממברנות המיטוכונדריאליות.
    1. העבר 200 μL של מיטוכונדריה מטוהרת מאוד ב 10 מ"ג / מ"ל (2 חלבון מ"ג) לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל מקורר מראש.
    2. לדלל את המיטוכונדריה פי אחד עם חוצץ SEM קר כקרח.
    3. סוניקאט מיטוכונדריה במשך 3 על 30 s על קרח. השתמש בסוניקאטור התואם לאמצעי אחסון קטנים.
    4. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    5. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש מצונן מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר חלבון מסיס (S).
    6. resuspend הכדור מ שלב 3.2.4 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח.
    7. קח 100 μL של הכדור resuspended מ שלב 3.2.6 ולהעביר אותו צינור microcentrifuge חדש 1.5 מ"ל מקורר מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר חלקיקים שולחים (SMP).
    8. לדלל את 300 μL הנותרים משלב 3.2.6 פי אחד עם 200 mM מוכן טרי נתרן קרבונט.
    9. לדגור על המדגם מ שלב 3.2.8 על קרח במשך 30 דקות.
    10. צנטריפוגה הדגימה במשך 30 דקות ב 100,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    11. לאסוף את supernatant ולהעביר אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל חדש מצונן מראש. שמור את זה על קרח. מדגם זה ייקרא שבר על-טבעי פחמתי (CS).
    12. resuspend הכדור מ שלב 3.2.10 ב 400 μL של חוצץ SEM קר כקרח. מדגם זה ייקרא שבר מזורם קרבונט (CP).
    13. לזרז את כל הדגימות (S, SMP, CS, ו- CP) עם TCA לריכוז סופי של 10% (w/ v).
    14. לדגור את כל הצינורות על קרח במשך 10 דקות.
    15. צנטריפוגה דגימות שטופלו TCA במשך 10 דקות ב 12,000 x g ב 4 °C (70 °F).
    16. הסר את supernatant ו resuspend כל גלולה במאגר המדגם. אם מאגר המדגם הופך לצהוב, הוסף עליקוטים קטנים (1-5 μL) של בסיס טריס 1 M עד שהוא הופך לכחול.
    17. הוסף 1 μL של 200 mM PMSF לכל הצינורות.
    18. אחסן את כל הדגימות ב--80 °C (80 °F) עד לניתוח נוסף על-ידי SDS-PAGE וכתם מערבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ההצלחה של פרוטוקול הפירוק של ההגשה תלויה בהשגת מיטוכונדריה שלמה מטוהרת מאוד. בשביל זה, זה חיוני כי במהלך תמוגה תא שמרים, שלמות של organelles נשאר כמעט לחלוטין השתמר. זה מושגת באמצעות פרוטוקול תמוגה תא המשלב את העיכול אנזימטי של דופן התא ואחריו הפרעה פיזית של קרום הפלזמה באמצעות homogenizer Dounce. התוכן המיטוכונדריאלי נאסף לאחר מכן על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. שבר תת-תאי זה מניב שבר מיטוכונדריאלי מועשר, כפי שאושר על ידי נוכחות של רמות גבוהות של פורינו (Por1), חלבון סמן מיטוכונדריאלי (איור 1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפרוטוקול המוצג כאן נעשה שימוש מוצלח ואופטימיזציה רציפה במשך זמן רב כדי לקבוע את לוקליזציה חלבון בתאי submitochondrial13,14,18,21,22,23. האמינות והשחזור של פרוטוקול זה תלויים מאוד בטוהר ושלמות ההכנות המיטוכונדריאליות18. שתי הדרישות הללו מושגות על-ידי הוספת שלב טיהור נוסף (צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לד"ר א. ציגלוף (אוניברסיטת קולומביה) על אספקת נוגדנים שהועלו כנגד חלבוני סמן קשירת ים Cyt. b2, αKGD וסקו1. אנו מודים גם לד"ר מריו הנריקה דה בארוס (Universidade de São Paulo) על דיון והערות מועילות במהלך הקמת פרוטוקול זה.

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מ Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (grant 2013/07937-8).

פרננדו גומס והלנה טוראנו נתמכים גם על ידי FAPESP, מענקים 2017/09443-3 ו 2017/23839-7, בהתאמה. Angélica Ramos נתמך גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bacto PeptoneBD211677
תמצית שמרי בקטוBD212750
צינורות צנטריפוגה אולטרה-קלירים של בקמן, 14 x 89 מ"מBeckman Coulter
(ללא חומצות שומן BSA)Sigma-AldrichA7030רכיב של מאגר הומוגניזציה
DL-DithiothreitolSigma-Aldrich43815רכיב של מאגר DDT
D-סורביטולSigma-AldrichS1876
חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)סיגמא-אולדריץ'E9884
גלקטוזסיגמא-אולדריץ'G0625
גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7021
MOPSסיגמא-אולדריץ'M1254
פניל מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF)סיגמא-אולדריץ'P7626משמש לנטרול פרוטאינאז K
אשלגן פוספט דו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'P3786
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא-אולדריץ'P0662
פרוטאינאז Kסיגמא-אולדריץ
סוכרוזסיגמא-אולדריץ'S8501
חומצה טריכלורואצטית (TCA)Sigma-AldrichT6399
Trizma BaseSigma-AldrichT1503
Zymolyase-20T מבית Arthrobacter luteusMP Biomedicals, Irvine, CA320921 משמש לליזה של דפנות תאי שמרים חיים לייצור ספרופלסט
אלבומין סרום בקר 344059 '

מקורות

  1. Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial proteins: from biogenesis to functional networks. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
  2. Malina, C., Larsson, C., Nielsen, J. Yeast mitochondria: An overview of mitochondrial biology and the potential of mitochondrial systems biology. FEMS Yeast Research. 18 (5), 1-17 (2018).
  3. Wiedemann, N., Pfanner, N. Mitochondrial machineries for protein import and assembly. Annual Review of Biochemistry. 86, 685-714 (2017).
  4. Chacinska, A., Koehler, C. M., Milenkovic, D., Lithgow, T., Pfanner, N. Importing mitochondrial proteins: machineries and mechanisms. Cell. 138 (4), 628-644 (2009).
  5. Schmidt, O., Pfanner, N., Meisinger, C. Mitochondrial protein import: from proteomics to functional mechanisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (9), 655-667 (2010).
  6. Couvillion, M. T., Soto, I. C., Shipkovenska, G., Churchman, L. S. Synchronized mitochondrial and cytosolic translation programs. Nature. 533 (7604), 499-503 (2016).
  7. Richter-Dennerlein, R., et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein. Cell. 167 (2), 471-483 (2016).
  8. Suomalainen, A., Battersby, B. J. Mitochondrial diseases: The contribution of organelle stress responses to pathology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (2), 77-92 (2018).
  9. Nicolas, E., Tricarico, R., Savage, M., Golemis, E. A., Hall, M. J. Disease-associated genetic variation in human mitochondrial protein import. American Journal of Human Genetics. 104 (5), 784-801 (2019).
  10. Calvo, S. E., Mootha, V. K. The mitochondrial proteome and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 11, 25-44 (2010).
  11. Reinders, J., Zahedi, R. P., Pfanner, N., Meisinger, C., Sickmann, A. Toward the complete yeast mitochondrial proteome: Multidimensional separation techniques for mitochondrial proteomics. Journal of Proteome Research. 5 (7), 1543-1554 (2006).
  12. Sickmann, A., et al. The proteome of Saccharomyces cerevisiae mitochondria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (23), 13207-13212 (2003).
  13. Vögtle, F. N., et al. Landscape of submitochondrial protein distribution. Nature Communications. 8 (1), 00359(2017).
  14. Morgenstern, M., et al. Definition of a high-confidence mitochondrial proteome at quantitative scale. Cell Reports. 19 (13), 2836-2852 (2017).
  15. Zahedi, R. P., et al. Proteomic analysis of the yeast mitochondrial outer membrane reveals accumulation of a subclass of preproteins. Molecular Biology of the Cell. 17 (3), 1436-1450 (2006).
  16. Vögtle, F. -N., et al. Intermembrane space proteome of yeast mitochondria. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (12), 1840-1852 (2012).
  17. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (30), e1417(2009).
  18. Boldogh, I. R., Pon, L. A. Purification and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 80 (06), 45-64 (2007).
  19. Gomes, F., et al. Proteolytic cleavage by the inner membrane peptidase (IMP) complex or Oct1 peptidase controls the localization of the yeast peroxiredoxin Prx1 to distinct mitochondrial compartments. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 17011-17024 (2017).
  20. Fujiki, Y., Hubbard, L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: Application to endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 93 (1), 97-102 (1982).
  21. Glick, B. S., et al. Cytochromes c1 and b2 are sorted to the intermembrane space of yeast mitochondria by a stop-transfer mechanism. Cell. 69 (5), 809-822 (1992).
  22. Diekert, K., de Kroon, A. I., Kispal, G., Lill, R. Isolation and subfractionation of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods in Cell Biology. 65, 37-51 (2001).
  23. Glick, B. S. Pathways and energetics of mitochondrial protein import in Saccharomyces cerevisiae. Methods in Enzymology. 260 (1992), 224-231 (1995).
  24. Meisinger, C., Sommer, T., Pfanner, N. Purification of Saccharomcyes cerevisiae mitochondria devoid of microsomal and cytosolic contaminations. Analytical Biochemistry. 287 (2), 339-342 (2000).
  25. Meisinger, C., Pfanner, N., Truscott, K. N. Isolation of yeast mitochondria. Methods in molecular biology. 313 (1), Clifton, N.J. 33-39 (2006).
  26. Kang, Y., et al. Tim29 is a novel subunit of the human TIM22 translocase and is involved in complex assembly and stability. eLife. 5, 17463(2016).
  27. Wrobel, L., Sokol, A. M., Chojnacka, M., Chacinska, A. The presence of disulfide bonds reveals an evolutionarily conserved mechanism involved in mitochondrial protein translocase assembly. Scientific Reports. 6, 27484(2016).
  28. Callegari, S., et al. TIM29 is a subunit of the human carrier translocase required for protein transport. FEBS letters. 590 (23), 4147-4158 (2016).
  29. Neupert, W., Herrmann, J. M. Translocation of proteins into mitochondria. Annual Review of Biochemistry. 76, 723-749 (2007).
  30. Meineke, B., et al. The outer membrane form of the mitochondrial protein Mcr1 follows a TOM-independent membrane insertion pathway. FEBS Letters. 582 (6), 855-860 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקום סוב-מיטוכונדריאליחלבונים מיטוכונדריאלייםטיפול ב-Proteinase Kנפיחות היפוטוניתמיצוי בסיסיSDS-PAGEWestern Blotסוב-פרקציונציה מיטוכונדריאלית
הערכה של לוקליזציה של חלבון Submitochondrial ב ניצנים שמרים Saccharomyces cerevisiae
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.