מאמר שיטה

פרוטוקול לניתוח ואיחוד של יציאות TrackMate למדידת תנועתיות תאים דו-ממדיים באמצעות מעקב גרעיני

DOI:

10.3791/62885

⸱

18 בדצמבר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Colorado Boulder, 2Department of Applied Mathematics, University of Colorado Boulder

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה למדידה בתפוקה גבוהה של תנועתיות התאים בקרטינוציטים של HaCaT מתאר שיטות לאיסוף ועיבוד תמונות של גרעיני תאים וביצוע מעקב אחר חלקיקים באמצעות תוסף ImageJ TrackMate.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נדידת תאים קולקטיבית ממלאת תפקיד מפתח בתהליכים ביולוגיים בסיסיים רבים, כולל התפתחות, ריפוי פצעים וגרורות סרטניות. כדי להבין את ויסות תנועתיות התאים, עלינו להיות מסוגלים למדוד אותה בקלות ובעקביות בתנאים שונים. כאן אנו מתארים שיטה למדידה וכימות תנועתיות של תא בודד ותפזורת של קרטינוציטים HaCaT באמצעות כתם גרעיני. שיטה זו כוללת סקריפט MATLAB לניתוח קבצי פלט של TrackMate לחישוב תזוזות, שיעורי תנועתיות וזוויות מסלול בתאים בודדים ובכמויות גדולות עבור אתר הדמיה. סקריפט ניתוח תנועתיות זה מאפשר ניתוח מהיר, פשוט וניתן להרחבה של שיעורי תנועתיות התאים מנתוני TrackMate וניתן להשתמש בו באופן נרחב כדי לזהות ולחקור את ויסות התנועתיות בתאי אפיתל. אנו מספקים גם סקריפט MATLAB לארגון מחדש של סרטוני מיקרוסקופיה שנאספו במיקרוסקופ והמרתם לערימות TIF, אותם ניתן לנתח באמצעות התוסף ImageJ TrackMate בכמויות גדולות. באמצעות מתודולוגיה זו כדי לחקור את התפקידים של צמתים נצמדים ודינמיקה של שלד תאים בוויסות תנועתיות התאים בקרטינוציטים של HaCaT, אנו מדגימים ראיות לכך שפעילות Arp2/3 נדרשת לתנועתיות המוגברת הנראית לאחר דלדול α-catenin בקרטינוציטים של HaCaT.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ויסות מדויק ומגיב של תנועתיות התאים בתאי האפיתל הוא חיוני לריפוי פצעים ולחידוש שכבת האפיתל. אי שמירה על תנועתיות עלולה להוביל לבעיות בהתפתחות עוברית וריפוי פצעים1 ואיתות תנועתיות יתר הוא תורם מרכזי לגרורות סרטן2.

הבנת הבקרה התאית של התנועתיות בקרטינוציטים של HaCaT מציעה תובנות חשובות לגבי תהליכים אלה. הנהלים המתוארים כאן מספקים מדידות וחישובים עקביים של הגודל הממוצע של תנועתיות התא ברמת תא בודד או אוכלוסייה. השתמשנו בשיטה זו כדי למדוד תנועתיות בקרטינוציטים של HaCaT לאחר הפרעה גנטית או טיפול במעכבי מולקולות קטנות כדי להבין את איתות התא השולט בשיעורי התנועתיות. סקריפט MATLAB המסופק מודד הן את המהירות הממוצעת והן את כיוון התנועתיות הממוצע עבור כל תא.

תנועתיות תאים קולקטיבית חיונית למעבר אפיתל-מזנכימלי הן בהתפתחות והן בגרורות סרטניות3. תאים משיגים תנועתיות באמצעות תיאום של הידבקות, קיטוב, בליטה ונסיגה4. תהליכים אלה מסתמכים במידה רבה על ויסות מתואם של שלד הציטו הדינמי של אקטין. הפעלה של Rac1 GTPase במורד הזרם של PI3K או קולטנים שונים טירוזין קינאזות מקטבת את התא, וכתוצאה מכך פילמור אקטין5. דינמיקת השלד הציטו-שלד של אקטין מווסתת על ידי GTPases זה ואחרים בתיווך Rho, המופעלים על ידי גורמי גדילה שונים במורד הזרם. GTPases אלה בתיווך Rho מפעילים את קומפלקס Arp2/3 המגרה הסתעפות אקטין6. דינמיקת שלד ציטו אקטין זו קשורה קשר הדוק לווסת מרכזי אחר של תנועתיות: צמתים בין-תאיים. אנו מתעניינים במיוחד באופן שבו הצמתים הנצמדים, היוצרים הידבקויות חזקות בין התאים, מתואמים עם שלד הציטו של האקטין כדי לשמור על שלמות הרקמה7.

הראינו בעבר כי קרטינוציטים של HaCaT המבטאים נוקדאון α-catenin בתיווך shRNA מפגינים שיעורי תנועתיות גבוהים יותר מאלה המבטאים בקרת shRNA שאינה ממוקדת8. ברצוננו להשתמש בכלי ניתוח התנועתיות שפיתחנו כדי להבין עוד יותר את המנגנון של תנועתיות מוגברת זו עם דלדול α-קטנין. α-Catenin הוא מרכיב ציטוזולי נדרש בצמתים נצמדים9. הוא משתתף בצמתים נצמדים באמצעות האינטראקציה שלו עם ß-catenin, אותו הוא קושר כמונומר10,11. עם זאת, α-catenin יכול גם להתנתק מצמתים נצמדים ליצירת הומודימר הקושר ומצרר חוטי אקטין, מה שמעכב את פעילות Arp2/310,11. בעוד ש-α-catenin אינו מקיים אינטראקציה ישירה עם אקטין בזמן שהוא קשור ל-ß-catenin, הוא עדיין עשוי להקל או לחזק את התיאום בין צמתים נצמדים לשלד הציטו באמצעות קשירה לווינקולין, המייצב חוטי אקטין12.

בעוד שהתוסף TrackMate עבור ImageJ הוא שיטה מבוססת היטב למעקב אחר חלקיקים שניתן להשתמש בה כדי לעקוב אחר גרעיני תאים, מצאנו שהכלים הזמינים לניתוח, ניתוח ואיחוד פלטי TrackMate לחישוב תנועתיות התאים עבור אתרי הדמיה מרובים לא שולבו והיו מאתגרים לשימוש עבור אלה ללא מומחיות במספר שפות תכנות. טינבז והרברט מציעים פריימר לשימוש ב-TrackMate, אך החלק של ניתוח תזוזה ריבועית ממוצעת דורש מיומנות ניכרת של MATLAB13. שיטות קיימות לחילוץ שיעורי תנועתיות מסרטוני מיקרוסקופיה בהילוך מהיר מציעות ניתוחים תלת מימדיים מורכבים יותר אך דורשות מומחיות רבה יותר בתכנות14,15. Pathfinder, תוכנת מעקב אחר תאים וניתוח תנועתיות שפותחה בעבר במעבדה שלנו, מודדת את מהירות וכיוון העברת התאים אך ניתנת להפעלה רק במחשבי Windows ודורשת סביבת Java Runtime מגבילה16. מכיוון ש-TrackMate הוא כלי כל כך אמין ומתועד היטב, פיתחנו שיטה פשוטה להפקה, ניתוח וארגון מערכי נתונים דו-ממדיים גדולים של TrackMate באמצעות MATLAB. הסקריפט שלנו גם מסיר את נקודות הנתונים החוזרות ונשנות של מספרים שלמים המתרחשות לפעמים ביציאות TrackMate לאחר שתא במעקב חוצה את אתר ההדמיה, ומאפשר הכללה של תאים בעלי תנועתיות ו/או כיווניות גבוהה בניתוח ללא הכללת נקודות נתונים מזויפות אלה. אנו מספקים גם סקריפט לארגון מחדש של תמונות שנאספו ב-ImageXpress Micro XL לערימות TIFF שניתן לנתח בכמויות גדולות באמצעות TrackMate.

בפרוטוקול זה, התאים נזרעים בצלחת הדמיה של 96 בארות. לאחר שנתנו מספיק זמן לתאים להיצמד לתחתית הצלחת, אנו מטפלים בהם בכתם גרעיני של הוכסט ובכל מולקולה קטנה שהשפעתן על התנועתיות מעניינת. אנו אוספים תמונות של גרעיני התא במהלך חמש שעות או יותר, ולאחר מכן רצפי התמונות מעובדים לערימות TIFF מופחתות ברקע באמצעות MATLAB. ערימות TIFF אלה מנותחות באמצעות התוסף ImageJ TrackMate, שרושם ועוקב אחר כל תא בודד על פני נקודות זמן17. לאחר שיצרנו מסלולי תאים עבור כל אתרי ההדמיה, אנו משתמשים בסקריפט MATLAB מותאם אישית כדי להסיר נקודות נתונים מזויפות המתרחשות לאחר שהתאים עוזבים את שדה ההדמיה ולחשב את שיעורי התנועתיות הממוצעים עבור כל אתר הדמיה. קובץ ה- Script מנתח רק תאים הנמצאים במעקב עבור מספר מינימלי של נקודות זמן שצוין על-ידי המשתמש ומאפשר למשתמש לסנן תאים לפי המרחק הכולל ו/או הכיוון שעבר. התוצאה היא התזוזה הממוצעת, כיוון התנועה הממוצע, התזוזה הכוללת וכיוון התנועה הכולל של כל תא, המשמשים לחישוב הממוצעים הגדולים של ערכים אלה עבור כל התאים באתר הדמיה. פרוטוקול זה יכול להתבצע בכמויות גדולות בניסויי הדמיה גדולים, מה שמתאים לניתוח תנועתיות תפוקה גבוהה יחסית (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית תאים והכנת לוחות הדמיה

  1. תרבית תאי HaCaT במדיום תרבית תאים (Dulbecco's Modified Eagle's Medium בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, ו-10% (v/v) סרום בקר עוברי) ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח.
  2. זרע את מספר התאים הרצוי לבאר (אנו משתמשים ב-5000 - 20,000 תאים לבאר) בלוחית הדמיה של 96 בארות, כגון מיקרו-פלטת פוליסטירן שחורה עם 96 בארות. לשלוש בארות מוסיפים רק בינוני (ללא תאים).
  3. הנח את הצלחת על משטח שטוח לחלוטין למשך 20 - 30 דקות כך שתאים יוכלו להיצמד לתחתית הצלחת בחלוקה מרחבית אחידה.
  4. העבירו את הצלחת לחממת תרבית תאים לחה (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני) למשך 4-6 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לחלוטין לתחתית הצלחת.
  5. מוציאים את המדיום מהצלחת ומחליפים במדיום תרבית תאים בצבע Hoechst של 2 מיקרוגרם/מ"ל (דילול של 1:5000 של תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל).
  6. החזר את הצלחת לחממת תרבית תאים לחה (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני) למשך שעתיים.
  7. שטפו בעדינות את הצלחת שלוש פעמים עם 100 מיקרוליטר של מי מלח עם פוספט לכל באר לפני הוספת 90 מיקרוליטר של מדיום הדמיה (פנול נטול אדום Dulbecco's Modified Eagle's Medium בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין, ו-10% (v/v) סרום בקר עוברי) לכל באר.
  8. אם מודדים את ההשפעות של מעכבי מולקולות קטנות או אפקטורים אחרים, יש לטפל בתאים מיד לפני ההדמיה.

2. הדמיה

  1. צלם את הלוח (כולל בארות מדיה בלבד) בהגדלה של פי 10 במיקרוסקופ עם תא סביבתי לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
    הערה: תסריטי הניתוח בפרוטוקול זה נכתבים עבור נתונים שנאספו במיקרוסקופ ImageXpress Micro XL רחב של התקנים מולקולריים.
  2. אסוף תמונות בהתאם לרזולוציה הזמנית שהניסוי דורש. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, רשום לפחות 4 נקודות זמן לשעה למשך 5 שעות לפחות. אם מודדים את ההשפעות של מעכבי מולקולות קטנות או הפרעות אחרות על התאים, יש לצלם לפחות 5 שעות לאחר הזמן הצפוי לראות השפעה. לענייננו, אנו מצלמים עבור 100 נקודות זמן של 8 דקות לזמן הדמיה כולל של 13 שעות ו-20 דקות.

3. עיבוד תמונה

  1. השתמש בסקריפט MATLAB המותאם אישית שסופק "ImageReorganizer.m" כדי להסיר תמונות ממוזערות ולארגן מחדש את קבצי התמונה לפי באר ולא לפי נקודת זמן. ה-ImageXpress מוציא קבצים בארגון תיקיות זה: "[שם ניסוי] > [YYYY-MM-DD] > [מספר הפעלה] > Timepoint_[נקודת זמן] > [קבצי תמונה]." לאחר שהתמונות אורגנו מחדש, סקריפט זה מבצע חיסור רקע על תמונות מכל נקודת זמן באמצעות התמונות המטושטשות הממוצעות והגאוסיות של בארות המדיה בלבד מאותה נקודת זמן. לאחר מכן, סקריפט זה מארגן את התמונות שהוחסרו ברקע במחסנית TIFF עבור כל אתר הדמיה. כל מחסנית TIFF נקראת "[Well]_[Site].tif".
    1. אם הניסוי נמשך יותר מיום אחד, שלב את התוכן של תיקיות [מספר הפעלה] עבור כל הימים כך שכל תיקיות המשנה "Timepoint_[נקודת זמן]" יהיו באותה תיקיית "[מספר הפעלה]".
    2. שים לב שקובץ Script זה דורש את הפונקציה MATLAB int2strz18. הזן את הנתיב המקומי לפונקציה זו לאחר "addpath" בשורה 2.
    3. הזן את השורות עבור בארות מדיה בלבד כ"ריקות" בשורה 9 ואת העמודות כ"עמודות ריקות" בשורה 10.
    4. הזן את השורות עבור בארות ניסוי כ"שורות" בשורה 15 ואת העמודות כ"עמודות" בשורה 16. הזן את מספר אתרי ההדמיה לכל באר כמו "אתרים" בשורה 17.
    5. הזן את שם הנתיב עבור התיקיה "[מספר הפעלה]" בסרגל הנתיב ב-MATLAB והפעל את הסקריפט.

4. מעקב אחר תאים

הערה: ניתן להריץ את TrackMate בכל ערימות ה-TIFF בספרייה ייעודית באמצעות גרסה שונה מעט של סקריפט Run_TrackMate_Headless.groovy מ-Tinevez et al.17 או שניתן לבצע אותו באופן ידני עבור כל מחסנית TIFF בודדת. אנו מריצים את פיג'י באופן ידני על כמה ערימות TIFF לדוגמה כדי להבטיח שאנו משתמשים בפרמטרים הנכונים לפני הרצת סקריפט Groovy בכל ערימות ה-TIFF באמצעות פרמטרים אלה.

  1. כדי להפעיל את התוסף TrackMate בפיג'י עבור כל ערימות ה-TIFF בתיקיה, הורד והשתמש בסקריפט Run_TrackMate_Headless.groovy מ-Tinevez et al.17 בהתאם לפרוטוקול שסופק. אנו משתמשים בגרסה מעט שונה של סקריפט זה, המאפשרת לנו לאצוץ בקלות הן את קבצי הקלט והן את שמות קבצי הפלט ולהזין את כל הפרמטרים באמצעות ממשק משתמש גרפי אחד לקלט. להלן הוראות מפורטות לשימוש בסקריפט שהשתנה זה, המסופק כאן כ-TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    1. פתח את קובץ ה- Script ב- FIJI על >ידי בחירה באפשרות קובץפתח ולאחר מכן ניווט למיקום של קובץ ה- Script TrackMate_Headless_Mod.groovy.
    2. בחר הפעל.
    3. הזן את הספרייה שבה ממוקמות ערימות ה-TIFF (פלט ברירת המחדל מ-"StackGenerator.m" צריך להיות "[שם ניסוי] > [YYYY-MM-DD] >> ערימות") כ-"ספריית קלט".
    4. צור ספריית פלט והזן את שם הנתיב שלה כ"ספריית פלט". ברירת המחדל עבור "סיומת הקובץ צריכה להיות ".tif;" אם לא, הזן ".tif" כ"סיומת קובץ".
    5. כדי להפעיל את TrackMate רק על תת-קבוצה של קבצים בספריה, השתמש במרחב הקלט אחרי "שם הקובץ מכיל" כדי לכלול אותם. אחרת, השאר את השטח הזה ריק.
    6. בחר "שמור על מבנה הספרייה בעת השמירה".
    7. הזן "רדיוס נקודה", "סף איכות", "מרווח מסגרת מקסימלי", "קישור מרחק מקסימלי" ו"מרחק מקסימלי של סגירת פערים" בפיקסלים בהתאם להגדרות הרצויות. אנו משתמשים בדרך כלל ב-3.5, 18, 2, 15 ו-40, בהתאמה, עבור גרעיני HaCaT בהגדלה של פי 10.
    8. בחר בסדר. קובץ Script זה אמור להפיק פלט של קובץ XML עבור כל מחסנית TIFF בספריית הפלט המיועדת.
  2. לחלופין, הפעל את התוסף TrackMate ב-FIJI באופן ידני עבור כל מחסנית TIFF בהתאם לפרוטוקול המתואר ב-Tinevez et al.13
    1. פתח ערימת TIFF בפיג'י ופתח את התוסף TrackMate על ידי בחירת תוספים >מעקב > TrackMate בשורת התפריטים.
    2. אם חלון מוקפץ מציג את ההנחיה "נראה שלתמונה זו יש נקודת זמן אחת אבל [מספר נקודות זמן] פרוסות. האם ברצונך להחליף Z ו- T?" בחר כן.
    3. ב-TrackMate v4.0.1, השתמש בהגדרות ברירת המחדל למעט "קוטר כתם משוער" (אנו משתמשים ב-7.000 פיקסלים עבור גרעיני HaCaT בהגדלה של פי 10) וסף (אנו משתמשים ב-18.000, אך זה ישתנה בהתאם למיקרוסקופ בו נעשה שימוש ועוצמת צבע Hoechst).
    4. השתמש בפונקציית התצוגה המקדימה כדי להבטיח זיהוי חלקיקים אופטימלי ולהתאים את הגדרות קוטר הסף והסף לפי הצורך.
    5. עבור "מרחק מקסימלי של סגירת פערים", הגדרות ברירת המחדל פועלות לעתים קרובות עבור תנועתיות HaCaT בזאלית, אך ייתכן שיהיה צורך להגדיל את המרחק המקסימלי לסגירת פערים עד 40.0 פיקסלים בתנאים המשפרים את התנועתיות.
    6. ודא באופן חזותי שהמעקב ממוטב עם מרווחים מינימליים בעקבות תאים.
    7. תחת בחר פעולה [כך במקור], בחר ייצוא רצועות לקובץ XML ובצע.
    8. חזור על הפעולה עבור כל ערימות ה-TIFF.

5. כימות שיעורי התנועתיות

הערה: השתמש בסקריפט המותאם אישית של MATLAB "TrackMateAnalysis.m" שסופק כדי להסיר עקבות שנכשלו ולכמת את התנועתיות עבור כל קבצי הפלט של TrackMate. קובץ ה- Script מסיר רצועות שזזות מחוץ למסגרת (שמיקומן עוקב כברירת מחדל אחר מספרים שלמים) ורצועות שנמצאות במעקב במשך פחות ממספר מוגדר של נקודות זמן. קובץ ה- Script מסיר רצועות שזזות מחוץ למסגרת (שמיקומן עוקב כברירת מחדל למספרים שלמים) ורצועות שנמצאות במעקב במשך פחות ממספר נקודות זמן שניתן לעצב. הפלט הוא תזוזה ממוצעת לנקודת זמן עבור תאים בודדים וכל התאים באתר הדמיה. (פלט לדוגמה: 'Output.mat')

  1. שים לב שקובץ Script זה דורש את פונקציית MATLAB המסופקת "import_trackmate_xml.m." הזן את הנתיב המקומי לפונקציה זו לאחר "addpath" בשורה 4.
  2. בשורה 7, ציין את המספר המינימלי של נקודות זמן שיש לעקוב אחר חלקיק כדי להיכלל בתפוקה המאוחדת שלך.
  3. בקווים 12 ו-13, ציין את טווח המרחקים שנסעו (בפיקסלים) שיש לכלול בניתוח המסונן. כדי לכלול את כל המרחקים האפשריים שעברת, הזן טווח מ-0 לרוחב שדה ההדמיה.
  4. בשורות 14 ו-15, ציין את טווח המסלולים (במעלות) שיש לכלול בניתוח המסונן. כדי לכלול את כל המסלולים האפשריים, הזן טווח בין 0 ל-360.
  5. הפעל את קובץ ה- Script בתיקיה המכילה את כל קבצי ה- XML של הפלט של TrackMate.
    הערה: קובץ ה- Script יוצר ושומר מבנה תא MATLAB המכיל את כל הנתונים שנוצרו בניתוח זה. Tables{1,:} מפרט את השמות של קבצי XML של פלט Trackmate עבור כל אתר הדמיה שנותח על-ידי קובץ Script זה. טבלאות{2,:} הוא מבנה משנה המכיל את המיקומים (פיקסלים), תזוזות (פיקסלים) וזוויות התנועה (מעלות, כאשר 0° מציין כיוון תנועה ימינה בתוך אתר ההדמיה) עבור כל התאים הבודדים בכל נקודת זמן. הוא מכיל גם את המרחק הכולל שנסע (פיקסלים), תנועתיות ממוצעת (פיקסלים/נקודת זמן), זווית התנועה הממוצעת (מעלות) עבור כל תא בכל נקודות הזמן, כמו גם את זווית הנסיעה הכוללת בין נקודת הזמן הראשונה והאחרונה עבור כל תא. השורותהשלישית והרביעית של הטבלאות בהתאמה מכילות את ערכי התנועתיות הממוצעים וסטיית התקן (פיקסלים/נקודת זמן) עבור כל התאים בכל נקודות הזמן בכל אתר הדמיה. השורות 5ו-6 בהתאמה מכילות את ערכי הממוצע וסטיית התקן עבור המרחק הכולל (פיקסלים) של כל התאים בכל נקודות הזמן בכל אתר הדמיה. השורות 7 ו-8 מכילות את ערכי הממוצע וסטיית התקן עבור זווית התנועה הכוללת (מעלות) בין נקודת הזמן הראשונה והאחרונה עבור כל התאים באתר הדמיה. בעוד ששורות 3-8 של טבלאות מכילות ערכים אלה עבור כל התאים העומדים בקריטריונים המינימליים למעקב אחר נקודות זמן, שורות 9-14 מכילות את אותם ערכים אך רק עבור תאים העומדים בקריטריוני הסינון שצוינו על-ידי המשתמש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להבטיח שתסריט הניתוח שלנו אמין ועקבי, מדדנו את התנועתיות של קרטינוציטים HaCaT בשלושה ניסויים בלתי תלויים. מצאנו שבעוד שסטיית התקן של תנועתיות התאים הייתה משתנה בין ניסויים (אולי בשל הרגישות של תאי HaCaT למפגש ולגירויים מכניים), התנועתיות הממוצעת שוכפלה באופן עקבי על פני מספר ניסויים ללא הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שכפולים על פי מבחן t של סטודנט דו-זנבי (איור 2).

בגלל תפקידו של קומפלקס Arp2/3 בתיווך דינמיקת אקטין, ההשפעה המעכבת הידועה של α-catenin על Arp2/3, וה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המתודולוגיה וכלי הניתוח שתוארו לעיל מספקים אמצעי פשוט וניתן להרחבה למדידה וכימות התנועתיות של קרטינוציטים HaCaT המשתמשים ב-MATLAB ודורשים ניסיון מינימלי בתכנות. פרוטוקול זה קורא לצבוע ולדמות את גרעיני התאים במהלך 5 שעות לפחות. בעוד שניתן לבצע איסוף נתונים על כל מיקרוסקופ מתאים, פרוטוקול זה מספק סקריפט לעיבוד תמונות שנאספו במיקרוסקופ ImageXpress Micro XL לערימת TIFF עבור כל אתר הדמיה המציג חלוף זמן של מיקומי גרעיני התא בכל נקודות הזמן. לאחר עיבוד ערימות TIFF אלה באמצעות התוסף TrackMate עב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ל-X.L. ולאוניברסיטת קולורדו בולדר יש אינטרס כלכלי בפיתוח מעכבי HDAC לטיפולים והון עצמי ב-OnKure. X.L. הוא מייסד שותף וחבר במועצת המנהלים של OnKure, שקיבלה רישיון למעכבי HDAC קנייניים מאוניברסיטת קולורדו בולדר. ל-OnKure אין מעורבות בתכנון הניסוי או במימון של מחקר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לדניאל מסנג'ר, לואיס בייקר, דאגלס צ'פניק, אדריאן רמירז, קוונבין שו וחברים אחרים במעבדות ליו ובורץ על התובנות והעצות שלהם. אנו מודים לג'יאן טאי על שיתוף המומחיות שלו ב-MATLAB ועל כתיבת הפונקציה לייבוא XML. אנו מודים לג'וזף דרגבון מ-BioFrontiers Advanced Light Microscopy Core על תמיכתו במיקרוסקופיה ובהדמיה. אנו מודים לתרזה נהרייני ולניקול קתלי ממתקן הליבה לתרבית תאים על תמיכתם בתרבית תאים. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לסרטן והמכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות (R01AR068254) ל-X.L. והמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) R01GM126559 ל-D.B. ו-X.L., G.E.W. ו-E.N.B. נתמכו על ידי מענק הכשרה קדם-דוקטורט מ-NIGMS (T32GM08759). ה- ImageXpress Micro XL נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר (S10 RR026680). FACSAria נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (S10OD021601).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 בארות שטוחות שקופות פוליסטירין שחור מטופלות TC, עטופות בנפרד, עם מכסה, סטריליותקורנינג3603
מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (גלוקוז גבוה D)Life Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific12800-082
סרום בקר עובריSigma-Aldrich IncF0926
פלואורובריט מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (D-גלוקוז גבוה, 3.7 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט, ללא L-גלוטמין, ללא פנול אדום)Gibco/Thermo Fisher ScientificA18967-01
GlutaminePlusR& די סיסטמס בע"מR90210
Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראטInvitrogen/Thermo Fisher ScientificH21492
פניצילין סטרפטומיציןLife Technologies Corporation/Thermo Fisher Scientific15140-122
פוספט חוצץמלח Gibco/Thermo Fisher Scientific14190-144

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, L., He, Y., Zhao, M., Jiang, J. Collective cell migration: Implications for wound healing and cancer invasion. Burns & Trauma. 1 (1), 21-26 (2015).
  2. Stuelten, C. H., Parent, C. A., Montell, D. J. Cell motility in cancer invasion and metastasis: insights from simple model organisms. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 296-312 (2018).
  3. Campbell, K., et al. Collective cell migration and metastases induced by an epithelial-to-mesenchymal transition in Drosophilaintestinal tumors. Nature Communications. 10 (1), 1-10 (2019).
  4. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling networks that regulate cell migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  5. Parri, M., Chiarugi, P. Rac and Rho GTPases in cancer cell motility control. Cell Communication and Signaling. 8 (1), 23(2010).
  6. Sumida, G. M., Yamada, S. Rho GTPases and the downstream effectors actin- related protein 2/3 (Arp2/3) complex and myosin II induce membrane fusion at self-contacts. The Journal of Biological Chemistry. 290 (6), 3238-3247 (2015).
  7. Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell., 4th edition. , (2002).
  8. Bunker, E. N., Wheeler, G. E., Chapnick, D. A., Liu, X. Suppression of α-catenin and adherens junctions enhances epithelial cell proliferation and motility via TACE- mediated TGF-α autocrine/paracrine signaling. Molecular Biology of the Cell. 32 (4), 348-361 (2021).
  9. Niessen, C. M. Tight junctions/adherens junctions: basic structure and function. Journal of Investigative Dermatology. 127 (11), 2525-2532 (2007).
  10. Drees, F., Pokutta, S., Yamada, S., Nelson, W. J., Weis, W. I. α-Catenin is a molecular switch that binds E-cadherin-β-catenin and regulates actin-filament assembly. Cell. 123 (5), 903-915 (2005).
  11. Yamada, S., Pokutta, S., Drees, F., Weis, W. I., Nelson, W. J. Deconstructing the cadherin-catenin-actin complex. Cell. 123 (5), 889-901 (2005).
  12. Rangarajan, E., Izard, T. The cytoskeletal protein α-catenin unfurls upon binding to vinculin. The Journal of Biological Chemistry. 287 (22), 18492-18499 (2012).
  13. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO dots assembly: single-particle tracking and analysis. Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-97 (2020).
  14. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  15. Wu, P. -H., Giri, A., Wirtz, D. Statistical analysis of cell migration in 3D using the anisotropic persistent random walk model. Nature Protocols. 10, 517-527 (2015).
  16. Chapnick, D. A., Jacobsen, J., Liu, X. The development of a novel high throughput computational tool for studying individual and collective cellular migration. PloSOne. 8 (12), 82444(2013).
  17. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: an open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  18. Vargas Aguilera, C. A. int2strz.m. MATLAB Commons. , (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

TrackMateHaCaTMATLABAdherens Junctions
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים