כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים
במאמר זה
סיכום
תקציר
פטריות אנטומופתוגניות (EPF) הן אחד מסוכני הבקרה המיקרוביאלית לניהול מזיקים משולב. כדי לשלוט במזיקים מקומיים או פולשניים, חשוב לבודד ולבחור EPF ילידי. לכן, שיטת פיתיון הקרקע בשילוב עם פיתיון חרקים (תולעת ארוחה, מוליטור טנבריו) שימש במחקר זה עם כמה שינויים. EPF המבודד היה אז נתון לבדיקת virulence נגד המזיק החקלאי Spodoptera ליטורה. יתר על כן, זני EPF הפוטנציאליים היו נתונים לזיהויים מורפולוגיים ומולקולריים. בנוסף, ייצור קונידיה ובוח התרמוטולנס בוצעו עבור זני EPF מבטיחים והשוו; נתונים אלה הוחלפו עוד יותר בנוסחה של מספר קונידיה יעיל (ECN) לדירוג מעבדה. ניתן לשפר את מערכת תולעי הפיתיון בקרקע ואת נוסחת ECN על ידי החלפת מיני חרקים ושילוב גורמי לחץ נוספים להערכת מסחור ויישום שדה. פרוטוקול זה מספק גישה מהירה ויעילה לבחירת EPF וישפר את המחקר על סוכני בקרה ביולוגיים.
מבוא
כיום, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נמצאות בשימוש נרחב בשליטה מיקרוביאלית של מזיקים חקלאיים, יערות וגננות. היתרונות של EPF הם טווחי המארח הרחבים שלה, הסתגלות סביבתית טובה, טבע ידידותי לסביבה, וכי ניתן להשתמש בו עם כימיקלים אחרים כדי להראות את האפקט הסינרגיסטי לניהול מזיקים משולב1,2. עבור היישום כסוכן הדברה, יש צורך לבודד מספר גדול של EPF מחרקים חולים או מהסביבה הטבעית.
הדגימה של אורגניזמים אלה מן המארחים שלהם מסייעת בהבנת ההתפלגות הגיאוגרפית ואת שיעור השכיחות של EPF במארחים טבעיים3,4,5. עם זא....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: תרשים הזרימה כולו מוצג באיור 1.
1. בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות פוטנציאליות (EPF)
- לאסוף את דגימת הקרקע
- מוציאים 1 ס"מ מהקרקע, ואז אוספים את הקרקע בעומק של 5-10 ס"מ באמצעות את חפירה מכל אתר דגימה.
הערה: אתרי דגימה יהיו הר, יער, או אזורים מאוכלסים בדלילות כדי למנוע זיהום של זני EPF שרוססו באופן מלאכותי. ודא שאזורים לאיסוף דגימות הקרקע מכוסים בעצים על פני השטח. אדמה יבשה או אדמה לחה אינה מתאימה לניסוי זה. - תעד את הפרטים של כל אתר דגימה, כולל GPS, גובה, סוג שדה, טמפרטורה שנתית, משקעים שנתיים, זמן איסוף (עונה), סוג קרקע וערך pH.
- לאסוף 100 גרם של דגימת הקרקע לתו....
- מוציאים 1 ס"מ מהקרקע, ואז אוספים את הקרקע בעומק של 5-10 ס"מ באמצעות את חפירה מכל אתר דגימה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות פוטנציאליות (EPF)
על ידי שימוש בשיטת בניית ספריית אנטומופתוגנית בתיווך Tenebrio molitor (EPF), מספר הפטריות ללא פעילות הרג חרקים יוחרג; לכן, יעילות הבידוד ובחירת EPF יכול להיות מוגבר במידה רבה. במהלך היישום של שיטה זו, המידע של אתרי דגימה, דגימות קרקע, ואת שיעורי הנביטה פטרייתית נרשמו (טבלה 2). בהתבסס על הנתונים הקודמים שלנו, בסך הכל התקבלו 101 מבודדים פטרייתיים מ-172 דגימות קרקע, מה שמצביע על יעילות בידו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פטריות אנטומופתוגניות (EPF) שימשו לבקרת חרקים. קיימות מספר שיטות לבידוד, בחירה וזיהוי של EPF30,31,32. בהשוואה בין הסוגים השונים של שיטות פיתיון חרקים, בובריה באסיאנה ו Metarhizium אניסופליה נמצאו בדרך כלל פיתיונים חרקים6,12,13,14. בין פיתיונות חרקים אלה, גלריה מלונלה ו נמ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים המעורב בעבודה זו.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי גרנט 109-2313-B-005-048 -MY3 ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אגר כיתה בקטריולוגית | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | מתאים ברוב יישומי תרבית התאים/מולקולריים, ביולוגיה. |
| AGAROSE, ביוטכנולוגיה כיתה | BIOMAN SCIENTIFIC ושות', בע"מ | AGA001 | לאלקטרופורזה של DNA. |
| מאגר ג'ל DNA בטוח של BioGreen | BIOMAN | SDB001T | |
| בורר פקק פליז | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | למורפולוגיה של מושבת זן שיא |
| חממת טמפרטורה קבועה | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | שמירת פטריות. |
| cubee מיני צנטריפוגה | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 מערכת תמונה ג'ל דיגיטלית | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 עד 2 ומיקרו; L פיפטה | תרמו סיינטיפיק | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 עד 10 ומיקרו; L פיפטה | תרמו סיינטיפיק | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 עד 100 ומיקרו; L פיפטה | תרמו סיינטיפיק | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 עד 1000 ומיקרו; L פיפטה | תרמו סיינטיפיק | 4642090 | |
| פינפיפטה F2 2 עד 20 ומיקרו; L פיפטה | תרמו סיינטיפיק | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 עד 200 ומיקרו; L Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius חממת אמבטיה יבשה | מדע ראשי | MD-01N | |
| צילינדר בוגר מותאם אישית A 100 מ"ל | SIBATA | SABP-1195906 | מדוד את נפח הריאגנטים. |
| מונה ספירת יד | SDI | NO.1055 | |
| המוציטומטר | ביומן | AP-0650010 | חשב את מספר הנבגים |
| לולאת חיסון | Dogger | D8GA-23000 | |
| מכסה | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| מיקרו כיסוי זכוכית | MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD | 24241 | |
| מערכת הדמיה מיקרוסקופ | SAGE VISION ושות', בע"מ | SGHD-3.6C | |
| מיקרוסקופ שקופיות | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA ג'ל אלקטרופורזה | ADVANCE | AD110 | |
| ניקון מיקרוסקופ אופטי | SAGE VISION CO., LTD | Eclipse CI-L | |
| פלסטיק | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto מיני gDNA שמרים ערכת | Geneaid | GYBY300 | ערכת מיצוי DNA גנומי פטרייתי |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | חברת HiMedia המובילה במדעי הביולוגיה | M033 | משמשת לגידול שמרים, תבניות ומיקרואורגניזמים חומציים. |
| להב אזמל מס' 23 | Swann-Morton | 310 | |
| ידית אזמל מס' 4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| את חפירה | שמור & בטוח | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman (phytotech) | S7777 | פעילי שטח |
| Sorvall Legend Micro 17 מיקרוצנטריפוגה | תרמו מדעי | 75002403 | |
| פינצטה פלדה | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| צלחת פטרי סטרילית | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | מיכלים גליליים רדודים עם מכסים מותאמים, במיוחד לשימוש במיקרוביולוגיה או בתרבית תאים. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT מקפיא | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX-80 | ° מדגם C מאוחסן. |
| ארון מסוג רצפה אנכי | צ'י צ'ין | BSC-3 | תרבית הפעלה פטרייתית. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| שקיות אחסון רוכסן | שמור & בטוח | A -1248915 -00 | |
| 100 bp סולם DNA | Geneaid | DL007-20 | |
| ° C מקפיא | FRIGIDAIRE | Frigidaire | FFFU21M1QW-20° דגימת C וריאגנטים ניסיוניים מאוחסנים. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
מקורות
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. Biopesticides: use and Delivery. , Springer. 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Flor....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
