הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

4.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62866

⸱

22 ביולי 2021

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.

תקציר

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) גדלה כפלטפורמה ביוטכנולוגית הלוכדת מכונות שעתוק ותרגום במבחנה. התפתחויות רבות הפכו את פלטפורמת CFPS לנגישה יותר למשתמשים חדשים והרחיבו את מגוון היישומים. עבור מערכות CFPS מבוססות ליסאט, ניתן להפיק תמציות תאים ממגוון אורגניזמים, ולרתום את הביוכימיה הייחודית של אותו פונדקאי כדי להגביר את סינתזת החלבונים. במהלך 20 השנים האחרונות, Escherichia coli (E. coli) הפך לאחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לתמיכה ב- CFPS בשל יכולתו הכלכלית והרבגוניות שלו. למרות ההתקדמות העיקרית הרבה, זרימת העבודה להכנת תמצית תאי E. coli נותרה צוואר בקבוק מרכזי עבור משתמשים חדשים כדי ליישם CFPS עבור היישומים שלהם. זרימת העבודה של הכנת החילוץ היא עתירת זמן ודורשת מומחיות טכנית כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מחסומים אלה, דיווחנו בעבר על פיתוח של זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית (CFAI) הפועלת 24 שעות ביממה ללא תאים, המפחיתה את קלט המשתמש ואת המומחיות הטכנית הנדרשת. זרימת העבודה של CFAI ממזערת את העבודה ואת המיומנות הטכנית הנדרשת ליצירת תמציות תאים תוך הגדלת הכמויות הכוללות של תמציות תאים המתקבלות. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה הזו באופן שלב אחר שלב כדי לשפר את הגישה ולתמוך ביישום הרחב של CFPS מבוסס E. coli .

מבוא

השימוש בסינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) ליישומי ביוטכנולוגיה גדל משמעותית בשנים האחרונות 1,2,3. ניתן לייחס התפתחות זו בחלקה למאמצים מוגברים בהבנת התהליכים המתרחשים ב- CFPS ובתפקידו של כל רכיב 4,5. בנוסף, עלויות מופחתות המיוחסות לתפאורות ממוטבות ולמקורות אנרגיה חלופיים הפכו את הטכנולוגיה נטולת התאים לקלה יותר ליישום עבור משתמשים חדשים 6,7,8,9. על מנת ליישם את גורמי השעתוק והתרגום הדרושים לסינתזת חלבונים, תמצית התא משמשת לעתים קרובות להנעת תגובות ללא תאים10. מדריכי משתמשים שפורסמו לאחרונה סיפקו פרוטוקולים פשוטים להפקת תמצית פונקציונלית, מה שמקל על היישום עבור משתמשים חדשים ומנוסים כאחד 1,11,12,13,14. תמצית תאים מתקבלת בדרך כלל באמצעות תזה של תרבית תאים, אשר ניתן לגדל באמצעות אורגניזמים שונים בהתאם לשימוש הספציפי הרצוי 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) הפך במהירות לאחד האורגניזמים המארחים הנפוצים ביותר לייצור תמציות פונקציונליות17. זן BL21 Star (DE3) מועדף מכיוון שהוא מסיר את הפרוטאזות מהממברנה החיצונית (OmpT פרוטאז) והציטופלסמה (Lon protease), ומספק סביבה אופטימלית לביטוי החלבון הרקומביננטי. בנוסף, ה-DE3 מכיל את ה-λDE3 שנושא את הגן עבור T7 RNA פולימראז (T7 RNAP) תחת שליטתו של מקדם ה-lacUV5; רכיב הכוכב מכיל גן RNaseE שעבר מוטציה המונע ביקוע של mRNA 4,14,18,19. תחת מקדם lacUV5, אינדוקציה של איזופרופיל-תיוגלאקטופירנוזיד (IPTG) מאפשרת ביטוי של T7 RNAP20,21. זנים אלה משמשים לגידול וקציר תאים, אשר נותנים חומר גלם להכנת תמצית. ניתן לבצע ליזיס של תאים במגוון שיטות, כולל הכאת חרוזים, עיתונות צרפתית, הומוגניזציה, סוניקציה וקוויטציה של חנקן 1,11,12,22.

תהליך תרביות החיידקים והקציר עקבי ברוב הפלטפורמות בעת שימוש ב-E. coli, אך דורש מספר ימים ופיקוח אינטנסיבי של החוקריםעל 1,11,13. תהליך זה מתחיל בדרך כלל בתרבית זרעי לילה במרק LB, אשר עם צמיחת הלילה מחוסנת לתרבית גדולה יותר של 2xYTPG (שמרים, טריפטון, מאגר פוספטים, גלוקוז) למחרת. הצמיחה של תרבית גדולה יותר זו מנוטרת עד שהיא מגיעה לשלב הלוג המוקדם עד אמצע, בצפיפות אופטית (OD) של 2.514,20. נדרשת מדידה מתמדת מכיוון שמרכיבי התעתיק והתרגום הוכחו בעבר כפעילים מאוד בשלב הלוג המוקדם עד אמצע23,24. בעוד שתהליך זה יכול ליצור תמצית הניתנת לשחזור, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה שיטה חדשה באמצעות מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI), אשר מפחיתה את הפיקוח על החוקרים, מגדילה את התפוקה הכוללת של תמצית עבור ליטר נתון של תרבית תאים, ומשפרת את הגישה להכנת תמצית מבוססת E. coli עבור משתמשים מנוסים וחדשים כאחד (איור 1 ). כאן אנו מספקים את המדריך שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה של CFAI, כדי לעבור מלוח תאים מפוספס לתגובת CFPS שהושלמה תוך 24 שעות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צמיחה במדיה

  1. הכן 960 מ"ל של מדיית CFAI כמתואר בטבלה 1 והתאם את ה- pH ל- 7.2 באמצעות KOH.
  2. העבר את מדיית התרבות לבקבוקון מבולבל של 2.5 ל' ואוטוקלב למשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו תמיסת סוכר של 40 מ"ל כמתואר בטבלה 1. מסננים-מעקרים את התמיסה למיכל זכוכית אוטוקלבי נפרד.
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הסוכר באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. אפשרו למדיה להתקרר לחלוטין אל מתחת ל-40 מעלות צלזיוס לאחר האוטוקלבינג.
  5. לפני חיסון המדיה של CFAI, להוסיף את תמיסת הסוכר ישירות למדיה CFAI.
  6. כדי לחסן את התקשורת, החליקו לולאה של מושבות מצלחת E. coli BL21 Star (DE3) שהייתה מפוספסת בעבר והכנסו ישירות לתקשורת. סובבו את הלולאה לתוך המדיה אך הימנעו מלגעת בצידי המיכל. ודאו שצלחת הפסים טרייה, עם תאים בני קיימא.
  7. מניחים את הבקבוקון עם המדיה המחוסנת באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב-200 סל"ד. אפשרו לתרבות לצמוח בן לילה. אם התאים מחוסנים בערב, התרבית תגיע לצפיפות אופטית משוערת, הנמדדת ב-600 ננומטר (OD600), מתוך 10 בבוקר שלאחר מכן. ניתן להתאים את זמני החיסון והקציר לפי הצורך.

2. קציר תאים

  1. הכינו מראש את מאגר S30 ושמרו עליו קר. הכן את מאגר S30 לפי טבלה 2, ל- pH סופי של 8.2.
    הערה: ניתן להכין את מאגר S30 ימים לפני קצירת התאים. אם זה נעשה, להכין ללא dithiothreitol ולאחסן ב 4 °C (66 °F). הוסיפו את dithiothreitol רגע לפני השימוש.
  2. מנקודה זו והלאה, שמור את כל הפתרונות והחומרים על הקרח. העבר 1 ליטר של מדיה לתוך בקבוק צנטריפוגה 1 L וצנטריפוגה ב 5,000 x גרם בין 4-10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. דקאנט וסילוק הסופרנאטנט. באמצעות מרית סטרילית, מעבירים את הכדור לצינור חרוטי מצונן מראש ומשקלו בעבר 50 מ"ל.
  3. יש לשטוף פעם אחת עם 30-40 מ"ל של חיץ S30 קר על ידי שימוש חוזר בכדור באמצעות מערבולות ב-30 שניות מתפרצות עם תקופות מנוחה על קרח.
    הערה: בשל נפח גבוה יותר של גלולה, פיצול גלולת התא לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל יכול להיות מועיל לשלב הכביסה. אחסון תאים באליקוטים קטנים יותר מספק גם גמישות לעיבוד במורד הזרם.
  4. צנטריפוגה את החייאת התא ב 5000 x g בין 4-10 °C למשך 10 דקות.
  5. השליכו את הסופרנאטנט ונגבו כל עודף מהקירות הפנימיים של הצינור החרוטי 50 מ"ל באמצעות רקמה נקייה, הימנעו מלגעת בכדור עצמו. שוקלים ומהבהבים להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    הערה: ייתכן שכדורים לא ידרשו הקפאת הבזק אם המשתמש מתכנן להמשיך בפרוטוקול הכנת החילוץ.

3. חילוץ הכנה

  1. שלבו את הכדור הקפוא עם 1 מ"ל של חיץ S30 עבור כל גרם אחד של גלולת התא ואפשרו להפשיר על הקרח למשך כ-30-60 דקות. כדור מופשר באמצעות מערבולת בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על הקרח. מערבולת עד שלא נותרו גושים נראים לעין של תאים.
    הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בגושים קטנים יותר על ידי ערבוב באמצעות פיפטה.
  2. העברת אליקוטים של 1.4 מ"ל של החייאת תאים לצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל לצורך תסיסת תאים. Sonicate כל צינור עם תדר של 20 kHz ו 50% משרעת עבור שלושה התפרצויות של 45 s עם 59 s של מנוחה בכל מחזור מוקף באמבט קרח. הפוך את הצינור בין המחזורים ומיד הוסף 4.5 μL של 1 M dithiothreitol לאחר מחזור הסוניקה האחרון.
    הערה: בשל החום המשתחרר מסוניקציה, חשוב מאוד לוודא שכל האליקוטים נשמרים על קרח כאשר הם לא נסתמים. אמבט הקרח צריך להיות כל הזמן מחודש או גדול מספיק כדי להישאר קריר לאורך כל תהליך sonication.
  3. צנטריפוגה כל צינור ב 18,000 x g ו 4 ° C במשך 10 דקות. שלפו את הסופרנאטנט ואת האליקוט לתוך צינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל ב-600 μL aliquots. פלאש להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף. יש להקפיד על פיפטה רק על הסופרנאטנט.

4. סינתזת חלבונים ללא תאים

  1. להפשיר תמצית אחת מהשלב הקודם לביצוע 15 μL של תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בצינורות מיקרופוגה של 1.5 מ"ל ב-quadruplicate.
  2. הכינו כל תגובה על ידי שילוב של 240 ננוגרם של דנ"א (ריכוז סופי של 16 מיקרוגרם/מ"ל), 2.20 מיקרול"ל של תמיסה A, 2.10 μL של תמיסה B, 5.0 μL של תמצית, ונפח משתנה של מים ברמה מולקולרית כדי למלא את התגובה ל-15 μL. ניתן לשנות את קנה המידה של תגובה זו לנפחים גבוהים יותר. ראה טבלה 3 לקבלת יחסים.
    1. הכן את פתרון א' ו-ב' לפי לוח 4. ניתן להכין כל תמיסה בקבוצות של 100 μL עד 1 מ"ל, לדחוס אותה ולאחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: כמות הדנ"א יכולה להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. במקרה זה, הפלסמיד שבו נעשה שימוש, pJL1-sfGFP, עבר אופטימיזציה לביצועים של 16 מיקרוגרם/מ"ל, או 597 מיקרומטר.
  3. תנו לתגובות לרוץ לפחות 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

5. כימות של חלבון כתב, חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (sfGFP)

  1. באמצעות צלחת פוליסטירן שחורה בעלת חצי שטח של 96 בארות, שלב 2 μL של כל תוצר תגובת סינתזת חלבונים ללא תאים עם 48 μL של 0.05 M HEPES buffer ב- pH 7.2. שלושה עד ארבעה שכפולים של כל צינור תגובה מומלצים.
  2. לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של ה-sfGFP עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 528 ננומטר.
  3. להמרה של יחידות פלואורסצנטיות יחסיות לתפוקה נפחית (מיקרוגרם/מ"ל) של sfGFP, קבעו עקום סטנדרטי באמצעות pJL1-sfGFP מטוהר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בעת הכנת מדיה CFAI, גלוקוז הוחלף לעלייה בלקטוז וגליצרול כמצע האנרגיה העיקרי בתקשורת. בנוסף, קיבולת האגירה של המדיה CFAI הוגדלה גם כן. רכיבים ספציפיים אלה מופיעים בטבלה 1.

לאחר מכן התאים גודלו הן ל-OD600 מתוך 10 והן ל-2.5 הסטנדרטי במדיית CFAI כדי להראות עקביות עם איכות החילוץ למרות כמויות החילוץ המשתנות. המדיה של 2.5 OD600 CFAI גדלה לאחר שהתחסנה מתרבות זרעים בציר LB ב-37 °C (74 °F), 200 סל"ד, בעוד שתרבות OD600 10 חוסנה ישירות מצלחת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פיקוח על חוקרים נחוץ באופן מסורתי לשתי פעולות מפתח במהלך גדילת התאים: אינדוקציה של T7 RNAP ותאי קצירת תאים ב-OD600 ספציפי. CFAI מייתר את שתי הדרישות הללו כדי להפחית את הזמן וההכשרה הטכנית הנדרשת לחוקר על מנת להכין תמציות תאים באיכות גבוהה. אינדוקציה אוטומטית של T7 RNAP מושגת על ידי החלפת גלוקוז בלקטוז כסוכר העיקרי בתקשורת, מה שמייתר את הצורך הקודם לעקוב באופן פעיל אחר הצמיחה ולאחר מכן לגרום עם IPTG בנקודה מדויקת במהלך צמיחת התא. הצורך לנטר באופן פעיל תרביות תאים כדי לקצור ב-OD600 מסוים מתבטל גם הוא,...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים כספיים מתחרים.

תודות

המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ניפר ונדרקלן ולאנדראה לובשר על התמיכה הטכנית. המחברים רוצים להודות גם לניקול גרגוריו, מקס לוין, אליסה מולין, ביונגצ'ול סו, אוגוסט ברוקוול, אליזבת (ליזי) וויבודה, לוגן ברינגטון וג'יליאן קסמן על דיונים מועילים. המחברים מכירים גם בתמיכת מימון מקרן ביל ולינדה פרוסט, המרכז ליישומים במענק המחקר היישומי של שברון ביוטכנולוגיה, Cal Poly Research, Scholarly והקרן הלאומית למדע (NSF-1708919).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגהPhoenixMPC-425Q
1L צינור צנטריפוגהבקמן קולטרA99028
Avanti J-E צנטריפוגהבקמן קולטר369001
CoAסיגמא-אולדריץ'C3144-25MG
ציטציה 5 תאים הדמיה רב מצבית קוראביוטקBTCYT5F
D-גלוקוזפישרD16-3
D-לקטוזאלפא AesarJ66376
DTTThermoFisher15508013
חומצה פוליניתסיגמא-אולדריץ'F7878-100 מ"ג
גליצרולפישר BP229-1
גליציןסיגמא-אולדריץ'G7126-100G
HEPESThermoFisher11344041
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
JLA-8.1000 רוטורבקמן קולטר366754
K(GLU)Sigma-AldrichG1501-500G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
L-AlanineSigma-AldrichA7627-100G
L-ארגיניןסיגמא-אולדריץA8094-25G
L-אספרגיןסיגמא-אולדריץA0884-25G
L-חומצה אספרטיתסיגמא-אולדריץ'A7219-100G
L-ציסטאיןסיגמא-אולדריץ'C7352-25G
L-חומצה גלוטמיתסיגמא-אולדריץ'G1501-500G
L-גלוטמיןסיגמא-אולדריץ'G3126-250G
L-היסטדיןסיגמא-אולדריץ'H8000-25G
L-איזולאוציןסיגמא-אולדריץ'I2752-25G
L-לאוציןסיגמא-אולדריץ'L8000-25G
L-ליזיןסיגמא-אולדריץ'L5501-25G
L-מתיוניןסיגמא-אולדריץ'M9625-25G
L-פנילאלניןסיגמא-אולדריץ'P2126-100G
L-פרוליןסיגמא-אולדריץ'P0380-100G
L-סריןסיגמא-אולדריץ'S4500-100G
L-תראוניןסיגמא-אולדריץ'T8625-25G
L-טריפטופןסיגמא-אולדריץ'T0254-25G
L-טירוזיןסיגמא-אולדריץ'T3754-100G
Luria BrothThermoFisher12795027
L-ValineSigma-AldrichV0500-25G
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
מיקרופוגה 20Beckman CoulterB30134
סיגמא-אולדריץ' מים בדרגה מולקולרית7732-18-5
NaClAlfa AesarA12313
NADSigma-AldrichN8535-15VL
ניו ברונסוויק Innova 42/42R אינקובטורEppendorfM1335-0000
NH4(GLU)Sigma-Aldrich09689-250G
NTPsThermoFisherR0481
חומצה אוקסליתSigma-AldrichP0963-100G
PEPסיגמא-אולדריץ'860077-250 מ"ג
אשלגן פוספט אקרוס דו-בסיסי, אורגנייםA0382124
אשלגן פוספט אקרוס מונו-בסיסי, אורגנייםA0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep KitThermoFisherK210007
PutrescineSigma-AldrichD13208-25G
SpermidineSigma-AldrichS0266-5G
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
tRNASigma-Aldrich10109541001
TryptoneFisher Bioreagents73049-73-7
Tunair 2.5L בקבוק שייק מבולבלSigma-AldrichZ710822
מעבדאולטרסאונדQSonicaQ125-230V/50HZ
תמצית שמריםפישר ביוריאגנטים1/2/8013
' '

מקורות

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663(2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תיקון


Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 5/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

תגיות

E coliS30
מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.